外泌体胞外囊泡及其使用方法与流程

本披露涉及包含经修饰的rna的外泌体。本披露进一步涉及使用本文披露的外泌体的方法和组合物。在某些方面，本文披露的外泌体可用于将经修饰的rna递送至细胞。在某些方面，本文披露的外泌体可用于治疗或预防受试者的障碍。还提供了用于产生所披露的外泌体的方法和组合物。rna是一种用于治疗多种疾病的有前途的治疗分子，这些疾病包括癌症、传染病和遗传性基因病状(pardi等人.(2018)natrevdrugdiscov.[自然评论·药物发现]17(4)：261-79；dunbar等人.(2018)science[科学]359(6372)：eaan4672)。rna疗法通常涉及使用rna干扰(rnai，例如sirna)使病理基因沉默或通过将mrna递送至细胞来表达治疗性蛋白质。为了获得监管机构的批准，用于rna递送的载体应是安全的(即非免疫原性且无毒的)，并能够有效地将治疗性rna转运到受体细胞的胞质中。已知的药物载体，例如脂质纳米颗粒(lnp)有助于将药物靶向性、位点特异性递送至组织和细胞，从而增强其生物利用度。包含可离子化的脂质的lnp代表一种rna递送的平台(semple等人.(2010)natbiotechnol.[自然生物技术]28(2)：172-6；patel等人.(2017)nanolett.[纳米通讯]17(9)：5711-8；rietwyk和peer(2017)acsnano.[美国化学学会纳米]11(8)：7572-86)。然而，开发lnp和其他此类载体的障碍是与它们的配制品的组分相关的潜在免疫原性反应。尽管努力最小化与lnp相关的免疫原性反应，例如添加聚乙二醇屏以避免被单核吞噬细胞系统识别，但lnp仍可引起免疫反应(kumar等人.(2014)molthernucleicacids[分子治疗核酸]3(e210))。例如，某些lnp配制品已显示出对受体细胞的部分毒性，并在宿主中引起不良的免疫反应(barros和gollob(2012)advdrugdelivrev.[高级药物递送综述]64(15)：1730-7；kulkarni等人.(2017)nanomedicine[纳米医学]13(4)：1377-87)。lnp的免疫刺激作用继而阻断其用于安全有效地递送治疗性rna的用途。因此，需要开发可以有效地将rna递送至靶组织和细胞而不触发免疫反应的替代性载体。胞外囊泡(ev)是几乎每种细胞类型都分泌的一类异质的纳米级和微米级囊泡(raposo等人.(1996)jexpmed.[实验医学杂志]183(3)：1161-72；zitvogel等人.(1998)natmed.[自然·医学]4(5)：594-600；nawaz等人.(2016)stemcellsint.[干细胞国际]2016：1073140)。可以在大多数生物体液以及培养的细胞的上清液中检测到ev(akers等人.(2015)jneurooncol.[神经肿瘤学杂志]123(2)：205-16；等人.(2011)jtranslmed.[转化医学杂志]9：9；th6ry等人.(2006)currprotoccellbiol.chapter3：unit3.22[细胞生物学实验室指南，第3章，3.22单元])。在ev生物发生中，ev可获取诸如脂质和蛋白质的胞质组分的库以及编码和非编码rna(keerthikumar等人.(2016)jmolbiol.[分子生物学杂志]428(4)：688-92；kalra等人.(2012)plosbiol.[科学公共文库生物学]10(12)：e1001450；fatima等人.(2017)noncodingrna[非编码rna]3(1)：10)。细胞还可以通过将信息包装到ev中来相互发送rna信息(valadi等人.(2007)natcellbiol.[自然细胞生物学]9(6)：654-9)。因此，ev可以充当细胞间核酸转移的内源性载体。最广泛描述的ev是外泌体，其起源于内体并通过胞吐途径分泌。外泌体是几乎所有类型的细胞都分泌的、且稳定存在于几乎所有类型的体液中的纳米级ev(ibrahim和marbán(2016)annurevphysiol.[生理学年度综述]78：67-83)。外泌体可以传输多种信号传导分子，包括核酸(例如，mrna和微小rna)、功能性蛋白质和脂质(valadi等人.(2007)natcellbiol.[自然细胞生物学]9(6)：654-9；li等人.(2016)natcommun.[自然通讯]7∶10872；liu等人.(2015)cellmetab.[细胞代谢]22(4)：606-18)。由于外泌体的小尺寸，它们也可以逃脱单核吞噬细胞的快速吞噬作用，稳定地循环运送和递送药物，并穿过血管内皮到达靶细胞(vandenboorn等人.(2011)natbiotechnol.[自然生物技术]29(4)：325-6)。另外，外泌体能够穿过严格的生物屏障，例如血脑屏障和胎盘屏障(alvarez-erviti等人.(2011)natbiotechnol.[自然生物技术]29(4)：341-5；holder等人.(2016)traffic[交通]17(2)：168-78；shi等人.(2017)biochembiophysrescommun.[生化与生物物理研究通讯]483(1)：602-8)。所有这些特征使外泌体成为rna递送的有希望的载体。已经描述了几种用于治疗用途的基于外泌体的递送系统，例如lin等人((2018)advsci.[先进科学](weinh)5(4)：1700611)报道的外泌体-脂质体杂化纳米颗粒。但是，迄今为止，这些系统均未开发为解决了可由具体rna递送配制品引起的毒性作用。因此，仍然需要最小化副作用并避免对细胞和组织的过度毒性的有效的rna递送系统。在多个实施例中，本披露部分提供了用于递送治疗性rna的外泌体(ev)。在多个实施例中，本文描述的外泌体能够将包含高分子量mrna在内的外源rna递送至靶细胞和组织。在多个实施例中，本文描述的外泌体能够在体外或体内转运期间保护外源rna，并将该rna递送至受体细胞的胞质。在多个实施例中，所递送的rna是功能性的并且可以被翻译以产生治疗性蛋白质。在多个实施例中，与用替代性递送载体(例如，lnp)观察到的免疫和/或炎症反应相比，本文描述的外泌体可以是非免疫原性的，或可以引起降低的免疫和/或炎症反应。在多个实施例中，本文描述的外泌体具有的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比为约1∶1或小于约1∶1，例如约0.1∶1、约0.2∶1、约0.3∶1、约0.4∶1、约0.5∶1、约0.6∶1、约0.7∶1、约0.8∶1、或约0.9∶1。在多个实施例中，与具有大于约1∶1的可离子化的脂质：经修饰的rna核苷酸的摩尔比的外泌体的替代性递送载体(例如，lnp)相比，具有约1∶1或小于约1∶1的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比的外泌体在宿主细胞和组织中可以是无毒的或毒性较小的。在多个实施例中，外泌体和替代性递送载体包含相同的可离子化的脂质(例如，dlin-mc3-dma或dlin-dma)和相同的经修饰的rna，但是包含不同的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比。在多个实施例中，本披露提供了一种分离的外泌体，其包含通过以下方法制备的经修饰的rna，该方法包括：(a)提供一种或多种包含该经修饰的rna的脂质纳米颗粒(lnp)；(b)在允许细胞摄取lnp的条件下使一个或多个细胞与该lnp接触；以及(c)分离由该一个或多个细胞产生的外泌体，其中至少一个分离的外泌体包含该经修饰的rna。在一些实施例中，lnp包含至少一种可离子化的脂质、磷脂、结构脂质和/或peg脂质。在一些实施例中，lnp包含的至少一种可离子化的脂质是dlin-mc3-dma和/或dlin-dma。在一些实施例中，lnp包含的至少一种可离子化的脂质是dlin-mc3-dma。在一些其他实施例中，lnp包含的至少一种可离子化的脂质是dlin-dma。在一些实施例中，lnp包含的至少一种磷脂是dspc。在一些实施例中，lnp包含的至少一种结构脂质是胆固醇。在一些实施例中，lnp包含的至少一种peg脂质是peg-dmpe。在一些实施例中，peg的分子量可以为约2,000da(peg2000)。在一些实施例中，lnp包含的至少一种peg脂质是peg2000-dmpe。在一些实施例中，lnp包含为dlin-mc3-dma或dlin-dma的可离子化的脂质、为dspc的磷脂、为胆固醇的结构脂质、和/或为peg-dmpe或peg2000-dmpe的peg脂质。在一些实施例中，lnp包含为dlin-mc3-dma的可离子化的脂质、为dspc的磷脂、为胆固醇的结构脂质、和为peg-dmpe或peg2000-dmpe的peg脂质。在一些实施例中，lnp包含为dlin-dma的可离子化的脂质、为dspc的磷脂、为胆固醇的结构脂质、和为peg-dmpe或peg2000-dmpe的peg脂质。在一些实施例中，lnp包含的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比为约2∶1至约4∶1、或约4∶1、约3∶1或约2∶1。在一些实施例中，lnp包含的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比为约3∶1。在一些实施例中，通过使一个或多个细胞与lnp接触而产生的外泌体包含至少一种可离子化的脂质、磷脂、结构脂质和/或peg脂质。在一些实施例中，外泌体包含的至少一种可离子化的脂质、磷脂、结构脂质和/或peg脂质源自lnp。在一些实施例中，外泌体包含的至少一种可离子化的脂质是dlin-mc3-dma和/或dlin-dma。在一些实施例中，外泌体包含的至少一种可离子化的脂质是dlin-mc3-dma。在一些实施例中，外泌体包含的至少一种可离子化的脂质是dlin-dma。在一些实施例中，外泌体包含的至少一种磷脂是dspc。在一些实施例中，外泌体包含的至少一种结构脂质是胆固醇。在一些实施例中，外泌体包含为dlin-mc3-dma或dlin-dma的可离子化的脂质、为dspc的磷脂、和/或为胆固醇的结构脂质。在一些实施例中，外泌体包含为dlin-mc3-dma的可离子化的脂质、为dspc的磷脂、和为胆固醇的结构脂质。在一些其他实施例中，外泌体包含为dlin-dma的可离子化的脂质、为dspc的磷脂、和为胆固醇的结构脂质。在一些实施例中，外泌体包含的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比为约1∶1至约3∶1、或约3∶1、约2∶1、约1∶1或小于约1∶1。在一些实施例中，外泌体包含的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比为约1∶1或小于约1∶1，例如约0.1∶1、约0.2∶1、约0.3∶1、约0.4∶1、约0.5∶1、约0.6∶1、约0.7∶1、约0.8∶1、或约0.9∶1。在一些实施例中，外泌体包含的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比小于lnp包含的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比。在一些实施例中，外泌体包含的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比为约1∶1或小于约1∶1，并且lnp包含的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比为约3∶1。在一些实施例中，外泌体的直径为约30nm至约300nm。在一些实施例中，外泌体的直径为约40nm至约150nm。在一些实施例中，外泌体的直径为约40nm至约120nm。在一些实施例中，用于与lnp接触并产生外泌体的细胞获自受试者。在一些实施例中，细胞是上皮细胞、免疫细胞、祖细胞或干细胞。在一些实施例中，细胞是b淋巴细胞、t淋巴细胞或单核细胞。在一些实施例中，经修饰的rna编码目的多肽。在一些实施例中，经修饰的rna编码有效治疗障碍的多肽。在一些实施例中，经修饰的rna编码促红细胞生成素多肽。在一些实施例中，经修饰的rna编码人促红细胞生成素多肽。在一些实施例中，经修饰的rna编码具有seqidno：1的促红细胞生成素多肽。在一些实施例中，外泌体通过体外进行的方法制备。在一些实施例中，在人血清存在下进行一个或多个细胞与lnp的接触。在一些实施例中，人血清以体积计约0.5％、约1％或约1.5％存在。在一些实施例中，人血清以体积计约1％存在。在一些实施例中，使一个或多个细胞与lnp接触包括使该一个或多个细胞与至少2个、至少3个或至少4个不同剂量的该lnp接触。在一些实施例中，使一个或多个细胞与lnp接触包括使该一个或多个细胞与至少3个不同剂量的该lnp接触。在一些实施例中，分离外泌体包括从体外细胞培养基的样品分离外泌体。在多个实施例中，本披露还提供了将经修饰的rna递送至细胞的方法，该方法通过使该细胞与有效量的外泌体或包含至少一种外泌体的药物组合物(例如，本文描述的任何外泌体或药物组合物)接触，从而将该经修饰的rna递送至该细胞。在一些实施例中，接触细胞包括将外泌体或药物组合物添加至体外细胞培养物中或将外泌体或药物组合物施用于受试者。在多个实施例中，本文还提供了有效量的外泌体或包含至少一种外泌体的药物组合物(例如，本文描述的任何外泌体或药物组合物)在将经修饰的rna递送至细胞中的用途。在本文描述的方法和用途的一些实施例中，细胞存在于体外细胞培养物中。在一些实施例中，细胞获自受试者。在一些实施例中，细胞存在于受试者中。在一些实施例中，细胞是上皮细胞、免疫细胞、祖细胞或干细胞。