用于充气微泡的冻干制剂的制作方法

本发明涉及制备用于超声造影成像的充气微泡制剂。
背景技术：
：近年来造影剂的迅速发展产生了许多不同的组合物和制剂，它们可用于人体或动物器官和组织的造影增强成像和治疗中。一类特别适用于造影增强超声成像(“ceus”成像)的造影剂包括在含水介质中分散的纳米和/或微米尺寸气泡的悬浮液。所述气体通常被夹带或包封在膜层中，所述膜层包括例如乳化剂、油、增稠剂或糖。这些稳定的气泡(分散在合适的生理溶液中)在本领域中通常用各种术语称呼，这通常取决于用于其制备的稳定材料,这些术语包括例如“微球”、“微气泡”、“微胶囊”或“微气球”，但在本文中其统称为“充气微泡”(或“微泡”)。超声造影剂(“usca”)按各种制造方法来生产。其中一种方法，例如参见wo94/09829(i),需要在有机溶剂中溶解成膜组分(如磷脂和/或脂肪酸)的混合物和亲水性稳定化合物(如聚乙二醇)；将由此得到的混合物填充到小瓶中经冷冻干燥(冻干)。然后将底部含有固态冻干固体残余物(干饼)的小瓶装满合适的气体(如氟化气体)，最终密封储存。在使用前，通过向小瓶中注入合适的液体(如生理盐水)并摇动小瓶溶解固体残留物，可轻松制备微泡的含水悬浮液。可按上述方法制备的可商购usca有购自bracco的(或美国的)。目前本申请人已观察到，在制备冻干“干饼”中采用的聚乙二醇的性能变化可能对冻干粉末重组获得的充气微泡数产生负面影响。具体地，本申请人观察到，不同批次的商购peg4000(即使来自同一制造商)在聚合物材料中可能具有不同数量的折叠聚合物链。如本申请人所观察到的，如果聚合物材料中所述折叠链的百分比太低，可能会导致太多数量的小瓶无法通过生产批次中的可接受性测试。由于工业规模下一个生产批次可能包含几千个小瓶，此时即使废弃相对少量的小瓶也是非常不可取的。基于以上观察，本申请人确定，用于制备充气微泡的冻干粉末制剂中使用的聚乙二醇应具有高于预定值的折叠聚合物链百分比。技术实现要素：本发明的一方面涉及用于制备充气微泡的冻干粉末组合物，所述组合物包含磷脂和聚乙二醇，其中所述聚乙二醇的折叠聚合物链百分比大于34％，优选大于35％。所述折叠链的百分比优选为至少40％，更优选为至少42％，甚至更优选为至少44％。在一个特别优选的实施方案中，所述折叠链的百分比为至少48％。在一个优选的实施方案中，所述聚乙二醇的平均分子量(或数均分子量，mn)为至少4000g/mol(或道尔顿，da)，更优选为至少4025g/mol和甚至更优选为至少4050g/mol。在另一个优选的实施方案中，所述磷脂为dspc、dppg-na或(优选为)它们的混合物。所述组合物优选还包含脂肪酸，优选为棕榈酸。在本发明的另一方面，本发明涉及包含与生理上可接受气体接触的上述组合物的密封小瓶。所述气体优选为氟化气，更优选为六氟化硫。按照另一方面，本发明涉及通过在气体的存在下将所述冻干粉末组合物分散于生理上可接受液体(优选为0.9％w/v的nacl溶液)而获得的充气微泡悬浮液。按照另一方面，本发明涉及包含磷脂、聚乙二醇和任选的脂肪酸的冻干组合物的制备方法，所述方法包括：在溶剂中溶解所述磷脂、任选的脂肪酸和聚乙二醇；冷冻所述溶液，和通过冻干脱除所述溶剂；其中所述聚乙二醇的折叠聚合物链的百分比为40％或更高。按照另一方面，本发明涉及一种超声成像方法，包括：向患者施用有效量的上述充气微泡的悬浮液；向所述患者的身体部位发送超声信号；从所述身体部位收集回声信号。附图说明图1给出了“光滑”冻干饼(1a)和“粗糙”冻干饼(1b)的实例；图2的图线描述了折叠聚合物链百分比与每生产批次的不合格小瓶数之间的关系；图3给出了聚乙二醇样品第二个加热循环的描述性mdsc温谱图。