具有广谱抗肿瘤活性的二氢杨梅素及其衍生物和应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体地涉及一种具有广谱抗肿瘤作用的二氢杨梅素及其衍生物和应用，这种抗肿瘤药物能有效地杀灭和预防各种肿瘤，特别是具有良好的抗骨肉瘤作用。

背景技术：

肿瘤(tumor)是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。肿瘤是一种严重危害人类健康的疾病，它在很多国家引起的死亡率高居第二位，仅次于心血管疾病。通常用于治疗肿瘤的手段有手术、化疗和放疗。目前，这些治疗手段往往存在副作用大的缺点。现有的大多数化疗药物毒性大，对人体健康细胞的损伤也大。同时由于肿瘤细胞耐药性等原因，已有的治疗药物或手段又对某些肿瘤不太有效。因此，急需开发高效的、低毒的、具有广谱抗肿瘤作用的药物，能有效地杀灭和预防各种肿瘤，延长人们的寿命。

二氢杨梅素是一种黄酮类化合物，为葡萄科蛇葡萄属显齿蛇葡萄科藤茶中的主体物质，具有较强的药理活性，如抗氧化、抗炎、抗病毒、神经保护和抗肿瘤等作用，尤其在抗肿瘤方面，二氢杨梅素在体内或体外可抗胃癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌等多种癌症，可作为一种广谱的抗癌剂。但二氢杨梅素自身存在一些不足如溶解性不佳，肠黏膜通透性较低，稳定性差，体内半衰期短等，限制了其开发利用。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服现有技术存在的缺陷，从植物中提取具有广谱抗肿瘤活性的天然化合物，开发高效、低毒、具有广谱抗肿瘤作用的药物，能有效地杀灭和预防各种肿瘤。为了克服二氢杨梅素的缺点，使其早日应用于临床，本发明公开具有广谱抗肿瘤活性的二氢杨梅素及其衍生物，以便能为今后更好的开发利用二氢杨梅素提供一定参考。

本发明研究结果表明，二氢杨梅素及其衍生物不仅能在体外诱导细胞凋亡，而且能在小鼠的肿瘤模型内有效杀灭肿瘤细胞。体外实验结果证明，二氢杨梅素凋亡肿瘤与市场上销售的10-羟基喜树碱相当，毒性小于喜树碱，且在体外十分稳定；与传统化疗药物联合应用后，不但能起到协同体内抑瘤作用，而且能降低传统化疗药物对体重的影响和对机体重要脏器的损伤。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

具有广谱抗肿瘤活性的二氢杨梅素及其衍生物，是从天然产物提取物中分离得到，或其具有同等生物学活性的衍生物；结构式为：

式中r是h或peg，或以下结构式中的任意一种或几种的混合物：

式中n＝0～20。

二氢杨梅素及其衍生物具有同等的生物学活性，通过化学方法合成而得到。二氢杨梅素通过酯化或酰化合成得到的衍生物不仅能改变二氢杨梅素的理化性质，而且能增强二氢杨梅素的生物活性。

该具有广谱抗肿瘤活性的二氢杨梅素及其衍生物，作为广谱抗肿瘤药物为人体用广谱肿瘤治疗药物。

二氢杨梅素及其衍生物为单独或结合其它药物可接受的辅剂形式。

其中的肿瘤包括骨肉瘤、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、口腔癌、食道癌、胆管癌、白血病等。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明提供了一种从植物中提取具有广谱抗肿瘤活性的天然化合物，具有广谱抗肿瘤作用，毒性低，不受多药耐药的影响。

2.本发明公开的二氢杨梅素及其衍生物施用于肿瘤细胞后，其基因表达有明显的变化。经qpcr和westernblot检测，施用二氢杨梅素及其衍生物后，肿瘤细胞的bcl-2无明显变化，xiap、mcl-1和survivin等的表达明显降低，同时parp的表达上升。bcl-2家族与iaps家族是调控细胞凋亡的两个关键成员，并在肿瘤的发生及药物治疗中起着重要作用。此外，抑制凋亡的蛋白survivin和xiap在3种肿瘤细胞中不同程度的下调，及与dna修复相关的蛋白parp的剪切增加。二氢杨梅素及其衍生物的抗骨肉瘤作用与p38mapkandampkα/gsk-3β/sox2信号通路相关，二氢杨梅素及其衍生物通过影响线粒体膜电位诱导hepg2细胞凋亡，这些结果从不同层面证实二氢杨梅素及其衍生物可促进肿瘤细胞凋亡。