在一些实施例中，细胞是b淋巴细胞、t淋巴细胞或单核细胞。在本文描述的方法和用途的一些实施例中，将经修饰的rna递送至细胞不改变细胞世代时间。在一些实施例中，将经修饰的rna递送至细胞不改变以按重量计的总细胞蛋白含量。在多个实施例中，本文还提供了包含至少一种外泌体(例如，本文描述的任何外泌体)和药学上可接受的载体的药物组合物。在多个实施例中，本文还进一步提供了本文披露的外泌体和药物组合物的治疗性方法和用途，例如用于治疗障碍。例如，在某些方面，本披露提供了治疗或预防受试者的障碍的方法，该方法通过向受试者施用有效量的外泌体或包含至少一种外泌体的药物组合物(例如，本文描述的任何外泌体或药物组合物)进行，其中外泌体包含有效治疗该障碍的经修饰的rna。在一些实施例中，外泌体是从获自受试者的细胞分离的。在某些其他方面，本披露提供了有效量的外泌体或包含至少一种外泌体的药物组合物(例如，本文描述的任何外泌体或药物组合物)在治疗或预防受试者的障碍中的用途，其中外泌体包含有效治疗该障碍的经修饰的rna。在一些实施例中，外泌体是从获自受试者的细胞分离的。在仍其他方面，本披露提供了治疗或预防受试者的障碍的方法，该方法通过以下步骤进行：(a)提供从该受试者获得的一个或多个细胞；(b)在允许细胞摄取脂质纳米颗粒(lnp)的条件下，使该一个或多个细胞与包含经修饰的rna的一个或多个lnp接触；(c)分离由该一个或多个细胞产生的外泌体，其中至少一个分离的外泌体包含该经修饰的rna；以及(d)向该受试者施用有效量的该分离的外泌体，其中该经修饰的rna有效治疗该障碍。在一些实施例中，细胞是上皮细胞、免疫细胞、祖细胞或干细胞。在一些实施例中，细胞是b淋巴细胞、t淋巴细胞或单核细胞。在仍其他方面，本披露提供了有效量的分离的外泌体在治疗或预防受试者的障碍的用途，该方法通过以下步骤进行：(a)提供从该受试者获得的一个或多个细胞；(b)在允许细胞摄取脂质纳米颗粒(lnp)的条件下，使该一个或多个细胞与包含经修饰的rna的一个或多个lnp接触；(c)分离由该一个或多个细胞产生的外泌体，其中至少一个分离的外泌体包含该经修饰的rna；以及(d)向该受试者施用有效量的该分离的外泌体，其中该经修饰的rna有效治疗该障碍。在一些实施例中，细胞是上皮细胞、免疫细胞、祖细胞或干细胞。在一些实施例中，细胞是b淋巴细胞、t淋巴细胞或单核细胞。在本文披露的方法和用途的一些实施例中，障碍选自贫血、骨髓增生异常、免疫或炎性疾病、单基因障碍和复杂疾病。在一些实施例中，障碍是贫血。在一些实施例中，障碍是骨髓增生异常。在一些实施例中，障碍是免疫或炎性疾病。在一些实施例中，免疫或炎性疾病是炎性肠病。在一些实施例中，障碍是单基因障碍。在一些实施例中，单基因障碍是神经退行性疾病。在一些实施例中，障碍是复杂疾病。在一些实施例中，复杂疾病是心肌梗塞。在一些实施例中，复杂疾病是癌症。在本文披露的方法和用途的一些实施例中，经修饰的rna编码有效治疗障碍的多肽。在一些实施例中，经修饰的rna编码促红细胞生成素多肽。在一些实施例中，经修饰的rna编码人促红细胞生成素多肽。在一些实施例中，经修饰的rna编码具有seqidno：1的促红细胞生成素多肽。在本文披露的方法和用途的一些实施例中，与不存在外泌体的治疗相比，受试者在存在外泌体的情况下对治疗的免疫和/或炎症反应降低。在一些实施例中，所降低的免疫和/或炎症反应包括至少一种细胞因子的水平的增加或减少。在一些实施例中，所降低的免疫和/或炎症反应包括至少一种细胞因子的水平的降低，其中该细胞因子选自il-6、ip-10、rantes、mcp-1和kc。在本文披露的方法和用途的一些实施例中，在人血清存在下进行一个或多个细胞与lnp的接触。在一些实施例中，人血清以体积计约0.5％、约1％或约1.5％存在。在一些实施例中，人血清以体积计约1％存在。在一些实施例中，使一个或多个细胞与lnp接触包括使该一个或多个细胞与至少2个、至少3个或至少4个不同剂量的该lnp接触。在一些实施例中，使一个或多个细胞与lnp接触包括使该一个或多个细胞与至少3个不同剂量的该lnp接触。在一些实施例中，分离外泌体包括从体外细胞培养基的样品分离外泌体。附图说明图1a显示了在lnp递送后在人上皮(htb-177)细胞中检测到的hepomrna的量。将具有dlin-dma可离子化的脂质的lnp(dd-lnp)和具有dlin-mc3-dma可离子化的脂质的lnp(mc3-lnp)(各自包含100μg的hepomrna)在独立实验中转移至htb-177细胞。未经处理的细胞和用无hepomrna的lnp处理的细胞均用作对照。lnp处理96小时后，通过rt-qpcr在受体细胞中定量hepomrna。lnp处理96小时后，将细胞中检测到的hepomrna的量标准化为收获的细胞的总数。图1b显示了lnp递送后在htb-177细胞中检测到的hepo蛋白的细胞内的量。经由lnp将100μg的hepomrna递送至htb-177细胞。lnp处理96小时后，通过elisa在受体细胞中定量了来自外源递送的mrna的hepo蛋白。lnp处理96小时后，将hepo蛋白的量标准化为收获的细胞的总数。图1c显示了在lnp递送后在htb-177细胞调理培养基上清液中检测到的hepo蛋白的细胞外的量。经由lnp将100μg的hepomrna递送至htb-177细胞。lnp处理96小时后，使用elisa对细胞培养调理培养基上清液中的分泌的hepo蛋白进行了定量。lnp处理96小时后，将hepo蛋白的量标准化为收获的细胞的总数。图1d显示了在lnp处理的细胞的胞质中检测到的hepomrna相对于经由lnp施用的hepomrna总量(100μg)的百分比。图1e显示了在lnp胞吞后hepomrna内体逃逸到胞质中、以及hepomrna翻译成蛋白质的示例性示意图。可替代地，可以将hepomrna包装入内体来源的ev(内体-ev)中，并经由胞吐作用分泌。图1f显示了在从lnp处理的细胞分离的ev中定量的hepomrna的总量。在细胞胞质中检测到lnp递送的hepomrna后，在从这些细胞分泌的ev中评估了其余的hepomrna。分离ev，并通过rt-qpcr定量(绝对定量)ev中的hepomrna。图1g显示了lnp中可离子化的脂质和hepomrna核苷酸的摩尔浓度(可离子化的脂质/hepomrna)。使用梯度高效液相色谱(uplc)分析了用于细胞递送的lnp(mc3-lnp和dd-lnp)的可离子化的脂质和hepomrna核苷酸的摩尔浓度。通常，lnp包含比hepomrna核苷酸(μmol)多超过近3倍的可离子化的脂质(μmol)。图1h和图1i显示了ev中可离子化的脂质和hepomrna核苷酸的摩尔浓度(可离子化的脂质/hepomrna)。从lnp处理的细胞分离ev，并使用梯度高效液相色谱(uplc)在ev中分析了可离子化的脂质和hepomrna核苷酸的摩尔浓度。通常，mc3-ev(图1h)和dd-ev(图1i)包含与hepomrna核苷酸(μmol)大约相等浓度的可离子化的脂质(μmol)。图1j显示了lnp和ev之间的、针对可离子化的脂质/hepomrna核苷酸的摩尔比(mol/mol)的比较。ev通常包含1∶1摩尔比(1mol的可离子化的脂质/1mol的mrna核苷酸)，而lnp通常包含3∶1摩尔比(3mol的可离子化的脂质/1mol的mrna核苷酸)。图2a显示了经由ev将cy5-egfp-mrna递送至人上皮(htb-177)细胞。将含有76μg荧光花菁5(cy5)egfp-mrna的dd-lnp施用于htb-177细胞。lnp处理96小时后，从dd-lnp处理的细胞分离ev(dd-ev)。将78μg包含cy5-egfp-mrna的dd-ev转移至自体htb-177细胞。在ev递送5小时、24小时和48小时后，通过基于荧光的facs评估细胞中的cy5-egfp-mrna递送。数据表示为在每个时间点进行ev转移后，含有egfp-mrna的htb-177细胞的百分比。数据表示为至少三次生物重复的平均值，带有标准偏差(sd)。mc3-lnp和dd-lnp组使用参数不成对双尾t检验进行比较。p值：**p＜0.01，****p＜0.0001，并且ns＝不显著。缩写：unt(不含ev)-未处理的ev；细胞+ev(不含cy5-mrna)-dd-lnp或未用mrna转移的mc3-lnp；细胞+ev(含cy5-mrna)-dd-lnp或用mrna转移的mc3-lnp。图2b、图2c和图2d显示了经由ev将cy5-egfp-mrna递送至人外周血单核细胞(pbmc)。从健康人血沉棕黄层分离出外周血单核细胞(pbmc)并用针对cd19(b细胞)、cd3(t细胞)和cd14(单核细胞)的特异性表面标记进行染色。将78μg含cy5-egfp-mrna的dd-ev转移到受体细胞中。ev递送5小时、24小时和48小时后，进行facs分析以检测受体免疫细胞中的cy5-egfp-mrna。基于b细胞(图2b)、t细胞(图2c)和单核细胞(图2d)中的cy5-荧光和抗体荧光来评估cy5-egfp-mrna的递送。数据表示为在每个时间点进行ev转移后，含有cy5-egfp-mrna的细胞的百分比。数据表示为至少三次生物重复的平均值，带有标准偏差(sd)。mc3-lnp和dd-lnp组使用参数不成对双尾t检验进行比较。p值：**p＜0.01，****p＜0.0001，并且ns＝不显著。缩写：unt(不含ev)-未处理的ev；细胞+ev(不含cy5-mrna)-dd-lnp或未用mrna转移的mc3-lnp；细胞+ev(含cy5-mrna)-dd-lnp或用mrna转移的mc3-lnp。图3显示了经由ev递送hepomrna后在小鼠血液中检测hepo蛋白。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-ev(每只小鼠)。ev注射后0小时(未处理)、2小时、5小时和24小时，通过人促红细胞生成素elisa测定小鼠血浆中hepo蛋白的浓度。ev注射后2小时，在小鼠血液中可检测到hepo蛋白。给对照小鼠注射当量体积的pbs，并通过elisa检查小鼠血浆中的hepo蛋白。除2小时(n＝4)以外，表示的数据为在每个时间点均来自八次重复(n＝8)。散点图中的每个点表示每次重复(小鼠)。使用参数不成对双尾t检验(ns：不显著)在2小时和5小时之间对mc3-ev递送后血浆hepo蛋白进行比较。图4a和图4b显示了在经由ev体内递送hepomrna后，小鼠心脏中hepomrna(图4a)和hepo蛋白(图4b)的定量。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-ev(每只小鼠)。ev注射后5小时、24小时和96小时，分别通过rt-qpcr和elisa定量hepomrna和hepo蛋白的水平。将注射pbs的小鼠用作对照。数据表示为在每个时间点四次重复(n＝4)的平均值、带有标准偏差(sd)，为散点图。在每个时间点使用参数不成对双尾t检验对ev处理组和未处理组进行比较。显著性值显示为p值：*p＜0.05，**p＜0.01.***p＜0.001。图4c和图4d显示了小鼠肺中hepomrna(图4c)和hepo蛋白(图4d)的定量。ev注射后5小时、24小时和96小时(每只小鼠1.5μg的hepomrna)，通过rt-qpcr定量肺中hepomrna的水平，以及通过elisa定量hepo蛋白的水平。数据表示为在每个时间点四次重复(n＝4)的平均值、带有标准偏差(sd)，为散点图。在每个时间点使用参数不成对双尾t检验对ev处理组和未处理组进行比较。显著性值显示为p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。图4e和图4f显示了小鼠肝中hepomrna(图4e)和hepo蛋白(图4f)的定量。ev注射后5小时、24小时和96小时(每只小鼠1.5μg的hepomrna)，通过rt-qpcr定量肝中hepomrna的水平，以及通过elisa定量hepo蛋白的水平。与评估的所有其他器官相比，在肝中检测到了最高量的hepo蛋白。数据表示为在每个时间点四次重复(n＝4)的平均值、带有标准偏差(sd)，为散点图。在每个时间点使用参数不成对双尾t检验对ev处理组和未处理组进行比较。显著性值显示为p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。图4g和图4h显示了小鼠脾中hepomrna(图4g)和hepo蛋白(图4h)的定量。ev注射后5小时、24小时和96小时(每只小鼠1.5μg的hepomrna)，通过rt-qpcr定量脾中hepomrna的水平，以及通过elisa定量hepo蛋白的水平。与评估的所有其他器官相比，在脾中检测到了最高量的hepomrna。数据表示为在每个时间点四次重复(n＝4)的平均值、带有标准偏差(sd)，为散点图。在每个时间点使用参数不成对双尾t检验对ev处理组和未处理组进行比较。显著性值显示为p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。图4i和图4j显示了小鼠肾中hepomrna(图4i)和hepo蛋白(图4j)的定量。ev注射后5小时、24小时和96小时(每只小鼠1.5μg的hepomrna)，通过rt-qpcr定量肾中hepomrna的水平，以及通过elisa定量hepo蛋白的水平。数据表示为在每个时间点四次重复(n＝4)的平均值、带有标准偏差(sd)，为散点图。在每个时间点使用参数不成对双尾t检验对ev处理组和未处理组进行比较。显著性值显示为p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。图4k和图4l显示了小鼠胸腺中hepomrna(图4k)和hepo蛋白(图4l)的定量。