具体实施方式(或)是储存在隔膜小瓶中的无菌、无热原冻干粉末制剂。所述冻干粉末含有聚乙二醇4000(peg4000，24.56mg)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc，0.19mg)、二棕榈酰磷脂酰甘油钠(dppg-na,0.19mg)和棕榈酸(0.04mg)。每个小瓶的顶部空间用六氟化硫(sf6)填充。用5ml无菌生理盐水重组后，sonovue/lumason成为一种乳白色的均质悬浮液,其中包含填充有六氟化硫的微泡(也称为“微球”或“微气泡”)。按上述专利申请wo94/09829中描述的过程可以制备冻干粉末。通常，该方法需要在合适的溶剂(如二氧杂环乙烷、环己醇、2-甲基-2-丁醇、四氯二氟乙烷或叔丁醇)中以基本对应于其在最终冻干产品中的相应重量比溶解peg4000、磷脂和棕榈酸。例如，所述溶液可以包含22-28重量份的聚乙二醇、0.15-0.25重量份的dspc、0.15-0.25重量份的dppg-na和0.02-0.06重量份的棕榈酸。然后将所得溶液装入玻璃瓶中,所述玻璃瓶被迅速冷冻(例如在-45℃下)和然后送至冻干过程。工业规模下，每个生产批次通常包括几千个小瓶。冷冻干燥步骤结束时，装有冻干残余物(呈固体饼状)的小瓶的上部空间用sf6气体饱和，和小瓶用橡胶塞密封。这样获得的小瓶可保存至少两年。但正如本申请人所观察到的，使用折叠链含量低于预定限度的peg，可能会对生产批次的小瓶中冻干饼的质量产生负面影响。例如，如ginés等人2所述，聚乙二醇(peg)是半结晶的亲水性聚合物，取决于其合成和热历程，其在固态时含有不同比例的非晶态和有序结晶相。在结晶区，聚合物链以延伸链和折叠链两种形式存在，特别是分子量约4000-6000g/mol的peg中。如ginés等人所观察到的，相比于使熔融样品在冰浴中或浸在液氮中淬冷，使相同熔融样品在室温下冷却时，peg4000中的折叠链含量通常更高。如本申请人所观察到的，对于具有相同标称分子量(即4000g/mol)的材料，即使来自同一制造商，制备充气微泡的制剂中用作稳定化合物的peg材料(通常为peg4000)的折叠链含量也可能由于不种工业批次而明显不同。本申请人目前意外地发现，如果使用折叠聚合物链百分比过低的peg，可能会对使用这种peg制造的批次小瓶中包含的冻干饼的质量产生负面影响。具体地，如果peg中折叠聚合物链的百分比低于预定限度，则该批次中不合格小瓶(即冻干饼不符合预定规格的小瓶)数将变得过高。在确定冻干饼质量的各种标准中，一个重要的标准是所述干饼的物理性质。具体地，本申请人已确认干饼的物理性质与该干饼利用生理上可接受液体重组产生的充气微泡悬浮液质量间有相对好的相关性。正如本申请人所观察到的，具有相对光滑表面外观(例如参见图1a)的干饼通常在重组时提供更较多微泡，而那些具有相对粗糙表面外观的干饼(例如参见图1b)在重组时形成明显较少微泡。另外，正如本申请人所观察到的，具有相对光滑表面的干饼形成的微泡悬浮液具有更高的mvc(微泡体积浓度，即每ml悬浮液重组微泡中所含气体总量)。通常，由于上面提到的较低质量，由粗糙干饼重组获得的充气微泡悬浮液在进行ceus成像时不够有效。具体地，正如本申请人所观察到的，当折叠链的百分比为聚合物链总量的34％或更低时，如图2所示，不合格小瓶(装有“粗”干饼)数通常大于16％。本申请人因此确定,为了减少不合格小瓶数，应该采用折叠链百分比大于34％、优选大于35％的peg。为了进一步降低小瓶的不合格率，peg中折叠链百分比优选为聚合物链总量的至少40％。