二氢杨梅素在制备抗食物过敏药物中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种二氢杨梅素在制备抗食物过敏药物中的应用。

背景技术：

食物过敏是一种常见的过敏性疾病，常常会引起皮肤、消化道和呼吸道等部位的病理反应，严重影响了过敏人群的身心健康。近年来，其发病率呈上升趋势，特别是儿童过敏发病率的上升尤为显著。据统计，引发儿童食物过敏的过敏原主要有牛奶和鸡蛋，其中有1.2％～2％的儿童对鸡蛋过敏。目前，针对食物过敏，大都是通过避免与食物过敏原接触或是使用药物治疗等方法来减少食物过敏的发生。但由于食物普遍存在过敏原，特别是对于幼儿，要想避免极度困难。此外，现有的抗过敏药物常伴有镇静、嗜睡、中枢神经抑制等不良反应。

二氢杨梅素(dihydromyricetin,dmy)是一种黄酮类化合物，除具有黄酮类化合物的一般特性外，还具有解除醇中毒、预防酒精肝、脂肪肝、抑制肝细胞恶化、减轻炎症等作用，具有巨大的药用价值。现有关于二氢杨梅素的研究主要集中在抗氧化、抗炎等生物活性，但对于其是否具有抗食物过敏活性相关研究少见报道。

并且，在一般情况下，酸性或碱性溶液均会对正常细胞或机体产生一定的毒副作用，因此在活性研究时，通常采用中性的磷酸缓冲液溶解稀释二氢杨梅素。但是，二氢杨梅素在ph＝7的中性条件下，其降解速率会急剧上升，半衰期仅剩8.8天(何桂霞，裴刚，李斌，欧阳文.二氢杨梅素的稳定性研究[j].中国新药杂志,2007(22):1888-1890)。因此，为保证二氢杨梅素在中性条件下构型稳定，大多利用包埋技术对其进行包埋。但该方法对技术要求相对较高，同时也增加了加工成本。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提高二氢杨梅素在中性条件下的稳定性，使得二氢杨梅素保持良好的抗食物过敏活性的特点。

在本发明的一个方面中，根据本发明实施例，提供了一种二氢杨梅素在制备抗食物过敏药物中的应用，其以二氢杨梅素作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备抗食物过敏药物，所述二氢杨梅素经碱改性处理。

根据本发明实施例，发明人通过食物致敏原诱导的小鼠过敏模型及体外大鼠嗜碱性粒细胞模型，确定了二氢杨梅素能够缓解小鼠过敏症状，降低血清中特异性ige、组胺和肥大细胞蛋白酶的水平以及能够抑制大鼠嗜碱性粒细胞释放β-氨基己糖苷酶，具有良好的抗食物过敏活性，这为食物过敏治疗提供一种新的有效活性成分。并且还发现二氢杨梅素经碱处理改性后，具有在中性条件下稳定、保持良好的抗食物过敏活性的特点。

根据本发明实施例，所述碱改性处理包括以下步骤：

(1)用氢氧化钠溶液调节超纯水的ph值至11～14，获得碱性水溶液；

(2)将二氢杨梅素置于所述碱性水溶液中，加热至其完全溶解，冷却，冷冻干燥即可。

相较现有的包埋技术，该方法具有简便易操作、成本低廉、产物稳定且能保持良好的抗食物过敏活性的特点。

根据本发明实施例，在步骤(2)中，所述二氢杨梅素的质量浓度为0.5～2.0mg/ml，所述加热温度为90～110℃，加热时间为3～8min。

根据本发明实施例，经碱改性处理后的二氢杨梅素的紫外-可见光谱图的最大吸收峰为320～330nm。

根据本发明实施例，所述抗食物过敏药物中还包括药学上可接受的辅料。

根据本发明实施例，所述抗食物过敏药物的给药剂量为：以二氢杨梅素重量计算，每次0.013～0.130mg/kg人的体重；给药次数为：每日1～2次。

根据本发明实施例，所述抗食物过敏药物的给药剂量为：以二氢杨梅素重量计算，每次0.026mg/kg人的体重。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为二氢杨梅素对卵清蛋白诱导的小鼠过敏反应的过敏评分的影响；