ev注射后5小时、24小时和96小时(每只小鼠1.5μg的hepomrna)，通过rt-qpcr定量胸腺中hepomrna的水平，以及通过elisa定量hepo蛋白的水平。数据表示为在每个时间点四次重复(n＝4)的平均值、带有标准偏差(sd)，为散点图。在每个时间点使用参数不成对双尾t检验对ev处理组和未处理组进行比较。显著性值显示为p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。图4m和图4n显示了小鼠胰腺中hepomrna(图4m)和hepo蛋白(图4n)的定量。ev注射后5小时、24小时和96小时(每只小鼠1.5μg的hepomrna)，通过rt-qpcr定量胰腺中hepomrna的水平，以及通过elisa定量hepo蛋白的水平。数据表示为在每个时间点四次重复(n＝4)的平均值、带有标准偏差(sd)，为散点图。在每个时间点使用参数不成对双尾t检验对ev处理组和未处理组进行比较。显著性值显示为p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。图4o和图4p显示了小鼠脑中hepomrna(图4o)和hepo蛋白(图4p)的定量。ev注射后5小时、24小时和96小时(每只小鼠1.5μg的hepomrna)，通过rt-qpcr定量脑中hepomrna的水平，以及通过elisa定量hepo蛋白的水平。数据表示为在每个时间点四次重复(n＝4)的平均值、带有标准偏差(sd)，为散点图。在每个时间点使用参数不成对双尾t检验对ev处理组和未处理组进行比较。显著性值显示为p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。图5显示了mc3-ev和mc3-lnp递送后小鼠血液和器官中的hepo蛋白水平。向小鼠递送等剂量的hepomrna(每只小鼠1.5μg)后，比较了mc3-ev和mc3-lnp的hepo蛋白产生。在器官中，来自lnp的hepo蛋白的量通常与来自ev的相当，但脾除外(脾中的蛋白产生存在显著差异)，其次是心脏(心脏的蛋白产生存在较小差异)。观察到hepo蛋白的血浆水平存在最显著的差异，与mc3-ev递送后相比，其在mc3-lnp递送后更高。数据表示为在每个时间点重复(散点图中的点代表每次重复)的平均值、带有标准偏差(sd)。在每个时间点使用参数不成对双尾t检验对每种器官或血浆的ev处理组和lnp处理组进行比较。显著性值显示为p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。图6a显示了mc3-ev和mc3-lnp递送后小鼠血浆中的细胞因子il-6水平。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-ev或mc3-lnp(每只小鼠)。注射mc3-ev、mc3-lnp或pbs后5小时和24小时，通过map小鼠细胞因子磁珠试剂盒测定小鼠血浆中il-6的浓度。表示的数据为在每个时间点均来自4只小鼠(n＝4)。散点图中的每个点表示每次重复(小鼠)。进行单因素anova检验，然后进行sidak多重比较检验。有效值显示为p值。图6b显示了mc3-ev和mc3-lnp递送后小鼠血浆中的细胞因子ip-10水平。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-ev或mc3-lnp(每只小鼠)。注射mc3-ev、mc3-lnp或pbs后5小时和24小时，测定小鼠血浆中ip-10的浓度。表示的数据为在每个时间点均来自4只小鼠(n＝4)。散点图中的每个点表示每次重复(小鼠)。进行单因素anova检验，然后进行sidak多重比较检验。有效值显示为p值。图6c显示了mc3-ev和mc3-lnp递送后小鼠血浆中的细胞因子rantes水平。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-ev或mc3-lnp(每只小鼠)。注射mc3-ev、mc3-lnp或pbs后5小时和24小时，测定小鼠血浆中rantes的浓度。表示的数据为在每个时间点均来自4只小鼠(n＝4)。散点图中的每个点表示每次重复(小鼠)。进行单因素anova检验，然后进行sidak多重比较检验。有效值显示为p值。图6d显示了mc3-ev和mc3-lnp递送后小鼠血浆中的细胞因子mcp-1水平。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-ev或mc3-lnp(每只小鼠)。注射mc3-ev、mc3-lnp或pbs后5小时和24小时，测定小鼠血浆中mcp-1的浓度。表示的数据为在每个时间点均来自4只小鼠(n＝4)。散点图中的每个点表示每次重复(小鼠)。进行单因素anova检验，然后进行sidak多重比较检验。有效值显示为p值。图6e显示了mc3-ev和mc3-lnp递送后小鼠血浆中的细胞因子kc水平。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-ev或mc3-lnp(每只小鼠)。注射mc3-ev、mc3-lnp或pbs后5小时和24小时，测定小鼠血浆中kc的浓度。表示的数据为在每个时间点均来自4只小鼠(n＝4)。散点图中的每个点表示每次重复(小鼠)。进行单因素anova检验，然后进行sidak多重比较检验。有效值显示为p值。图6f显示了mc3-ev和mc3-lnp递送后小鼠血浆中的细胞因子il1-β水平。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-ev或mc3-lnp(每只小鼠)。注射mc3-ev、mc3-lnp或pbs后5小时和24小时，测定小鼠血浆中il1-β的浓度。表示的数据为在每个时间点均来自4只小鼠(n＝4)。散点图中的每个点表示每次重复(小鼠)。进行单因素anova检验，然后进行sidak多重比较检验。有效值显示为p值。图6g显示了mc3-ev和mc3-lnp递送后小鼠血浆中的细胞因子tnf-α水平。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-ev或mc3-lnp(每只小鼠)。注射mc3-ev、mc3-lnp或pbs后5小时和24小时，测定小鼠血浆中tnf-α的浓度。表示的数据为在每个时间点均来自4只小鼠(n＝4)。散点图中的每个点表示每次重复(小鼠)。进行单因素anova检验，然后进行sidak多重比较检验。有效值显示为p值。图6h显示了mc3-ev和mc3-lnp递送后小鼠血浆中的细胞因子ifn-γ水平。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-ev或mc3-lnp(每只小鼠)。注射mc3-ev、mc3-lnp或pbs后5小时和24小时，测定小鼠血浆中ifn-γ的浓度。表示的数据为在每个时间点均来自4只小鼠(n＝4)。散点图中的每个点表示每次重复(小鼠)。进行单因素anova检验，然后进行sidak多重比较检验。有效值显示为p值。图7a显示了人中lnp的假设命运的示例性示意图。图7b显示了在酸性环境(ph5.8或6.6)中，hepomrna不从lnp释放。相反，在生理ph值(7.4)下，hepomrna和lnp的脂质组分解离。图7c显示了lnp-内体的假设命运的示例性示意图。图8a显示了具有两种不同的可离子化的脂质dlin-mc3-dma和dlin-dma的示例性脂质纳米颗粒(lnp)的结构。图8b显示了lnp对细胞生长的影响。将各自包含100μg的hepomrna的dd-lnp或mc3-lnp在独立实验中转移至受体细胞中。还用不含hepomrna的对照lnp处理细胞。lnp处理96小时后，收获细胞、进行计数、并基于lnp处理间隔开始时和结束时细胞数量之间的差值(定义为δn(细胞数量变化))计算细胞世代时间(即，将细胞群体增加一倍的时间(以小时计))。数字(n)表示用于评估每种处理的生物重复。通过使用单因素anova检验、然后进行tukey多重比较检验来评估各组之间的显著性差异(显著性p值＜0.05)。仅显示显著性p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。图8c显示了lnp对总细胞rna的影响。lnp处理96小时后，将总细胞rna定量并标准化为δn。数字(n)表示用于评估每种处理的生物重复。通过使用单因素anova检验、然后进行tukey多重比较检验来评估各组之间的显著性差异(显著性p值＜0.05)。仅显示显著性p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。图8d和图8e显示了lnp对总细胞内蛋白(图8d)和总分泌蛋白(图8e)的影响。lnp处理96小时后，将总细胞蛋白(细胞内和分泌的)定量并标准化为δn。数字(n)表示用于评估每种处理的生物重复。通过使用单因素anova检验、然后进行tukey多重比较检验来评估各组之间的显著性差异(显著性p值＜0.05)。仅显示显著性p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。图8f显示了lnp对ev中总rna的影响。lnp处理96小时后，将ev中的总rna定量并标准化为δn。数字(n)表示用于评估每种处理的生物重复。通过使用单因素anova检验、然后进行tukey多重比较检验来评估各组之间的显著性差异(显著性p值＜0.05)。仅显示显著性p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。图8g显示了lnp对ev中总蛋白质的影响。lnp处理96小时后，将ev中的总蛋白定量并标准化为δn。数字(n)表示用于评估每种处理的生物重复。通过使用单因素anova检验、然后进行tukey多重比较检验来评估各组之间的显著性差异(显著性p值＜0.05)。仅显示显著性p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。图9显示了hepomrna从lnp直接转移至ev的评估。将含有hepomrna的mc3-lnp和dd-lnp与未进行过任何预处理的ev(细胞不存在下)一起在30ml的pbs中于37℃孵育2小时。孵育了两个不同比例的ev和lnp：200μgev+300μllnp(1x)和50μgev+300μllnp(4x)。孵育2小时后，通过超速离心重新分离ev。从ev分离总rna并通过qpcr对hepomrna进行定量，以评估hepomrna从lnp向ev的直接转移。作为阳性对照，将当量体积的dd-lnp或mc3-lnp在没有ev的情况下在pbs中孵育并超速离心。分离总rna并通过qpcr对hepomrna进行定量。在平行实验中，将含有hepomrna的mc3-lnp和dd-lnp转移到细胞中，并从细胞中分离出ev；从ev分离总rna并通过qpcr定量hepomrna，以评估来自lnp处理的细胞的ev中的hepomrna。缩写：dd-ev或mc3-ev，细胞来源的-用含有hepomrna的dd-lnp或mc3-lnp处理的细胞产生的ev；混合ev+lnp(x1)-混合了300μl的lnp的ev(200μg)；混合ev+lnp(x4)-混合了300μl的lnp的ev(50μg)；lnp，不含ev-仅包含hepomrna、不与ev混合的lnp。实验以三次生物重复进行。数据表示为，lnp处理细胞后或lnp与ev孵育(直接混合)后在ev中检测到的hepomrna相对于lnp向细胞递送的mrna起始量或与ev直接混合的mrna量的百分比。显示了重复的平均值，带有标准偏差(sd)。图10a显示了经由ev将hepomrna递送至细胞，并检测了胞质中翻译的蛋白质。将掺入hepomrna的mc3-ev(来自mc3-lnp处理的细胞)或掺入hepomrna的dd-ev(来自dd-lnp处理的细胞)转移至htb-177受体细胞。将不含hepomrna的ev(从未经处理的细胞中获得)和不含hepomrna的lnp作为对照进行递送。递送hepomrna96小时后，使用特异于人促红细胞生成素的elisa对细胞裂解物中的hepo蛋白进行定量。将细胞裂解物中的hepo蛋白的量标准化为δn(定义为细胞数量的变化，即，lnp处理间隔开始时和结束时细胞数量之间的差值)。表示的数据为在每个时间点均来自两个(n＝2)重复。散点图中的每个点表示每次重复。图10b显示了经由ev将hepomrna递送至细胞和检测分泌的蛋白。递送hepomrna96小时后，使用特异于人促红细胞生成素的elisa定量经培养的调理培养基上清液中分泌的hepo蛋白水平。将上清液中hepo蛋白的量标准化为δn。表示的数据为在每个时间点均来自两个(n＝2)重复。散点图中的每个点表示每次重复。图10c显示了在细胞和上清液中定量的hepo蛋白的总和(标准化为δn)。表示的数据为在每个时间点均来自两个(n＝2)重复。散点图中的每个点表示每次重复。图10d显示了在用ev处理96小时的培养时间后受体细胞的世代时间。表示的数据为在每个时间点均来自两个(n＝2)重复。散点图中的每个点表示每次重复。图10e显示了总细胞蛋白(标准化为δn)。表示的数据为在每个时间点均来自两个(n＝2)重复。散点图中的每个点表示每次重复。图10f显示了上清液中的总蛋白质(标准化为δn)。表示的数据为在每个时间点均来自两个(n＝2)重复。散点图中的每个点表示每次重复。图11显示了经由ev将cy5-egfp-mrna递送至上皮细胞和原始免疫细胞的facs分析。上皮细胞(列1)：将含有76μg的cy5-egfp-mrna的dd-lnp施用于人上皮(htb-177)细胞，并在lnp处理96小时后从这些细胞中分离出ev(掺有mrna的dd-ev)。将78μg包含cy5-egfp-mrna的dd-ev转移至htb-177细胞(2x105培养的细胞/孔)。