折叠聚合物链百分比更优选应大于42％，和甚至更优选大于44％，48％是特别优选的。虽然原则上折叠链百分比没有上限(通常标称mn为约6000g/mol的peg可以具有至多约100％的折叠链百分比)，但标称mn为约4000(例如至多4600g/mol)的peg通常具有小于80％的折叠链百分比，通常为75％或更低。折叠链百分比优选为约70％或更低、更优选为约65％或更低，和甚至更优选为60％或更低。折叠链百分比的确定聚合物材料中的折叠链百分比可按本领域已知的方法来确定，优选通过差示扫描量热法(dsc)确定。一种优选的方法(也在如下实施例中使用)是例如应用dsc-q2000系统(tainstruments，newcastle，deusa)实施的调制差示扫描量热法(mdsc)。mdsc方法的细节在工作实例中进行了描述。简单地讲，通过施加温度调制幅度(如每30秒0.16℃)在预定的温度范围内(例如20-70℃)以恒定的温速(例如2℃/min)使样品进入加热/冷却/加热循环。在第二个加热循环中，可以表征以折叠形式存在的聚合物材料的分率。事实上，聚乙二醇在第二个加热循环中有分裂为两个峰的固有特征，熔融温度较低的峰对应于具有折叠链的peg的熔融，而熔融温度较高的峰对应于具有未折叠链的peg的熔融。图3表示了peg的典型mdsc温谱图，其中确认了在所述第二个加热循环期间获得的所述第一和第二熔融峰。具体地，图3中的峰a(在约57℃处)对应于具有折叠链的peg的熔融，而峰b(在约61℃处)对应于具有未折叠链的peg的熔融。每个峰的面积对应于具有折叠链或未折叠链的各peg的分率。因此，聚合物折叠链的分数f(折叠)可按下式1确定：式1其中a折叠和a未折叠代表折叠和未折叠peg形式的标准化热流积分(熔融焓，焦耳/克样品)，其按第二次加热循环时peg样品的mdsc温谱图的各个峰下的面积进行计算。因此，聚乙二醇样品中折叠聚合物链的百分比为：f(折叠)x100。正如实验部分所示，虽然聚乙二醇的折叠链百分比与平均分子量之间有一定的相关性(通常，聚合物分子量越大，折叠链百分比也越大)，但这种相关性不一定是线性的。这一发现表明，虽然分子质量在折叠链数量中起作用，但不是唯一的决定因素，因为折叠链的数量还可能受聚合样品的热历史影响(例如包括样品生产/冷却过程的参数、储存条件或老化)。但本申请人已经观察到聚乙二醇的平均分子量(或数均分子量，mn)优选为至少4000g/mol，更优选为至少4025g/mol和甚至更优选为至少4050g/mol。特别优选的是mn为4075或更高(如4100或更高)的聚乙二醇。虽然原则上不存在影响折叠链数量的较高mn值，但聚合物的分子量应与充气微泡最终悬浮液的粘度相容。因此，优选的是mn为6200g/mol或更低，更优选为5000g/mol或更低，甚至更优选为4400g/mol或更低。聚乙二醇的分子量可按常规方法确定，优选通过羟基值滴定(ohv)确定，例如按din53240标准实施。然后由ohv容易地计算peg的平均分子量(或数均分子量，mn)，例如：mn＝112'220/ohv。干饼外观的确定干饼的物理外观检查可通过目测来进行。优选通过应用带有合适照明和镜子系统的半自动检查机(例如seidenaderm10063半自动机器)来实施目测检查。在实践中，用合适的灯光系统从顶部为干饼照明，而干饼底部则通过下面的镜子观察其透明度。操作人员如此检查镜子上显示的干饼外观，和基于如下标准确定小瓶可接受或不合格。通过可接受测试的冻干饼具有基本光滑的外观(“光滑干饼”)，其表面均匀，整个干饼具有多个晶体类结构(参见图1a)。另一方面，在可接受测试中不合格的干饼具有明显粗糙的外观(“粗糙干饼”)，干饼中出现裂缝和/或较大的斑点(参见图1b)。