图2为二氢杨梅素对卵清蛋白诱导的小鼠过敏反应的腹泻率的影响；

图3为二氢杨梅素对卵清蛋白诱导的小鼠过敏反应的直肠温度的影响；

图4为二氢杨梅素对卵清蛋白诱导的小鼠过敏反应的血清特异性ige水平的影响；

图5为二氢杨梅素对卵清蛋白诱导的小鼠过敏反应的组胺水平的影响；

图6为二氢杨梅素对卵清蛋白诱导的小鼠过敏反应的肥大细胞蛋白酶水平的影响；

图7为改性前后二氢杨梅素构型的紫外-可见光谱图；

图8为改性前后二氢杨梅素对rbl-2h3细胞脱颗粒影响的变化。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。

本发明提出了一种二氢杨梅素在制备抗食物过敏药物中的应用，其以二氢杨梅素作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备抗食物过敏药物，所述二氢杨梅素经碱改性处理。其中，二氢杨梅素分子中含有6个酚羟基，具有弱酸性，在碱性条件下，二氢杨梅素的构型发生了明显变化，其分子上的酚羟基逐渐解离，同时由于酚羟基逐渐解离，改变了分子上的电子云分布，从而使分子发生了彻底的构型转换，在b环的氧原子处发生解环，生成了a环上的一个羟基，类似于查尔酮结构。使得碱改性后的二氢杨梅素稳定，能保持良好的抗食物过敏活动。

下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。

实施例1二氢杨梅素对卵清蛋白诱导的小鼠过敏反应的影响

为了探究二氢杨梅素对卵清蛋白诱导的小鼠过敏反应的影响，过敏小鼠免疫方法如下：将4-6周龄雌性balb/c小鼠适应喂养一周后，开始试验。将小鼠随机分为pbs阴性对照组、ova过敏组和二氢杨梅素治疗组，每组5只。在第0天和第14天向ova组和二氢杨梅素组腹腔注射ova、明矾佐剂混合液(ova100μg/只，明矾佐剂：pbs＝1:2)，pbs阴性对照组腹腔注射pbs、明矾佐剂混合液(明矾佐剂：pbs＝1:2)。从27天起，每天向二氢杨梅素组灌胃二氢杨梅素(10mg/kg)，第28天起，每三天给ova组、二氢杨梅素组灌胃一次ova(50mg/只)，共5次，直到第40天。

(1)过敏评分测定：每次灌胃ova后1h内，记录小鼠的过敏反应，并对照表1的症状得分细则进行评分，结果如图1所示，与ova过敏组相比，二氢杨梅素能够显著下调小鼠过敏评分。

表1过敏症状评分表

(2)腹泻率测定：每次灌胃ova后1h内，观察记录小鼠干湿粪便的数目，计算每组小鼠的腹泻率，结果如图2速食，与ova过敏组相比，二氢杨梅素能够显著缓解小鼠腹泻症状。

(3)直肠温度测定：第5次灌胃ova后1h内，每隔20min用小鼠肛温计测量一次小鼠的直肠温度，结果如图3，与ova过敏组相比，二氢杨梅素能够显著上调缓解因过敏引起的直肠温度下降的症状。

(4)小鼠血清中特异性ige水平测定：在第5次灌胃ova后一天(第41天)处死小鼠，小鼠眼球血液经4℃，4000rpm离心10min后，收集血清。根据cayman的anti-ova-ige试剂盒说明书操作步骤测定每组小鼠血清中ova特异性ige水平，结果如图4，其中，**表示与卵清蛋白过敏组比较差异极显著，p<0.01；*表示与卵清蛋白过敏组比较差异显著，p<0.05；pbs为阴性对照组，ova为卵清蛋白过敏组，dmy为二氢杨梅素治疗组，与ova过敏组相比，二氢杨梅素能够显著下调小鼠血清中anti-ova-ige的含量。

(5)小鼠血清中组胺水平测定：在第5次灌胃ova后(第40天)1h内对小鼠进行尾静脉采血，获得的血液经4℃，4000rpm离心10min后，收集血清用于检测小鼠组胺水平。根据ibl的histamineelisakit说明书操作步骤测定每组小鼠血清中组胺水平，结果如图5，与ova过敏组相比，二氢杨梅素能够显著下调小鼠血清中组胺的含量。