在ev转移后的不同间隔(2小时、24小时、48小时)收获细胞，并通过facs分析细胞中cy5-egfp-mrna的存在。原始免疫细胞(列2-4)：培养从健康人血沉棕黄层分离的外周血单核细胞(pbmc)(2x105细胞/孔)，并将78μg包含cy5-egfp-mrna的dd-ev转移到pbmc中。在ev转移后的不同间隔(2小时、24小时、48小时)收获细胞，并用针对cd19(b细胞)、cd3(t细胞)和cd14(单核细胞)的表面标记单克隆抗体(mab)染色。进行facs分析以检测受体细胞中的cy5-egfp-mrna，并且基于cy5-荧光和特异于每种细胞类型的抗体荧光来评估每种细胞类型中cy5-egfp-mrna的存在。facs点图表示每个时间点的cy5-egfp-mrna(y轴)相对于fcs-a(x轴)。cy5-egfp-mrna阳性的细胞报告在右上象限。缩写：细胞不含ev-未经处理的细胞；细胞+ev(不含mrna)-用不含mrna的ev处理过的细胞；细胞+ev(含mrna)-用含mrna的ev处理过的细胞。图12显示了人促红细胞生成素elisa试剂盒(干细胞技术公司(stemcelltechnologies))用以确认对人促红细胞生成素(hepo)的特异性并检查其与小鼠血浆epo蛋白的交叉反应性的测试。测试未稀释和稀释(2x-两倍；10x-十倍)的、未经处理的小鼠的血浆和正常人的新鲜血浆。在小鼠血浆中未检测到hepo信号。图13显示了经由mc3-lnp递送hepomrna后在小鼠血液中检测hepo蛋白。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-lnp(每只小鼠)，或当量体积的pbs(作为对照)。注射后0小时、2小时、5小时和24小时，通过elisa测定小鼠血浆中hepo蛋白的浓度。除2小时时间点(n＝4)以外，表示的数据均来自8只小鼠(n＝8)。散点图中的每个点表示每次重复(小鼠)。未经处理的小鼠(pbs)的数量为n＝8。使用参数不成对双尾t检验(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001，且ns＝不显著)在2小时和5小时之间对mc3-lnp递送的血浆hepo蛋白进行比较。图14a和图14b显示了小鼠心脏中hepomrna(图14a)和hepo蛋白(图14b)的定量。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-lnp(每只小鼠)，或当量体积的pbs(作为对照)。注射后5小时、24小时和96小时分别通过rt-qpcr和elisa定量hepomrna和hepo蛋白的水平。数据表示为相对于器官重量标准化的、整个器官中检测到的hepomrna或蛋白质的总量。对于每个时间点和每种处理(lnp或pbs)，使用四只小鼠(n＝4)。数据表示为在每个时间点四次重复(n＝4)的平均值、带有标准偏差(sd)。散点图中的每个点表示每次重复。对于每个时间点，使用参数不成对双尾t检验对mc3-lnp和pbs组进行比较。仅显示显著性p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。图14c和图14d显示了小鼠肺中hepomrna(图14c)和hepo蛋白(图14d)的定量。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-lnp(每只小鼠)，或当量体积的pbs(作为对照)。注射后5小时、24小时和96小时分别通过rt-qpcr和elisa定量hepomrna和hepo蛋白的水平。数据表示为相对于器官重量标准化的、整个器官中检测到的hepomrna或蛋白质的总量。对于每个时间点和每种处理(lnp或pbs)，使用四只小鼠(n＝4)。数据表示为在每个时间点四次重复(n＝4)的平均值、带有标准偏差(sd)。散点图中的每个点表示每次重复。对于每个时间点，使用参数不成对双尾t检验对mc3-lnp和pbs组进行比较。仅显示显著性p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。图14e和图14f显示了小鼠肝中hepomrna(图14e)和hepo蛋白(图14f)的定量。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-lnp(每只小鼠)，或当量体积的pbs(作为对照)。注射后5小时、24小时和96小时分别通过rt-qpcr和elisa定量hepomrna和hepo蛋白的水平。数据表示为相对于器官重量标准化的、整个器官中检测到的hepomrna或蛋白质的总量。对于每个时间点和每种处理(lnp或pbs)，使用四只小鼠(n＝4)。数据表示为在每个时间点四次重复(n＝4)的平均值、带有标准偏差(sd)。散点图中的每个点表示每次重复。对于每个时间点，使用参数不成对双尾t检验对mc3-lnp和pbs组进行比较。仅显示显著性p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。图14g和图14h显示了小鼠脾中hepomrna(图14g)和hepo蛋白(图14h)的定量。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-lnp(每只小鼠)，或当量体积的pbs(作为对照)。注射后5小时、24小时和96小时分别通过rt-qpcr和elisa定量hepomrna和hepo蛋白的水平。数据表示为相对于器官重量标准化的、整个器官中检测到的hepomrna或蛋白质的总量。对于每个时间点和每种处理(lnp或pbs)，使用四只小鼠(n＝4)。数据表示为在每个时间点四次重复(n＝4)的平均值、带有标准偏差(sd)。散点图中的每个点表示每次重复。对于每个时间点，使用参数不成对双尾t检验对mc3-lnp和pbs组进行比较。仅显示显著性p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。图14i和图14j显示了小鼠肾中hepomrna(图14i)和hepo蛋白(图14j)的定量。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-lnp(每只小鼠)，或当量体积的pbs(作为对照)。注射后5小时、24小时和96小时分别通过rt-qpcr和elisa定量hepomrna和hepo蛋白的水平。数据表示为相对于器官重量标准化的、整个器官中检测到的hepomrna或蛋白质的总量。对于每个时间点和每种处理(lnp或pbs)，使用四只小鼠(n＝4)。数据表示为在每个时间点四次重复(n＝4)的平均值、带有标准偏差(sd)。散点图中的每个点表示每次重复。对于每个时间点，使用参数不成对双尾t检验对mc3-lnp和pbs组进行比较。仅显示显著性p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。图14k和图14l显示了小鼠胸腺中hepomrna(图14k)和hepo蛋白(图14l)的定量。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-lnp(每只小鼠)，或当量体积的pbs(作为对照)。注射后5小时、24小时和96小时分别通过rt-qpcr和elisa定量hepomrna和hepo蛋白的水平。数据表示为相对于器官重量标准化的、整个器官中检测到的hepomrna或蛋白质的总量。对于每个时间点和每种处理(lnp或pbs)，使用四只小鼠(n＝4)。数据表示为在每个时间点四次重复(n＝4)的平均值、带有标准偏差(sd)。散点图中的每个点表示每次重复。对于每个时间点，使用参数不成对双尾t检验对mc3-lnp和pbs组进行比较。仅显示显著性p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。图14m和图14n显示了小鼠胰腺中hepomrna(图14m)和hepo蛋白(图14n)的定量。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-lnp(每只小鼠)，或当量体积的pbs(作为对照)。注射后5小时、24小时和96小时分别通过rt-qpcr和elisa定量hepomrna和hepo蛋白的水平。数据表示为相对于器官重量标准化的、整个器官中检测到的hepomrna或蛋白质的总量。对于每个时间点和每种处理(lnp或pbs)，使用四只小鼠(n＝4)。数据表示为在每个时间点四次重复(n＝4)的平均值、带有标准偏差(sd)。散点图中的每个点表示每次重复。对于每个时间点，使用参数不成对双尾t检验对mc3-lnp和pbs组进行比较。仅显示显著性p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。图14o和图14p显示了小鼠脑中hepomrna(图14o)和hepo蛋白(图14p)的定量。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-lnp(每只小鼠)，或当量体积的pbs(作为对照)。注射后5小时、24小时和96小时分别通过rt-qpcr和elisa定量hepomrna和hepo蛋白的水平。数据表示为相对于器官重量标准化的、整个器官中检测到的hepomrna或蛋白质的总量。对于每个时间点和每种处理(lnp或pbs)，使用四只小鼠(n＝4)。数据表示为在每个时间点四次重复(n＝4)的平均值、带有标准偏差(sd)。散点图中的每个点表示每次重复。对于每个时间点，使用参数不成对双尾t检验对mc3-lnp和pbs组进行比较。仅显示显著性p值：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。图15a-h显示了经由mc3-ev或mc3-lnp体内递送人epomrna后的器官重量。给小鼠静脉内注射100μl含1.5μg的hepomrna的mc3-ev或mc3-lnp(每只小鼠)，或当量体积的pbs(作为对照)。注射后5小时、24小时和96小时测定每个小鼠器官的重量：胸腺(图15a)、肾(图15b)、心脏(图15c)、肝(图15d)、胰腺(图15e)、脑(图15f)、脾(图15g)和肺(图15h)。在不同注射(pbs、ev、lnp)之间未观察到明显差异。对于处理组(mc3-ev、mc3-lnp)和未处理组(pbs)，使用四只小鼠(n＝4)。缩写：pbs-未经处理的小鼠；ev-包含hepomrna的mc3-ev；lnp-包含hepomrna的mc3-lnp。数据显示为平均值，带有标准偏差(sd)。散点图中的每个点表示每次重复(小鼠)。图16a和图16b显示了源自未经处理的或经mc3-lnp处理的htb-177细胞的分离的ev的纳米颗粒追踪分析(nta)的结果。图16a显示了源自未经处理的htb-177细胞的ev的大小分布和浓度(n＝3，(i)-(iii))。图16b显示了源自经mc3-lnp处理的htb-177细胞的ev的大小分布和浓度(n＝3，(i)-(iii))。表3-8中显示了平均大小、众数大小、标准偏差(sd)、d10、d50、d90和颗粒浓度。图17a和图17b显示了源自经lnp处理的细胞的ev的表征。图17a显示了表示cy5-mrna(y轴)相对于cd9(x轴)的facs点图。包含cy5-mrna的cd63/cd9阳性ev的百分比显示在右上象限中。将与pbs(代替ev)一起孵育的单珠显示为阴性对照。显示了两次生物重复之一。图17b显示了rna酶处理对对照纯hepomrna(无细胞和无ev(左侧))或对mc3-ev(右侧)的影响。实验以三次生物重复(n＝3)进行，并且hepomrnaqpcr数据表示为散点图加平均标准偏差(sd)。图18显示了在乙醇中、在1％(w/w)tritonx-100中和在含添加的、固定量的“空”ev的1％(w/w)tritonx-100中制备的dlin-mc3-dma样品的uplc-ms分析结果。具体实施方式为了能更容易地理解本披露，在整个详细描述中定义了某些术语。除非本文另有定义，否则与本披露内容结合使用的所有科学和技术术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，术语“胞外囊泡”或“ev”是指从细胞分泌或脱落的纳米级或微米级的膜囊泡。ev被脂质双层包裹，直径大小范围为从大约30nm到10,000nm。在某些实施例中，ev是外泌体。如本文所用，术语“外泌体”和“内体-ev”在本文中可互换使用，是指内体来源的ev。不希望受到理论的束缚，认为可以将被细胞或其他细胞组分胞吞的材料分类为内体区室，形成腔内囊泡(多囊泡内体或多囊泡体(mvb))。然后，当mvb与质膜融合时，囊泡可释放到细胞外环境中。释放的囊泡在本文中可以称为外泌体。在一些实施例中，外泌体在lnp胞吞后从细胞分泌或脱落。在一些实施例中，从已经与lnp接触或经lnp处理的细胞分泌或脱落的外泌体可包含一种或多种lnp组分(例如，一种或多种可离子化的脂质和/或一种或多种经修饰的rna)。在一些实施例中，外泌体通过胞吐途径分泌。在一些实施例中，外泌体的直径为约30nm至约300nm。在一些实施例中，外泌体的直径为约30nm至约150nm。在一些实施例中，外泌体的直径为约40nm至约150nm。在一些实施例中，外泌体的直径为约40nm至约120nm。如本文所描述和示例的，示例性的外泌体包括mc3-ev和dd-ev。如本文所用，术语“内体逃逸”是指在胞吞之后离开内体途径并进入胞质的rna。胞吞途径被认为是生物制剂如dna、rna或蛋白质的主要细胞摄取机制。这样的制剂可被包埋在内体中并被溶酶体中的特异性酶降解。因此，在一些实施例中，实现有效的基于生物学的治疗的限制性步骤是促进治疗剂(例如，经修饰的rna，例如，mrna)的内体逃逸并确保其胞质递送。