利用这种可接受测试，本申请人已经确定，正如如下实施例中所详细描述的，生产批次中不合格小瓶数与用于制备各批次的聚乙二醇中的折叠链百分比成反比。当用盐水重组进行测试时，光滑干饼通常会在悬浮液中形成更多微气泡，并且微气泡中所含气体的体积更高。在常规ceus过程中可以应用重组悬浮液给患者给药，其中将患者或其身体部位送去超声检查并收集和分析回声信号。如下实施例有助于进一步描述本发明。实施例实施例1由mdsc确定折叠链的百分比a.设备和系统的校准所有的mdsc实验均在配备有tzerotm技术(可直接测量热容)和选项(其允许在传统线性温度缓变上叠加正弦温度波动)的dsc-q2000系统(tainstruments，newcastle，deusa)上实施。使用带有两级制冷系统的冷冻冷却附件(rcs90)，在-90℃至550℃的温度下方便地操作。借助通用分析软件包(universalanalysissoftwarepackage)进行数据采集和处理。应用tzero铝坩埚(ref901683.901)和tzero铝盖(ref901671.901)(两者均由tainstruments获得)来盛装待检测的样品，并通过tzero压力机(ref901600.901)密封坩埚。用金属铟对dsc系统进行包括温度和热流量的校准。实践中，称取约5mg的铟，压平并转送至tzero坩埚中,然后通过tzero压力机用tzero盖密封所述坩埚。校准扫描过程以10℃/min的恒定变温速率在100-180℃之间进行。铟的规格如下：熔融焓和熔融起始温度分别为28.71j/g±0.5j/g和156.6±0.25℃。b.制备样品及mdsc测量按如下过程对四个不同批次的peg4000进行表征。用杵将每种样品的peg4000薄片粉碎，和用微天平xp26(mettlertoledo)在tzero坩埚中称量5mg±0.1mg的样品，然后通过tzero压力机利用tzero盖密封所述坩埚。相比于空样品坩埚，类似地制备相同重量的空tzero坩埚并用作参比。按下表1所概括的，通过在20-70℃的温度范围内以2℃/min的恒定变温速率实施加热/冷却/加热的循环，对每个含peg4000样品的坩埚实施mdsc测量。仅应用加热调制信号(每30秒温度调制周期0.16℃的温度调制幅度)。氮气用作吹扫气体，流率为50ml/min。表1:mdsc加热/冷却/加热循环步骤#描述1在20.00℃下平衡2每30秒调制±0.16℃3等温5.00分钟4以2.00℃/min升温至70.00℃5循环1的结束标记6等温5.00分钟7以2.00℃/min降温至20.00℃8循环2的结束标记9等温5.00分钟10以2.00℃/min升温至70.00℃11循环3的结束标记12过程结束应用universalanalysis软件在mdsc温谱图上确定如下参数：-第一个加热循环的峰值温度和熔融焓；-第一个冷却循环的峰值温度和结晶焓；和-第二个加热循环的峰值温度以及折叠和伸展链的熔融焓。在第二个加热循环中，对以折叠形式存在的聚合物材料的百分比进行表征，并按式1进行计算。对于每批次的peg4000，对三个不同的样品重复该过程。下表2-5给出了测量和结果的细节。表2：第1批次的peg4000的mdsc主要特征(对比例)表3：第2批次的peg4000的mdsc主要特征表4：第3批次的peg4000的mdsc主要特征表5：第4批次的peg4000的mdsc主要特征下表6总结了各peg批次的mdsc测量结果以及供应商提供的它们各自的数均分子量(mn)。