3.本发明公开的二氢杨梅素及其衍生物具有广谱抗肿瘤作用，在一定浓度下对肿瘤细胞具有很高的抑制率，与目前的广谱抗癌药10-羟基喜树碱相当，而对于正常细胞有较低毒性，也不受多药耐药的影响。

4.本发明公开的二氢杨梅素及其衍生物具有广谱抗肿瘤作用,可用于制备抗肿瘤药物，所述的肿瘤包括但不限于骨肉瘤、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、口腔癌、食道癌、胆管癌、白血病。

附图说明

图1为不同浓度的二氢杨梅素及其衍生物对hepg2的细胞毒作用(n＝6)；

图2为westernblot检测bcl-2，mcl-1，xiap，survivin和parp的蛋白水平。

具体实施方式

下面具体结合实施例，具体阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于阐述本发明而不用于限制本发明的范围。

1、二氢杨梅素的制备

二氢杨梅素按照“一种从藤茶中提取二氢杨梅素和藤茶多糖的方法”(cn102796069a)，进行提取和制备，提取率达70％、经多次纯化后纯度大于95％。

所述的纯化为活性炭纯化、柱层析纯化、萃取纯化、醇沉纯化、色谱纯化中的一种或几种联合。

2、二氢杨梅素衍生物的制备

通过酯化反应，将纯度为95％以上的二氢杨梅素、酯化剂、催化剂、溶剂在一定温度下反应，制备得到二氢杨梅素的酯化衍生物。

所述的酯化剂为peg-cooh，c1～20的脂肪酸或酸酐或酰氯。

所述的催化剂可以是酸性催化剂如磷酸、硫酸、高氯酸、硼酸等或碱性催化剂如吡啶、碳酸钾、氢氧化钠、二环己基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶、n-羟基硫代琥珀酰亚胺/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺等。

所述的溶剂可以是dmf、1,4-二氧六环、乙醇、吡啶等有机溶剂。

以下以典型实施例加以说明

实施例1聚乙醇修饰的二氢杨梅素的合成

95％以上的二氢杨梅素溶于乙醇中，加入氯代聚乙醇酸、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶，室温下搅拌反应，用tlc监测反应过程。反应完成后抽滤，滤液浓缩，搅拌下将浓缩液倒入过量乙醚中，收集沉淀，用乙醚洗涤，再用丙酮溶解，加适量的水沉淀，抽滤，少量的去离子水洗，真空烘干，得到聚乙醇修饰的二氢杨梅素。

所述的二氢杨梅素、氯代聚乙醇酸、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶的用量比是1：1～5：1～5：1～5。

实施例2乙酸修饰的二氢杨梅素的合成

95％以上的二氢杨梅素溶于乙酸酐中，加入高氯酸，室温下，避光反应，用tlc监测反应过程。反应完成后用丙酮-甲醇重结晶，收集沉淀，用少量乙醇洗，真空烘干，得到聚乙醇修饰的二氢杨梅素。

所述的二氢杨梅素、乙酸酐的用量比是1：1～6，所述的高氯酸为1～3滴。

所述的避光反应是先避光搅拌10～30分钟，再避光静置10～78小时。

实施例3庚酸修饰的二氢杨梅素的合成

95％以上的二氢杨梅素溶于吡啶中，缓慢加入庚酰氯，避光反应，用tlc监测反应过程。反应完成后依次用氨水溶液、水洗，低温减压浓缩，真空烘干，得到庚酸修饰的二氢杨梅素。

所述的二氢杨梅素、庚酰氯的用量比是1：1～6。

所述的避光反应是在80℃～120℃下搅拌10～50小时。

实施例4咖啡酸修饰的二氢杨梅素的合成

95％以上的二氢杨梅素和咖啡酸溶于乙醇中，加入n-羟基硫代琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，室温下搅拌反应，用tlc监测反应过程。反应完成后抽滤，滤液减压浓缩，搅拌下将浓缩液倒入过量乙醚中，收集沉淀，用少量的去离子水洗，真空烘干，得到咖啡酸修饰的二氢杨梅素。

所述的二氢杨梅素、咖啡酸、n-羟基硫代琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的用量比是1：1～5：1～5：1～5。