在一些实施例中，经由lnp递送至细胞的总的经修饰的rna的少于约1％可经历内体逃逸并释放到胞质中。在一些实施例中，lnp胞吞后，一部分lnp组分(例如，一部分未逃逸的经修饰的rna和/或一部分lnp脂质组分)可最终出现在细胞分泌的外泌体中。如本文所用，“脂质纳米颗粒”或“lnp”是包含一种或多种脂质和一种或多种治疗剂(例如，一种或多种经修饰的rna)的纳米颗粒。纳米颗粒的大小通常在微米或更小的数量级。在一些实施例中，本文披露的lnp具有直径约200nm或更小的平均粒径，直径约150nm或更小的平均粒径，直径约100nm或更小的平均粒径，直径约75nm或更小的平均粒径或直径约50nm或更小的平均粒径。在一些实施例中，本文披露的lnp具有电子致密的纳米结构核心，该纳米结构核心通过将含有脂质的乙醇溶液与含有经修饰的rna(例如，mrna)的水溶液进行微流体混合而产生。在一些实施例中，本文披露的lnp不具有超过50体积％的连续含水区域，因此，不包括常规脂质体例如单层囊泡等。在多个实施例中，分离的外泌体可以通过以下方法制备：(a)提供一种或多种包含经修饰的rna的脂质纳米颗粒(lnp)；(b)在允许细胞摄取lnp的条件下使一个或多个细胞与该lnp接触；以及(c)分离由该一个或多个细胞产生的外泌体，其中至少一个分离的外泌体包含该经修饰的rna。在多个实施例中，lnp具有约50nm至约100nm，例如约60nm至约90nm、约70nm至约80nm或约80nm至约90nm的平均直径。在一些实施例中，lnp具有约70nm、约71nm、约72nm、约73nm、约74nm、约75nm、约76nm、约77nm、约78nm、约79nm、约80nm、约81nm、约82nm、约83nm、约84nm、约85nm、约86nm、约87nm、约88nm、约89nm或约90nm的平均直径。在一些实施例中，lnp具有约83nm、约84nm、约85nm、约86nm、约87nm或约88nm的平均直径。在多个实施例中，lnp具有约0.01至约0.15的多分散指数(pdi)，例如约0.01、约0.02、约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.10、约0.11、约0.12、约0.13、约0.14或约0.15。如本文所用，术语“多分散指数”或“pdi”是指纳米颗粒样品中纳米颗粒尺寸分布的量度(参见nist特别出版物1200-6，“measuringthesizeofnanoparticlesinaqueousmediausingbatchmodedynamiclightscattering[使用批量模式动态光散射测量水性介质中纳米颗粒的尺寸]”)。在多个实施例中，lnp具有约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约94％或更高、约95％或更高、约96％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的经修饰的rna的包封率(％ee)。如本文所用，术语“包封率(encapsulationefficiency)”或“％ee”是指lnp中的包封的经修饰的rna与组合物中总的经修饰的rna含量之比(通过使用洗涤剂例如tritonx-100裂解lnp而测得的)。在多个实施例中，lnp包含脂质组分和至少一种经修饰的rna。在多个实施例中，通过使一个或多个细胞与lnp(例如，本文披露的任何lnp)接触而产生的一种或多种外泌体包含脂质组分和至少一种经修饰的rna。在多个实施例中，外泌体的脂质组分可以至少部分源自lnp的脂质组分。在多个实施例中，外泌体的脂质组分可包含与lnp的脂质组分相同的一种或多种脂质。如本文所用，术语“脂质组分”是指包含一种或多种脂质的lnp和/或外泌体的组分。例如，本文披露的lnp和/或外泌体的脂质组分可包括一种或多种可离子化的脂质、一种或多种磷脂、一种或多种结构脂质和/或一种或多种peg脂质。在多个实施例中，lnp和/或外泌体的脂质组分可包含脂质单层和/或脂质双层。在多个实施例中，lnp的脂质组分可由常规纳米颗粒技术中使用的任何材料构造，例如可离子化的脂质、磷脂、结构脂质和/或peg脂质。在多个实施例中，存在于lnp的脂质组分中的至少一种脂质也存在于外泌体的脂质组分中，其中该外泌体是通过使一个或多个细胞与lnp接触而产生的。在多个实施例中，本文披露的lnp和/或外泌体的脂质组分可包括一种或多种可离子化的脂质。可离子化的脂质的非限制性实例包括例如在酸性ph下含有正电荷的脂质，例如1，2-二亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlin-dma)、二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(dlin-mc3-dma；参见例如，美国专利号8,158,601，将其通过引用并入本文)、2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(dlin-kc2-dma)、merck-32(参见例如，wo2012/018754，将其通过引用并入本文)，acuitas-5(参见例如，wo2015/199952，将通过引用并入本文)、kl-10(参见例如，us2012/0295832，将通过引用并入本文)、c12-200(参见例如，love等人.(2009)pnas107(5)：1864-69)等。在多个实施例中，可离子化的脂质是dlin-mc3-dma。在多个实施例中，可离子化的脂质是dlin-dma。在一些实施例中，lnp包含至少一种可离子化的脂质。在一些实施例中，至少一种可离子化的脂质能以相对于lnp中存在的总脂质、范围从约5％至约90％、约10％至约80％、约25％至约75％、或约40％至约60％(例如约50％)摩尔百分比的量存在于lnp中。在一些实施例中，至少一种可离子化的脂质以相对于lnp中存在的总脂质约50％摩尔百分比存在于lnp中。在一些实施例中，至少一种可离子化的脂质是dlin-mc3-dma。在一些其他实施例中，至少一种可离子化的脂质是dlin-dma。如本文所用，术语“mc3-lnp”可用于指包含大部分为dlin-mc3-dma可离子化的脂质的可离子化的脂质的lnp。如本文所用，术语“dd-lnp”可用于指包含大部分为dlin-dma可离子化的脂质的可离子化的脂质的lnp。在一些实施例中，外泌体包含至少一种可离子化的脂质。在一些实施例中，至少一种可离子化的脂质是dlin-mc3-dma。在一些其他实施例中，至少一种可离子化的脂质是dlin-dma。如本文所用，术语“mc3-ev”可用于指从与mc3-lnp接触或mc3-lnp处理的细胞分离的外泌体(ev)。如本文所用，术语“dd-ev”可用于指从与dd-lnp接触或dd-lnp处理的细胞分离的外泌体(ev)。在多个实施例中，本文披露的lnp和/或外泌体的脂质组分可包括一种或多种磷脂。在多个实施例中，磷脂可以组装成一个或多个脂质双层。通常，磷脂可包括磷酸部分和一个或多个碳链，例如饱和脂肪酸链。在多个实施例中，磷脂可包含一个或多个多(例如双或三)键(即一个或多个不饱和键)。在多个实施例中，磷脂可促进与膜的融合。在多个实施例中，磷脂与膜的融合可允许含脂质的组合物的一种或多种元件穿过该膜，从而允许例如将该一种或多种元件递送至细胞。示例性的磷脂包括但不限于1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dlpc)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(dmpc)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1,2-双十一碳酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(dupc)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(popc)、1，2-二-o-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18∶0二醚pc)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(ochemspc)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(c16lysopc)、1，2-二亚油烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(me16.0pe)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(dopg)和鞘磷脂。在多个实施例中，磷脂是dspc。示例性的磷脂还包括例如在生理ph下含有零净电荷的中性脂质。中性脂质的非限制性实例包括在生理ph下以不带电形式或中性两性离子形式存在的那些脂质，例如1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(dmpc)等。在多个实施例中，磷脂是dspc。在一些实施例中，lnp包含至少一种磷脂。在一些实施例中，至少一种磷脂能以相对于lnp中存在的总脂质、范围从约1％至约50％、约5％至约20％、约7.5％至约12.5％(例如约10％)摩尔百分比的量存在于lnp中。在一些实施例中，至少一种磷脂以相对于lnp中存在的总脂质约10％摩尔百分比存在于lnp中。在一些实施例中，至少一种磷脂是dspc。在一些实施例中，外泌体包含至少一种磷脂。在一些实施例中，至少一种磷脂是dspc。在多个实施例中，本文披露的lnp和/或外泌体的脂质组分可包括一种或多种结构脂质。如本文所用，术语“结构脂质”是指能够稳定和/或维持脂质组分如固醇(例如动物固醇、植物固醇、真菌固醇)的结构或流动性的分子。示例性的结构脂质是胆固醇。结构脂质的非限制性实例包括，例如，胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、番茄苷、熊果酸、α-生育酚、及其混合物。在多个实施例中，结构脂质是胆固醇。在一些实施例中，lnp包含至少一种结构脂质。在一些实施例中，至少一种结构脂质能以相对于lnp中存在的总脂质、范围从约10％至约90％、约20％至约50％、约35％至45％(例如约38.5％)摩尔百分比的量存在于lnp中。在一些实施例中，至少一种结构脂质以相对于lnp中存在的总脂质约38.5％摩尔百分比存在于lnp中。在一些实施例中，至少一种结构脂质是胆固醇。在一些实施例中，外泌体包含至少一种结构脂质。在一些实施例中，至少一种结构脂质是胆固醇。在多个实施例中，本文披露的lnp和/或外泌体的脂质组分可包括一种或多种peg或peg修饰的脂质。可替代地，这些脂质可称为聚乙二醇化脂质。在多个实施例中，peg脂质既包含脂质部分又包含聚乙二醇部分。示例性peg脂质包括但不限于peg-修饰的磷脂酰乙醇胺、peg-修饰的磷脂酸、peg-修饰的神经酰胺、peg-修饰的二烷基胺、peg-修饰的二酰基甘油、peg-修饰的二烷基甘油、及其混合物。例如，在多个实施例中，peg脂质可以是peg-c-domg、peg-dmg(1，2-二肉豆蔻酰基-ot-甘油甲氧基聚乙二醇，从阿万蒂极性脂质公司(avantipolarlipids)获得)、peg-dlpe、peg-dmpe、peg-dppc或peg-dspe。在多个实施例中，peg的分子量可以为约2,000da(peg2000)。在多个实施例中，peg脂质可以是peg2000-dmpe、peg2000-dppe、peg2000-dmg、peg2000-dpg、peg2000-c-domg或peg2000-c-dopg。在多个实施例中，peg脂质是peg-dmpe或peg2000-dmpe。在多个实施例中，peg的分子量可在从约500至约10,000da或从约1,000至约5,000da的范围内。在一些实施例中，lnp包含至少一种peg脂质。在一些实施例中，至少一种peg脂质能以相对于lnp中存在的总脂质、范围从约0％至约20％、约0.5％至约5％、约1％至约2％(例如约1.5％)摩尔百分比的量存在于lnp中。在一些实施例中，至少一种peg脂质以相对于lnp中存在的总脂质约1.5％摩尔百分比存在于lnp中。在一些实施例中，至少一种peg脂质是peg-dmpe或peg2000-dmpe。在一些实施例中，外泌体包含至少一种peg脂质。在一些实施例中，至少一种peg脂质是peg-dmpe或peg2000-dmpe。在多个实施例中，本文披露的lnp可以通过组合多种脂质组分来制备。例如，在多个实施例中，可以通过组合可离子化的脂质、磷脂、结构脂质和peg脂质中的一种或多种来制备lnp。在多个实施例中，可通过组合可离子化的脂质、磷脂、结构脂质和peg脂质来制备lnp，其中相对于lnp中存在的总脂质，peg脂质以约1.5％摩尔百分比存在于lnp中。在多个实施例中，可通过以相对于存在的总脂质约50∶10∶38.5∶1.5(mol/mol)的摩尔比组合可离子化的脂质(例如dlin-mc3-dma或dlin-dma)、磷脂(例如dspc)、结构脂质(例如胆固醇)和peg脂质(例如peg-dmpe)来制备lnp。构成本文披露的lnp的可离子化的脂质、磷脂、结构脂质和/或peg脂质的选择，以及这些脂质彼此的相对摩尔比，可以通过所选择的一种或多种脂质的特征、预期靶细胞的性质、以及待递送的经修饰的rna(例如像mrna)的特征来确定。例如，在一些实施例中，lnp中可离子化的脂质的摩尔百分比相对于存在的总脂质可以大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％、大于约50％、大于约60％或大于约70％。