表6：peg4000的折叠链％和平均mnpeg4000批次号折叠链％mn(g/mol)批次1(对比例)343997批次2434107批次3494159批次4544154表2-6中报告的结果表明，批次1(仅有34％的折叠聚合物链)不符合本发明的要求，而其它三个批次的peg4000满足这种要求。另外，还可以观察到，批次1的mn小于4000，而所有其它批次的mn均大于4000g/mol，具体为至少4050g/mol。实施例2冻干饼的制备制备冻干饼的过程基本上遵循wo94/09829的实施例中描述的。简单地讲，首先在己烷/乙醇(8/2,v/v)中在约5g/l的浓度下溶解重量比为4.75/4.75/1的dspc、dppg-na和pa，和在真空下蒸发所述溶剂。使残余物与peg4000以约0.017:1的重量比混合，在约60℃下使混合物溶解于叔丁醇中，并将透明的溶液填充入各个din8r小瓶(对应体积包含约25mg的混合物)。然后在-45℃下快速冷却小瓶，再进行最后的冻干步骤。在冻干结束时，在常压下用sf6饱和冻干物的环境条件，并用橡胶塞密封所述小瓶(包含与sf6接触的固体冻干饼)。应用实施例1中表征的四批次peg4000(批次1-4)中的每一个实施上述制备过程，从而获得每批几千个小瓶的四个批次(分别为批次1-4)，每个小瓶在其底部含有干饼形式的25mg冻干固体材料。实施例3小瓶/干饼检查按如下过程检查由实施例2描述的制备方法获得的各个批次，检查是否存在不合格的冻干饼。根据上文所述过程，使用seidenaderm10063半自动机器对每批次的小瓶进行检查，并分类为“可接受小瓶”即含光滑干饼(scv，如图1a所示)或“不合格小瓶”即含粗糙干饼(rcv，如图1b所示)。按上述过程实施的检查结果如下表7所示并记录在图2中。表7：不合格小瓶量与peg4000中折叠链％的关系生产批次不合格小瓶％peg4000中折叠链％批次1(对比例)1634批次28.943批次35.649批次43.754由表7所示结果可以推断，与本发明的使用具有更高折叠链百分比的peg4000制造的其它批次的不合格量相比，生产批次1(其中组合物的peg4000中只有34％的折叠链)中不合格小瓶百分比更高。实施例4重组小瓶的充气微泡悬浮液从每组“可接受小瓶”和“不合格小瓶”(如上文实施例3所定义)中取样6个小瓶，以表征通过重组所述小瓶中包含的干饼获得的微泡。使用带有30μm孔径管的coultercountermultisizer3测量充气微泡悬浮液的各参数如mvc(微泡体积浓度)和悬浮液中的微泡总数。简单地讲，应用100μl的分析体积，在100ml0.9％的nacl溶液中稀释50μl微泡悬浮液。测量结果(每组小瓶的平均值)在下表8中给出。表8：由光滑或粗糙干饼制备的充气微泡的特征小瓶类型mvcμl/ml微泡浓度(份/ml)可接受(光滑干饼)6.44.38x108不合格(粗糙干饼)3.23.87x108由表8所示结果可以推断，由光滑干饼重组获得的微泡显示出在微泡中夹带了更大的气体总体积(具体为两倍)，并且悬浮液中也有更多微泡(具体为0.5x108)。引用的文献1internationalpatentapplicationwo94/09829(braccointernational)2ginesetal.,“thermalcharacterizationofpolyethyleneglycolsappliedinthepharmaceuticaltechnologyusingdifferentscanningcalorimetryandhotstagemicroscopy”,journalofthermalanalysis,vol.46(1996)291-304.当前第1页12