3、二氢杨梅素抗肿瘤作用的测定

实施例1本发明所述二氢杨梅素的抗人肝癌细胞(hepg2)作用

(1)在96孔细胞培养板内无菌接种人肝癌细胞，每孔接种0.1ml含1×105细胞的完全细胞培养液dmem。

(2)每孔加入0.1ml含不同浓度如上制备的二氢杨梅素完全细胞培养液dmem，与hepg2细胞混合后，将其放入37℃细胞培养箱内(含5％co2)培养48小时。

(3)终止细胞培养，用mtt法测定培养细胞活力。

(4)分析发现二氢杨梅素对上述人肝癌细胞生长具有明显的抑制作用。随着用药浓度的增高hepg2细胞活力降低，呈现出剂量依赖关系，作用48h后，其ic50值为35.27±2.68μg·ml^-1(mean±s,％)，如图1所示。

(5)用流式细胞术分析结果表明：25μm二氢杨梅素能明显的诱导上述人肝癌细胞发生凋亡，其凋亡率达75％。

(6)线粒体膜电位和凝胶电泳结果表明：肿瘤细胞的bcl-2无明显变化，xiap、mcl-1和survivin等的表达明显降低，同时parp的表达上升。

实施例2本发明所述乙酸修饰的二氢杨梅素抗人肝癌细胞耐药株组(r-hepg2)作用

(1)在96孔细胞培养板内无菌接种人肝癌细胞耐药株，每孔接种0.1ml含1×10⁵细胞的完全细胞培养液dmem。

(2)每孔加入0.1ml含不同浓度如上制备的乙酸修饰二氢杨梅素完全细胞培养液dmem，与r-hepg2细胞混合后，将其放入37℃细胞培养箱内(含5％co2)培养48小时。

(3)终止细胞培养，用mtt法测定培养细胞活力。

(4)分析发现乙酸修饰二氢杨梅素对上述人肝癌细胞耐药株生长具有明显的抑制作用，细胞抑制作用的ic50为29.2±0.5μm，而相对应的正常细胞生长无明显抑制作用，相对应的阳性药物组为10-羟基喜树碱，其细胞抑制的ic50没有检测出。

(5)用流式细胞术分析结果表明：25μm乙酸修饰二氢杨梅素能明显的诱导上述人肝癌细胞发生凋亡，其凋亡率达77％。

(6)线粒体膜电位和凝胶电泳结果表明：肿瘤细胞的bcl-2无明显变化，xiap、mcl-1和survivin等的表达明显降低，同时parp的表达上升，如图2所示。

实施例3本发明所述庚酸修饰二氢杨梅素的抗人乳腺癌组(mcf-7)作用

(1)在96孔细胞培养板内无菌接种人乳腺癌细胞，每孔接种0.1ml含1×10⁵细胞的完全细胞培养液dmem。

(2)每孔加入0.1ml含不同浓度如上制备的庚酸修饰二氢杨梅素完全细胞培养液dmem，与mcf-7细胞混合后，将其细胞放入37℃细胞培养箱内(含5％co2)培养48小时。

(3)终止细胞培养，用mtt法测定培养细胞活力。

(4)分析发现二氢杨梅素对上述人乳腺癌细胞生长具有明显的抑制作用，细胞抑制作用的ic50为21.57±0.21μm，而相对应的正常细胞生长无明显抑制作用，相对应的阳性药物组为10-羟基喜树碱，其细胞抑制的ic50为19.12±0.98μm。

(5)用流式细胞术分析结果表明：15.57μm二氢杨梅素能明显的诱导上述人体乳腺癌细胞发生凋亡，其凋亡率达75％。

(6)线粒体膜电位和凝胶电泳结果表明：肿瘤细胞的bcl-2无明显变化，xiap、mcl-1和survivin等的表达明显降低，同时parp的表达上升。

实施例4本发明所述聚乙醇修饰二氢杨梅素的抗人非小细胞肺癌组(a549)作用

(1)在96孔细胞培养板内无菌接种人非小细胞肺癌细胞，每孔接种0.1ml含1×10⁵细胞的完全细胞培养液dmem。

(2)每孔加入0.1ml含不同浓度如上制备的聚乙醇修饰二氢杨梅素完全细胞培养液dmem，与a549细胞混合后，将其放入37℃细胞培养箱内(含5％co2)培养48小时。