在一些实施例中，lnp中磷脂的摩尔百分比相对于存在的总脂质可以大于约5％、大于约10％、大于约20％、大于约30％或大于约40％。在一些实施例中，lnp中结构脂质的摩尔百分比相对于存在的总脂质可以大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％或大于约50％。在一些实施例中，lnp中的peg脂质的摩尔百分比相对于存在的总脂质可以大于约0.25％，例如大于约1％、大于约1.5％、大于约2％、大于约5％或大于约10％。在多个实施例中，本文披露的lnp能以希望的任何有用取向包含可离子化的脂质、磷脂、结构脂质和/或peg脂质中的每一者。在一些实施例中，lnp的核心可以包含可离子化的脂质和结构脂质，并且包含磷脂和/或peg脂质的一个或多个层可以随后包围该核心。例如，在一些实施例中，lnp可包含如下核心(其包含任何特定比例的可离子化的脂质(例如，dlin-mc3-dma或dlin-dma)和结构脂质(例如，胆固醇))，其被任何特定厚度的磷脂单层(例如，dspc)包围，其进一步被任何特定厚度的外部peg脂质单层包围。在一些实施例中，取决于预期靶细胞的性质以及待递送的经修饰的rna(例如像mrna)的特征，可以将经修饰的rna(例如，mrna)掺入核心或后续层的任何一层中。在一些实施例中，核心和外层可进一步包含通常掺入本领域已知的lnp中的其他组分。另外，在一些实施例中，可以选择构成lnp的可离子化的脂质、磷脂、结构脂质和/或peg脂质的摩尔百分比，以便提供整个lnp的特定物理参数，例如一种或多种脂质的表面积。例如，在一些实施例中，可以选择构成lnp的可离子化的脂质、磷脂、结构脂质和/或peg脂质的摩尔百分比，以获得表面积/磷脂(例如dspc)。在一些实施例中，可测定可离子化的脂质、磷脂、结构脂质和/或peg脂质的摩尔百分比，以获得约1.0nm2至约2.0nm2的表面积/磷脂(例如dspc)。除脂质组分外，在多个实施例中，本文披露的lnp和/或外泌体还包含至少一种经修饰的rna(例如，mrna)。如本文所用，术语“经修饰的rna”是指相对于参考(未经修饰的)rna序列(例如，天然存在的对应物)已经进行了修饰的任何核糖核酸(rna)序列。在一些实施例中，与参考rna相比，经修饰的rna包含一个或多个核苷/核苷酸的取代、缺失和/或插入。在一些实施例中，与参考rna相比，经修饰的rna包含一种或多种核苷/核苷酸的化学变化。在一些实施例中，例如，经修饰的rna可以包括至少一种被修饰以形成n1-甲基-伪-ump的尿苷单磷酸(ump)。在一些实施例中，所有经修饰的rna中的ump已经被n1-甲基-假ump替代。经修饰的rna不一定需要对参考rna进行物理操作。只要经修饰的rna序列与参考rna序列相比包含至少一种修饰，则无论其如何合成都被认为是“经修饰的”。在一些实施例中，经修饰的rna是低分子量经修饰的rna。在一些实施例中，经修饰的rna是高分子量经修饰的rna。在一些实施例中，经修饰的rna是经修饰的信使rna(mrna)。在一些实施例中，经修饰的rna是低分子量经修饰的mrna。在一些其他实施例中，经修饰的rna是高分子量经修饰的mrna。在一些实施例中，经修饰的rna编码促红细胞生成素多肽。在一些实施例中，经修饰的rna编码人促红细胞生成素多肽。在一些实施例中，经修饰的rna编码具有seqidno：1的促红细胞生成素多肽。表1列出了示例性的rna和氨基酸序列。如本文所用，当描述经修饰的rna时，术语“低分子量”是指长度小于约750、小于约650、小于约550、小于约450、小于约350、小于约250或小于约150个核苷酸的rna分子。如本文所用，当描述经修饰的rna时，术语“高分子量”是指长度大于约550、大于约650、大于约750、大于约850、大于约950、大于约1000、大于约1500或大于约2000个核苷酸的rna分子。如本文所述和例示的，示例性的高分子量rna是人促红细胞生成素mrna(seqidno：2；编码区，seqidno：3)。如本文所用，术语“外源的”是指在细胞或生物体外部起源或产生的物质或分子。在一些实施例中，递送到细胞或施用给受试者的经修饰的rna是外源rna(例如，外源mrna)。在一些实施例中，lnp和/或外泌体包含多个经修饰的rna(例如，mrna)。在一些实施例中，lnp和/或外泌体包含编码目的多肽或蛋白质的一种或多种经修饰的rna(例如，mrna)。在一些实施例中，lnp和/或外泌体包含可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比为约1∶1至约4∶1，或约4∶1、约3∶1、约2∶1、约1.1或小于约1∶1。在一些实施例中，lnp和/或外泌体包含可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比约为1∶1。在一些实施例中，lnp和/或外泌体包含可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比小于约1∶1，例如约0.1∶1、约0.2∶1、约0.3∶1、约0.4∶1、约0.5∶1、约0.6∶1、约0.7∶1、约0.8∶1或约0.9∶1。如本文所用，短语“可离子化的脂质：经修饰的rna核苷酸的摩尔比”是指本文披露的lnp和/或外泌体中可离子化的脂质与经修饰的rna核苷酸的近似摩尔比。在一些实施例中，lnp包含的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比为约2∶1至约4∶1、或约4∶1、约3∶1或约2∶1。在一些实施例中，lnp包含的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比为约3∶1。在一些实施例中，外泌体包含的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比为约1∶1至约3∶1、或约3∶1、约2∶1、约1∶1或小于约1∶1。在一些实施例中，外泌体包含的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比为约1∶1或小于约1∶1。在一些实施例中，外泌体包含的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比小于lnp包含的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比。在一些实施例中，外泌体包含的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比为约1∶1或小于约1∶1，并且lnp包含的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比为约3∶1。在多个实施例中，与包含大于约1∶1的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比的lnp或另一种替代性递送载体相比，包含约1∶1或小于约1∶1的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比的外泌体在宿主细胞和组织中可以是无毒的或毒性较小的。在一些实施例中，外泌体和lnp或替代性递送载体包含相同的可离子化的脂质(例如，dlin-mc3-dma或dlin-dma)和相同的经修饰的rna核苷酸，但是包含不同的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比。在一些实施例中，带中性电荷的经修饰的rna和/或外泌体(即，包含约1∶1的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比)能够跨过内体膜，而带正电的经修饰的rna和/或lnp(即，包含大于约1∶1的可离子化的脂质∶经修饰的rna核苷酸的摩尔比)不能跨过内体膜。组合物在多个实施例中，本披露提供了包含至少一种外泌体(例如，本文描述的任何外泌体)的药物组合物。在一些实施例中，药物组合物包含多种外泌体。如本文所用，术语“药物组合物”是指除适于施用于受试者的其他组分(例如药学上可接受的载体和/或赋形剂)之外的至少一种外泌体的制剂。本文提供的药物组合物的形式允许施用并随后提供一种或多种活性成分的预期生物学活性和/或达到疗效。本文提供的药物组合物优选不包含对将向其施用配制品的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。本文采用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人类和动物的组织接触而不产生过度毒性、刺激、过敏反应、或其他问题或并发症，同时具有相称的合理受益/风险比的化合物、材料、组合物、和/或剂型。药物审批机构(例如ema，us-fda)提供指导并审批药学上可接受的化合物、材料、组合物和/或剂型。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不会对受试者造成明显刺激并且不会消除组合物中所施用的外泌体的生物学活性和性质的载体或稀释剂。药学上可接受的载体可以增强或稳定组合物，或者可以用于促进组合物的制备。药学上可接受的载体可以包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。可以选择载体以最小化受试者的不良副作用和/或最小化一种或多种活性成分的降解。这些配制品中的任何一种中也可以包含佐剂。如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。肠胃外施用的配制品可以例如含有赋形剂如无菌水或盐水，聚亚烷基二醇如聚乙二醇，植物油或氢化萘。其他示例性赋形剂包括但不限于碳酸氢钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒和表面活性剂(包括例如聚山梨酯20)。本披露的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。给予的途径和/或方式可以根据所期望的结果而变化。在一些实施例中，施用是玻璃体内、静脉内、肌内、腹膜内或皮下施用。药学上可接受的载体应适合于玻璃体内、静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。在一些实施例中，包含至少一种外泌体和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物可以处于适于肠胃外施用的形式。在一些实施例中，药物组合物可以是无菌可注射的水性或悬浮液的形式，其可以根据已知程序进行配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的缓冲液中的无菌可注射悬浮液。外泌体中经修饰的rna的量和/或包含经修饰的rna与一种或多种载体或赋形剂组合以产生单一剂型的外泌体的数量将必然根据所治疗的受试者和特定施用途径而变化。通常，在本披露的药物组合物中采用治疗有效量或有效剂量的经修饰的rna和/或包含经修饰的rna的外泌体。可以通过本领域技术人员已知的常规方法将包含经修饰的rna的外泌体配制成药学上可接受的剂型。可以调整外泌体的剂量方案以提供最佳的期望反应(例如治疗反应)。例如，可以一次施用一次大剂量的外泌体，可以在预定的时间段内施用数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。对于任何特定的受试者，可以根据个人的需要以及治疗临床医生的专业判断，随时间调整具体的剂量方案。肠胃外组合物可以配制成剂量单位形式，以便于给药和剂量均匀。如本文所用，剂量单位形式是指适合作为用于待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位包含经计算以与需要的药用载体相关的产生期望疗效的预定量的一种或多种活性成分(即外泌体)。可以基于一种或多种活性成分的独特特征和要达到的特定疗效来选择包含至少一种外泌体的组合物的剂量值。医师或兽医能以低于达到期望疗效所需的水平开始本披露的外泌体或药物组合物的给药，并逐渐增加剂量直至达到期望的效果。通常，用于治疗障碍的本披露的外泌体或药物组合物的有效剂量可以根据多种不同因素而变化，这些因素包括施用方式、靶部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其他药剂、以及治疗是预防性还是治疗性的。选择的剂量水平还取决于多种药代动力学因素，包括所采用的具体外泌体或药物组合物的活性，施用途径，施用时间，排泄率，治疗持续时间，与所采用的具体外泌体或药物组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗的患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况和既往病史、以及类似因素。可以滴定治疗剂量以优化安全性和功效。本文提供的外泌体和药物组合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养或动物模型中的标准制药工艺来确定。例如，可以确定ld50、ed50、ec50和ic50，并可以将毒性和疗效之间的剂量比(ld50/ed50)计算为治疗指数。从体外和体内测定获得的数据可用于评估或配制用于人类使用的剂量范围。在多个实施例中，用于本文描述的治疗应用的试剂盒也在本披露的范围内。在多个实施例中，本披露提供了包含至少一种外泌体的试剂盒。在多个实施例中，试剂盒包含多种外泌体。