(6)小鼠血清中肥大细胞蛋白酶水平测定：血清获取方法参照上述(5)步骤，根据欣博盛的小鼠je/mcp-1elisa试剂盒操作步骤测定每组小鼠中肥大细胞蛋白酶水平，结果如图6，与ova过敏组相比，二氢杨梅素能够下调小鼠血清中肥大细胞蛋白酶的含量。

综合，二氢杨梅素是具有良好的抗食物过敏活性，特别是对小鼠血清中组胺含量影响较大。

实施例2二氢杨梅素的改性处理

(1)改性方法：用氢氧化钠溶液调节超纯水的ph值至12，将二氢杨梅素溶解于上述水溶液中(至二氢杨梅素的质量浓度为1mg/ml)，加热至100℃保持5min待其溶解，冷却后经冷冻干燥得到改性二氢杨梅素。将改性二氢杨梅素溶于二甲基亚砜中(质量浓度为50mg/ml)，用ph为7.4的磷酸缓冲液进行稀释至200μg/ml，储存于4℃，以供实验需求。

(2)改性前后二氢杨梅素的紫外-可见光谱图：对浓度为200μg/ml的二氢杨梅素、改性二氢杨梅素进行波长在200～500nm的紫外-可见光谱扫描，结果如图7，二氢杨梅素的最大吸收值在294nm，在324nm处有一个小的肩峰；改性二氢杨梅素最大吸收值在324nm，说明改性后二氢杨梅素已被氧化，有利于其在中性条件下储存。

(3)改性前后二氢杨梅素对rbl-2h3细胞脱颗粒影响的变化：

敏化细胞：胰酶消化回收rbl-2h3细胞，重悬细胞使其浓度达到1×10⁶cells/ml，每孔加200μl加入48孔板中，再加入0.2μg/mlanti-dnp-ige，在5％co2，37℃的培养箱中孵育过夜。

刺激细胞：用磷酸缓冲液洗孔上述48孔板中的细胞3遍，用台式缓冲液溶解二氢杨梅素，使其浓度达到10μg/ml，再加入上述48孔板中，阴性孔加200μl磷酸缓冲液，继续培养1h。

检测β-氨基己糖苷酶活性：用0.5μg/mldnp-bsa刺激rbl-2h3细胞1小时后，回收细胞培养上清，再加200μl台式缓冲液(含0.1％曲拉通)裂解细胞；最后用25μl上清或细胞裂解液分别加入96孔荧光板，每孔加100μl1.2mm4-methylumbellife-ryln-acetyl-b-d-glucosaminide试剂，在37℃下反应30min，用酶标仪获取每孔溶液360nm激发，450nm发射的荧光值。

脱颗粒效率计算公式：脱颗粒效率＝上清的荧光值/(上清的荧光值+细胞裂解液的荧光值)×100％；脱颗粒抑制率计算公式：(阳性孔脱颗粒效率–样品孔脱颗粒效率)/(阳性孔脱颗粒效率–阴性孔脱颗粒效率)×100％。

结果如图8，其中，**表示与阳性对照组比较差异极显著，p<0.01；pbs为阴性对照组，dnp-bsa为阳性对照组，dmy为二氢杨梅素组，m-dmy为改性二氢杨梅素组。与dnp-bsa组相比，二氢杨梅素和改性二氢杨梅素均能显著抑制rbl-2h3细胞释放β-氨基己糖苷酶，二氢杨梅素的脱颗粒抑制率能达到69.58％±6.63％，而改性二氢杨梅素的脱颗粒抑制率可达到59.86％±14.92％。这表明利用上述方法得到的改性二氢杨梅素具有中性条件下稳定、保持良好的抗食物过敏活性的特点。

综上所述，根据本发明的二氢杨梅素在制备抗食物过敏药物中的应用，通过食物致敏原诱导的小鼠过敏模型及体外大鼠嗜碱性粒细胞模型，确定了二氢杨梅素能够缓解小鼠过敏症状，降低血清中特异性ige、组胺和肥大细胞蛋白酶的水平以及能够抑制大鼠嗜碱性粒细胞释放β-氨基己糖苷酶，具有良好的抗食物过敏活性，这为食物过敏治疗提供一种新的有效活性成分。并且还发现二氢杨梅素经碱处理改性后，具有在中性条件下稳定、保持良好的抗食物过敏活性的特点。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。