(3)终止细胞培养，用mtt法测定培养细胞活力。

(4)分析发现二氢杨梅素对上述人非小细胞肺癌细胞生长具有明显的抑制作用，细胞抑制作用的ic50为34.49±1.07μm，而相对应的正常细胞生长无明显抑制作用，相对应的阳性药物组为10-羟基喜树碱，其细胞抑制的ic50为38.55±2.35μm。

(5)用流式细胞术分析结果表明：24.49μm二氢杨梅素能明显的诱导上述人非小细胞肺癌发生凋亡，其凋亡率达72％。

(6)线粒体膜电位和凝胶电泳结果表明：肿瘤细胞的bcl-2无明显变化，xiap、mcl-1和survivin等的表达明显降低，同时parp的表达上升。

实施例5本发明所述咖啡酸修饰二氢杨梅素的抗人白血病(k562)作用

(1)在96孔细胞培养板内无菌接种人白血病(k562)细胞，每孔接种0.1ml含1×10⁵细胞的完全细胞培养液dmem。

(2)每孔加入0.1ml含不同浓度如上制备的咖啡酸修饰二氢杨梅素完全细胞培养液dmem，与细胞混合后，将其放入37℃细胞培养箱内(含5％co2)培养48小时。

(3)终止细胞培养，用mts法测定培养细胞活力。

(4)分析发现二氢杨梅素对上述人白血病(k562)细胞生长具有明显的抑制作用，细胞抑制作用的ic50为23.19±1.47μm，而相对应的正常细胞生长无明显抑制作用，相对应的阳性药物组为10-羟基喜树碱，其细胞抑制的ic50为29.88±1.23μm。

(5)用流式细胞术分析结果表明：23.19μm二氢杨梅素能明显的诱导上述人白血病(k562)细胞发生凋亡，其凋亡率达73％。

(6)线粒体膜电位和凝胶电泳结果表明：肿瘤细胞的bcl-2无明显变化，xiap、mcl-1和survivin等的表达明显降低，同时parp的表达上升。

实施例6本发明所述对羟基香豆酸修饰二氢杨梅素的正常细胞的毒性研究，选用正常肝细胞(qsg-7701)作用

(1)在96孔细胞培养板内无菌接种人正常肝细胞，每孔接种0.1ml含1×10⁵细胞的完全细胞培养液dmem。

(2)每孔加入0.1ml含不同浓度如上制备的对羟基香豆酸修饰二氢杨梅素完全细胞培养液dmem，与qsg-7701细胞混合后，将其细胞放入37℃细胞培养箱内(含5％co2)培养48小时。

(3)终止细胞培养，用mtt法测定培养细胞活力。

(4)结果发现二氢杨梅素对正常细胞生长无明显凋亡，相对应的阳性药物组为10-羟基喜树碱，其细胞抑制的ic50为6.7±1.55μm。

实施例7本发明所述二氢杨梅素及其衍生物还对骨肉瘤、胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、口腔癌、食道癌、胆管癌细胞株进行了实施例1的筛选，均具有明显的抑制作用。

综上所述，二氢杨梅素对不同的肿瘤细胞均具有明显的抑制作用，且抑制率强于10-羟基喜树碱，并无毒副作用。

实施例8本发明所述的二氢杨梅素及其衍生物的体内抗人白血病细胞作用

(1)取20克左右balb/c裸鼠45只，在每只小鼠右侧腋窝皮下接种1×10⁶人白血病细胞(k562)。

(2)接种一周后，将60只小鼠分成a、b、c两组，每组15只。其中a组每只小鼠腹腔内每天注射50μg如上述制备的二氢杨梅素及其衍生物，b组每只小鼠腹腔内每天注射100μg，如上述制备的二氢杨梅素及其衍生物，c组每只小鼠腹腔内每天注射生理盐水。同时观察肿瘤生长情况和小鼠生长情况。

(3)4周后处死实验小鼠，测量和记录小鼠腋窝肿瘤生长情况和小鼠本身的生长情况。

(4)结果发现：每天腹腔注射二氢杨梅素或其衍生物的a组和b组小鼠其腋窝肿瘤生长明显受到抑制，且呈剂量依赖关系，而未注射二氢杨梅素或其衍生物的c组小鼠其腋窝肿瘤生长良好，如表1所示。

表1空白对照组和经不同剂量二氢杨梅素及其衍生物给药处理后的肿瘤抑制情况

(5)经病理组织切片观察分析结果表明：注射二氢杨梅素或其衍生物实验组瘤组织内很少见到生长活跃的瘤细胞，而对照组瘤细胞生长十分活跃。