在多个实施例中，试剂盒还包含一种或多种另外的组分，包括但不限于：使用说明书；其他试剂，例如第二治疗剂；用于制备用于施用的外泌体的装置、容器或其他材料；药学上可接受的载体；以及将外泌体施用于受试者的装置、容器或其他材料。使用说明书，无论是插入物还是标签，都可以包括治疗应用指南(包括建议的剂量和/或施用方式)。在多个实施例中，试剂盒包含有效量的外泌体或包含至少一种外泌体的药物组合物(例如本文描述的任何外泌体或药物组合物)，以及使用该外泌体或药物组合物治疗或预防障碍的说明书。方法在多个实施例中，本披露提供了将经修饰的rna递送至细胞的方法，该方法通过使该细胞与有效量的外泌体或包含至少一种外泌体的药物组合物(例如，本文描述的任何外泌体或药物组合物)接触，从而将该经修饰的rna递送至该细胞。在多个实施例中，本披露还提供了有效量的外泌体或包含至少一种外泌体的药物组合物(例如，本文描述的任何外泌体或药物组合物)在将经修饰的rna递送至细胞中的用途。如本文所用，术语“递送”意指向目的地提供实体。例如，在一些实施例中，将经修饰的rna递送至细胞可以包括使细胞与至少一种包含经修饰的rna的外泌体或包含至少一种包含经修饰的rna的外泌体的药物组合物接触。在一些实施例中，向受试者递送经修饰的rna可以包括向受试者施用至少一种包含经修饰的rna的外泌体或包含至少一种包含经修饰的rna的外泌体的药物组合物。将至少一种外泌体或包含至少一种外泌体的药物组合物施用于哺乳动物组织或受试者可包括使一个或多个细胞与所述外泌体或药物组合物接触。如本文所用，术语“施用”是指通过导致外泌体和/或药物组合物组分至少部分定位在所需部位或组织位置的方法或途径将至少一种外泌体和/或包含至少一种外泌体的药物组合物放置在哺乳动物组织或受试者体内。术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用，是指用本文描述的方法和组合物向其提供治疗(包括预防性治疗)的任何人或非人动物。对于治疗对特定动物如人受试者具有特异性的病状或疾病状态，术语“受试者”是指该特定动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如，哺乳动物和非哺乳动物)，例如任何哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括人、小鼠、大鼠、兔、狗、猴和猪。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，使细胞与有效量的外泌体或药物组合物接触包括将外泌体或药物组合物添加至体外细胞培养物中或将外泌体或药物组合物施用于受试者。在一些实施例中，细胞存在于体外细胞培养物中。在一些实施例中，细胞获自受试者。在一些实施例中，细胞存在于受试者中。在一些实施例中，细胞是上皮细胞、免疫细胞、祖细胞或干细胞。在一些实施例中，细胞是b淋巴细胞、t淋巴细胞或单核细胞。在一些实施例中，将经修饰的rna递送至细胞不改变细胞世代时间。在其他实施例中，将经修饰的rna递送至细胞确实改变了细胞世代时间。在一些实施例中，将经修饰的rna递送至细胞不改变以按重量计的总细胞蛋白含量。在其他实施例中，将经修饰的rna递送至细胞确实改变了按重量计的总细胞蛋白含量。在多个其他实施例中，本披露还提供了本文披露的外泌体和药物组合物的治疗性方法和用途，例如用于治疗障碍。在一些实施例中，外泌体是从获自患有障碍和/或需要治疗的受试者的细胞中分离的。例如，在某些方面，本披露提供了治疗或预防受试者的障碍的方法，该方法通过向受试者施用有效量的外泌体或包含至少一种外泌体的药物组合物(例如，本文描述的任何外泌体或药物组合物)进行，其中外泌体包含有效治疗该障碍的经修饰的rna。在某些其他方面，本披露提供了有效量的外泌体或包含至少一种外泌体的药物组合物(例如，本文描述的任何外泌体或药物组合物)在治疗或预防受试者的障碍中的用途，其中外泌体包含有效治疗该障碍的经修饰的rna。在某些其他方面，本披露提供了治疗或预防受试者的障碍的方法，该方法通过以下步骤进行：(a)提供从该受试者获得的一个或多个细胞；(b)在允许细胞摄取脂质纳米颗粒(lnp)的条件下，使该一个或多个细胞与包含经修饰的rna的一个或多个lnp接触；(c)分离由该一个或多个细胞产生的外泌体，其中至少一个分离的外泌体包含该经修饰的rna；以及(d)向该受试者施用有效量的该分离的外泌体，其中该经修饰的rna有效治疗该障碍。在一些实施例中，细胞是上皮细胞、免疫细胞、祖细胞或干细胞。在一些实施例中，细胞是b淋巴细胞、t淋巴细胞或单核细胞。如本文所用，术语“治疗”及其同根词是指疾病、障碍或病状(例如贫血、骨髓增生异常、免疫或炎性疾病、单基因障碍(例如神经退行性疾病)或复杂疾病(例如，心肌梗塞或癌症)或其至少一种可识别的症状的缓解。在一些实施例中，“治疗”是指改善患者不一定可辨别的至少一个可测量的物理参数。在一些实施例中，“治疗”是指物理上(例如，可辨别症状的稳定)、生理上(例如，物理参数的稳定)或两者上抑制疾病、障碍或病状的进展。在一些实施例中，“治疗”是指减慢疾病、障碍或病状的进展或逆转其进展。如本文所用，“治疗”及其同根词还涵盖延迟给定疾病、障碍或病状的发作或降低罹患其的风险。术语“疾病”或“障碍”在本文中可互换使用，并且是指身体或一些器官状态的任何改变，中断或干扰功能的表现和/或引起患病的人或与人接触的那些诸如不适、功能障碍、危难、或甚至死亡的症状。疾病或障碍也可与瘟热、病态(ailing)、小病(ailment)、病疾(malady)、患病(sickness)、病(illness)、主诉(complaint)、不舒服或感染有关。在一些实施例中，障碍选自贫血、骨髓增生异常、免疫或炎性疾病、单基因障碍(例如神经退行性疾病)和复杂疾病(例如，心肌梗塞或癌症)。在一些实施例中，障碍是贫血。在一些实施例中，障碍是骨髓增生异常。在一些实施例中，障碍是炎性肠病。在一些实施例中，经修饰的rna编码促红细胞生成素多肽。在一些实施例中，经修饰的rna编码人促红细胞生成素多肽。在一些实施例中，经修饰的rna编码具有seqidno：1的促红细胞生成素多肽。如本文所用，术语“有效量”是指含有经修饰的rna的外泌体的或包含含有经修饰的rna的外泌体的药物组合物的、足以减少疾病或障碍的至少一种或多种症状或提供期望的效果的量。例如，它可以是引起与伤口愈合有关的症状或临床标志的治疗上显著减少的量。在外泌体或包含至少一种外泌体的药物组合物的背景中术语“有效量”是指外泌体或药物组合物的足以在靶组织和/或细胞类型中递送经修饰的rna并调节蛋白质表达的量。在一些实施例中，外泌体或药物组合物的有效量是足以治疗与由经修饰的rna表达的蛋白质相关的疾病或障碍的量。在一些实施例中，本文披露的外泌体和药物组合物可以减少和/或抑制免疫反应(例如，用替代治疗(例如，lnp)观察到的免疫反应)的至少一种生物标记或症状的表达或活性。在一些实施例中，与使用替代性递送载体(例如，lnp)的治疗方法相比，本文披露的治疗性方法减少和/或抑制促炎性标记(例如，细胞因子、趋化因子)的产生或数量。促炎性标记的非限制性实例包括细胞因子和趋化因子，例如l-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-8、il-9、ip-10、il-12(p40)、il-12(p70)、il-13、il-15、il-16、il-17、kc、mcp-1、exotaxin、碱性fgf(fgf-basic)、g-csf、gm-csf、lif、mig、mip-1、mip-2、mcp-1、inf-γ、infα2、rantes、tnfα、和il-1β。如本文所用，短语“减少和/或抑制”是指与对照水平相比约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的变化(阳性或阴性)。如本文所用，术语“对照水平”表示未处理的样品或受试者，或在不存在外泌体的情况下处理的样品或受试者。在一些实施例中，对照水平是在不存在外泌体的情况下处理的对照样品或受试者中的表达或活性水平(例如，一种或多种促炎性标记的表达水平)。在一些实施例中，与不存在外泌体或不存在不包含经修饰的rna的外泌体的情况下的治疗相比，受试者在存在包含经修饰的rna的外泌体的情况下对治疗的免疫和/或炎症反应降低。在一些实施例中，所降低的免疫和/或炎症反应包括至少一种细胞因子的水平的增加或减少。在一些实施例中，所降低的免疫和/或炎症反应包括至少一种细胞因子的水平的降低，其中该细胞因子选自il-6、ip-10、rantes、mcp-1和kc。在一些实施例中，在人血清存在下进行一个或多个细胞与lnp的接触。在一些实施例中，人血清以体积计约0.5％、约1％或约1.5％存在。在一些实施例中，人血清以体积计约1％存在。在一些实施例中，使一个或多个细胞与lnp接触包括使该一个或多个细胞与至少2个、至少3个或至少4个不同剂量的该lnp接触。在一些实施例中，使一个或多个细胞与lnp接触包括使该一个或多个细胞与至少3个不同剂量的该lnp接触。在一些实施例中，分离外泌体包括从体外细胞培养基的样品分离外泌体。实例以下实例提供了本披露内容的说明性实施例。本领域普通技术人员将认识到可以在不改变本披露内容的精神或范围的情况下进行多种修改和变型。此类修改和变型涵盖在本披露内容的范围内。所提供的实例绝不限制本披露内容。i.材料和方法脂质纳米颗粒(lnp)的配制和表征如前所述，通过沉淀mrna与四种不同脂质组分，制备了两种不同类型的lnp，即包含经修饰的hepomrna(858个核苷酸)(5mec，ψ)(trilink)的dlin-mc3-dma(mc3-lnp)和dlin-dmalnp(dd-lnp)(yanezarteta等人.(2018)pnas115(15)：e3351-60)。这四种组分包括在低ph下可电离(阳离子)的可离子化的脂质(dlin-mc3-dma或dlin-dma)；两种辅助脂质(dspc和胆固醇)；和聚乙二醇化脂质(peg2000-dmpe)。通过混合溶解在milliq-水中的mrna、100mm柠檬酸盐缓冲液(ph3)和milliq-水，制备hepomrna的水溶液，以给出50mm柠檬酸盐溶液。用四种脂质组分(可离子化的脂质∶dspc∶胆固醇∶peg2000-dmpe＝50∶10∶38.5∶1.5摩尔百分比)的组合物制备乙醇(99.5％)中的脂质溶液，总脂质含量为12.5mm。将mrna和脂质溶液在nanoassemblr(精度纳米系统公司(precisionnanosystems))微流体混合系统中以aq∶etoh＝3∶1的体积混合比和12ml/min的恒定总流速混合。混合时，可离子化的脂质上的氮原子与mrna链上的磷原子之比等于3.1。如果制备“空”lnp(即不含任何mrna的lnp)，则将乙醇相与仅50mm柠檬酸盐缓冲液(ph3)混合。弃去制备的最初0.35ml和最后0.05ml的lnp溶液，同时收集剩余体积作为样品级分。使用与上述相同的程序(但代替hepomrna，将花青素5-egfp-mrna掺入lnp)制备了含有花菁5-egfp-mrna(996个核苷酸)(5mec，ψ)(trilink)的mc3-lnp和dd-lnp。为了表征配制的lnp，将25μl的样品级分注入975μl的10mm磷酸盐缓冲液(ph7.4)中，并在malvernzetasizer(zetasizernanozs，马尔文仪器有限公司(malverninstrumentsltd.))上测量光强平均粒径(z-平均值)。立即将样品级分转移至slide-a-lyzerg2透析盒(10000mwco，赛默飞世尔科技公司(thermofischerscientific)中，并在4℃下针对pbs(ph7.4)透析过夜。pbs缓冲液的体积为样品级分体积的650-800x。然后收集样品级分。从该体积中，将25μl注入975μl的10mm磷酸盐缓冲液(ph7.4)中，并再次测量粒径(透析后的粒径)。通过quant-itribogreen测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司)测量最终mrna浓度和包封率(ee)。细胞培养人上皮htb-177(nci-h460)细胞系购自美国典型培养物保藏中心(atcc)，并按照atcc指南描述的进行培养。在37℃和5％co2的存在下，向含有碳酸氢钠而不含丙酮酸钠和hepes的rpmi-1640生长培养基(西格玛奥德里奇公司(sigmaaldrich))补充10％的外泌体耗尽的胎牛血清(fbs)(西格玛奥德里奇公司)、1％的l-谷氨酰胺(2mm)(赛默飞世尔科技公司)和1％青霉素-链霉素(10,000u/ml)(赛默飞世尔科技公司)。通过使用70ti转子(贝克曼库尔特公司(beckmancoulter))在optimal-100xp超速离心机上于4℃以120,000xg进行2小时超速离心使热灭活的fbs外泌体耗尽，以及通过0.2μm过滤器过滤外泌体耗尽的上清液。从健康捐赠者那里获得的新鲜血沉棕黄层从萨尔格伦斯卡大学医院(瑞典哥德堡)获得，并通过密度梯度离心分离外周血单核细胞(pbmc)。将pbmc在完全rpmi-1640生长培养基(补充有l-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠、1％青霉素-链霉素、β-巯基乙醇和10％fbs(外泌体耗尽的))中培养，并用山羊抗-人iga/igg/igmf(ab’)2片段(2.5μg/ml；杰克逊免疫研究实验室公司(jacksonimmunoresearchlaboratories，inc.))和豆蔻酰佛波醇乙酯(pma)(1μg/ml；invivogen公司)刺激。经由lnp将mrna递送到上皮细胞将人上皮(htb-177)细胞以3×106细胞/175t烧瓶的密度接种在30ml生长培养基中，并孵育24小时。24小时孵育期后，在1％人血清(西格玛奥德里奇公司)存在下，用含100μg的hepomrna的1ml的dd-lnp或mc3-lnp/瓶处理细胞。在1ml的lnp溶液中的这种100μg的hepomrna按以下3个不同剂量施用：第(1)天200μllnp(20μgmrna)；第(2)天400μllnp(40μgmrna)；第(3)天400μllnp(40μgmrna)，并在96小时后收获。将用等体积(200μl、400μl、400μl)相应的空dd-lnp或空mc3-lnp(即不含mrna的lnp)处理的细胞以及未经处理的细胞用作阴性对照。外泌体胞外囊泡(ev)的分离和表征如前所述，从lnp处理的细胞和阴性对照的调理培养基分离ev(el-andaloussi等人.(2012)natprotoc.[自然实验室指南]7(12)：2112-26)。简而言之，为了去除细胞碎片，将经培养的培养基在4k15离心机(西格玛公司(sigma))上于4℃以3000xg离心15min。收集所得的上清液并在4℃下以60,000xg超速离心35min，然后通过0.2μm过滤器过滤以获得直径小于200nm的ev。然后将经过滤的上清液在4℃下以120,000xg超速离心70min以沉淀ev。将ev沉淀物重悬于适当体积(50-80μl)的pbs(西格玛奥德里奇公司)中。所有超速离心步骤均使用70ti转子(贝克曼库尔特公司)在optimal-100xp超速离心机上进行。ev根据其蛋白质浓度进行定量。将2μl的ev悬浮液与2μl的m-per哺乳动物蛋白提取试剂(赛默飞世尔科技公司)一起在54℃在超声波清洗器(vwr)上超声处理5min，以生成ev提取物。使用qubit2.0荧光计(赛默飞世尔科技公司)对ev蛋白进行定量。将1μl的ev、1μl的qubit蛋白试剂和198μl的qubit缓冲液混合并在室温下孵育15min。在qubit2.0荧光计上记录读数。施用lnp后从ev和细胞分离rna根据制造商的说明，使用mircurytmrna分离试剂盒-细胞和植物(exiqon)从ev和lnp处理的细胞分离出总rna。使用qubit2.0荧光计(赛默飞世尔科技公司)定量总rna。使用nanodrop1000(赛默飞世尔科技公司)评估rna质量(230/260比率)。用于确定ev大小和浓度的纳米颗粒跟踪分析(nta)使用配备hamamatsuc11440-50b/a11893-02相机的nanosightlm10仪器(马尔文帕纳科公司(malvernpanalytical))评估htb-177mc3-ev和未经处理的ev的大小(nm)和浓度(颗粒/ml)。在分析之前，将颗粒在0.1μm过滤的pbs(西格玛公司)中稀释500倍，以减少视野中的颗粒数量为每帧少于180个颗粒。在散点模式下进行了三次独立的测量(生物重复)。取决于单个样本和手动监控温度，以调整后的相机水平(10-16)和检测阈值(5-15)，在各自以25帧/秒(fps)60秒捕获的5幅照片中获得每个ev样本的测量读数。模糊(blur)和最大跳跃距离(maxjumpdistance)设置为自动。使用nanosightfluorescentntalm10软件版本3.3(马尔文帕纳科公司)进行读数、采集和数据分析。ev中lnp来源的外源hepomrna的检测和基于qpcr的定量使用实时定量pcr(rt-qpcr)对ev、lnp施用后其亲代细胞的裂解物、以及相应的阴性对照中的hepomrna进行定量。基于rna产量，使用高容量cdna试剂盒(赛默飞世尔科技公司)将0.25至1μg的总evrna和细胞总rna转化为cdna。根据制造商的说明，使用viiatm7仪器(赛默飞世尔科技公司)上的taqman探针测定法，将100ng的总cdna用于hepomrna定量。逆转录2μg的纯hepomrna(来自trilink的rna)，并将所得cdna进行系列稀释(十倍)以制备7个标准品(最高点：100ng)，将其以三次技术重复运行以生成标准曲线。随后，使用evcdna和细胞cdna进行hepomrna分析；相对于标准曲线内插绝对定量，最小r2＞0.975。gapdh用作内部对照。为了计算hepomrna的摩尔量，假定如下：1摩尔hepomrna＝858hepomrna核苷酸。ev标记(cd63和cd9)的检测以及cd63/cd9阳性ev中外源mrna的鉴定如上描述，用含有100μg的cy5-mrna(trilink)的mc3-lnp处理htb-177细胞。包括未经处理的细胞(作为对照)。96小时后，通过差速超离心(预富集)从lnp处理的细胞(mc3-ev)和未经处理的细胞(ev)的培养基中分离出总ev、重悬于pbs中并定量。预富集后，使用基于亲和力的方法分离cd63/cd9阳性ev，并通过facs评估cy5-mrna的存在。根据制造商的说明，使用针对细胞培养基的外泌体-人cd63分离/检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司)将cd63阳性ev固定在顺磁性dynabeads磁珠上。在结合反应中，将20μl的顺磁性dynabeads磁珠与25μg或50μg的总mc3-ev一起孵育。作为阴性对照，将20μl的顺磁性dynabeads磁珠与当量体积的pbs(无ev)一起孵育。固定cd63阳性ev后，根据制造商的说明用小鼠抗人pe-cd9抗体(bdpharmingen，目录号555372)对ev进行染色。在bdfacslyric系统(bd生物科学公司(bdbiosciences))上获得ev，并检测到cd9和cy5-mrna。使用flowjo软件(树星公司(treestarinc.))分析数据。实验以生物重复进行。在不存在细胞的情况下将mrna从lnp直接转移至ev的分析将lnp和ev直接混合，并使用不同比例(量)的lnp和ev在37℃下孵育(无细胞)。在37℃在30ml的pbs中，将300μl的dd-lnp或mc3-lnp(39μg的hepomrna)与先前未经任何处理的两个不同比例(量)的ev一起孵育2小时。在第一种设置中，ev和lnp之间的比例为200μgev+300μllnp(1x)，而在第二种设置中，比例为50μgev+300μllnp(4x)。孵育2小时后，通过超速离心重新分离ev，从ev分离总rna，并通过qpcr定量hepomrna以评估hepomrna从lnp进入ev的直接转移。作为阴性对照，将当量体积的dd-lnp或mc3-lnp在不含ev的pbs中孵育并超速离心。作为阳性对照，向细胞施用含hepomrna的dd-lnp或mc3-lnp，并分离ev(分别为dd-ev或mc3-ev)。分离rna，并通过qpcr定量hepomrna。实验以三次生物重复进行。数据表示为在ev中检测到的hepomrna相对于lnp向细胞递送的hepomrna的施用量或与ev直接混合的hepomrna的量的百分比。显示了重复的平均值，带有标准偏差(sd)。ev-mrna保护实验如上描述，用含有100μg的hepomrna的mc3-lnp处理htb-177细胞。包括未经处理的细胞(作为对照)。96小时后，对ev进行了分离和定量。首先，为了评估rna酶a活性(赛默飞世尔科技公司)的效率，将280ng的纯hepomrna(trilink)与rna酶a(0.5μg/μl)或等体积的pbs在37℃孵育20分钟。接下来，使用相同条件用rna酶a处理200μg的mc3-ev。作为阴性对照，将200μg的mc3-ev和150μg的未经处理的ev在相同条件(除用pbs代替rna酶a外)下孵育。孵育后，使用mircurytmrna分离试剂盒-细胞和植物(exiqon)从ev分离总rna。通过qpcr对hepomrna进行定量，以评估rna酶a对ev外部存在的hepomrna含量的影响。实验以三次生物重复进行。梯度uplc分析ev中可离子化的阳离子脂质使用ev的级分来检查ev中lnp来源的可离子化的脂质的存在。用pbs将5-10μl的每个ev样品(获得自mc3-lnp处理的细胞和dd-lnp处理的细胞)稀释50倍，再用2％w/v的x-100于tris/edta缓冲液中的混合物以1+1稀释。将样品在37℃下孵育30min，然后注射到与singlequaddetector(sqd，单四极杆检测器)(沃特世(waters))联接的acquityultraperformancelc上。分析柱为watersacquitycshc18，1.7μm，2.1x100mm，保持在60℃。使用0.1％甲酸的水溶液(a)和0.1％甲酸的乙腈和异丙醇等摩尔混合物(b)作为流动相，流速为0.50ml/min。进行梯度运行，其中将0.0min时的10％b在1.0至5.0min时增加至85％b，并保持在85％b至7.5min。梯度运行中包括在7.6min至9.5min时99％b的洗涤步骤。然后，将10％b用于9.6min至12.0min的调理。在这些条件下，dlin-dma的洗脱时间为6.3min，而dlin-mc3-dma的洗脱时间为6.5min。使用溶解在99.5％乙醇中的dlin-dma和dlin-mc3-dma的外标溶液确定定量。sqd使用电喷雾、正离子模式运行，并用dlin-mc3-dma溶液使用自动调谐进行调谐。对于每个阳离子脂质，以m+1使用单离子记录(sir)记录阳离子脂质。最后，确定了ev和lnp中可离子化的脂质和hepomrna核苷酸的摩尔比(可离子化的脂质/hepomrna)。实验至少六次生物重复进行。hepo蛋白定量lnp处理后，收集细胞经调理上清液并直接用于hepo蛋白检测，而在1％停止蛋白酶抑制剂混合物(赛默飞世尔科技公司)的存在下，使用500μl的m-per哺乳动物蛋白提取试剂(赛默飞世尔科技公司)从细胞裂解物中提取总细胞蛋白。简而言之，将细胞在三维bio-rocker上于4℃轻轻搅拌10min，然后以14,000×g离心10min以沉淀细胞碎片。将所得的上清液(包含蛋白质)转移至新试管中。平行地，将经培养的上清液在4k15离心机(西格玛公司)上于4℃以3000xg离心15min以去除细胞碎片。将所得的上清液转移至新管中。根据制造商的说明，还使用促红细胞生成素elisa试剂盒(干细胞技术公司)在ev裂解物中分析hepo蛋白。将2μl的ev悬浮液与2μl的m-per哺乳动物蛋白提取试剂(赛默飞世尔科技公司)一起孵育，并在54℃在超声波清洗器(vwr)上超声处理5min，以生成ev提取物。使用qubit2.0荧光计(赛默飞世尔科技公司)根据制造商的方案对培养的上清液中的总细胞蛋白和总蛋白以及总ev蛋白进行了定量。为了检测hepo蛋白，根据制造商的说明使用了促红细胞生成素elisa试剂盒(干细胞技术公司)。使用50μl总蛋白溶液(用于细胞和培养的上清液)，并根据相对标准曲线以mu/ml计算hepo蛋白水平。使用转换(119mu＝1ng)将浓度转换为fg/ml，并标准化为细胞总数。lnp施用对细胞生长、rna和蛋白质含量的影响为了确定lnp对细胞行为的影响并评估细胞对lnp处理(dd-lnp或mc3-lnp)的耐受性，在用dd-lnp或mc3-lnp处理96小时后，计算细胞世代时间(细胞生长)、细胞总rna、细胞内蛋白质的总含量以及分泌的蛋白质的总含量。还通过量化用lnp处理后的总evrna和蛋白质含量来检查lnp对ev的影响。使用以下公式，基于处理间隔开始时和结束时细胞数量之间的差值(δn)计算细胞世代时间(g)(定义为将细胞群体增加一倍的时间(以小时计))：g＝t/nt＝lnp施用间隔(h)将细胞和ev中的总rna、ev中的总蛋白质、细胞中的总蛋白质(细胞内)和培养的上清液中的总蛋白质(分泌的)的变化标准化为相应的δn(细胞数量的变化)。经由ev将hepomrna递送至人上皮(htb-177)细胞将人上皮(htb-177)细胞以5×106细胞/t175烧瓶的密度接种，并在rpmi-1640完全培养基中培养。将从mc3-lnp处理的细胞分离出的600μg的mc3-ev(700nghepomrna)和从dd-lnp处理的细胞分离出的600μg的dd-ev(1100nghepomrna)溶解在rpmi-1640培养基中并经两天通过独立测定转移到受体细胞中：第(1)天300μg的mc3-ev，第(2)天300μg的mc3-ev(两个150μg的单独剂量，间隔8小时)。同样，在独立的测定中，将300μg的dd-ev(第1天)和300μg(第2天)转移到受体细胞中。将空ev(不含hepomrna)和来自未经处理的细胞的ev作为对照递送至受体细胞。48小时后，收集细胞和培养的上清液，并分离总rna。根据上述方案，分别通过rt-qpcr和elisa评估hepomrna和hepo蛋白。实验以两次独立的生物重复进行。经由ev将花菁5-egfp-mrna递送至上皮和原代血细胞根据上述方案，除了1ml的含76μg荧光cy5-egfp-mrna的lnp/瓶之外(相比之下，hepomrna为100μg/ml)，将1ml的含荧光花菁5(cy5)-egfp-mrna的dd-lnp以不同剂量(200μl、400μl、400μl)递送至htb-177细胞。施用lnp后96小时，收获调理培养基(上清液)以及亲代细胞，并分析hepomrna和hepo蛋白，或储存以用于进一步的实验。空dd-lnp(无mrna)和未经处理的细胞用作对照。以2x105细胞/孔的密度接种htb-177细胞和从外周血单核细胞(pbmc，如上所述从血沉棕黄层分离)纯化的b细胞、t细胞和单核细胞等免疫细胞，在96孔圆底板中在200μl的培养基中培养，并在37℃、5％co2下孵育过夜。对培养的细胞进行24小时刺激后，将于25μlpbs溶液中的含cy5-egfp-mrna(trilink)的78μg的dd-ev递送至受体细胞。为了进行对照分析，将空dd-ev(不含egfp-mrna)和未处理的ev(来自未经处理的细胞的ev)递送至细胞，或不对细胞进行处理。在ev处理5小时、24小时和48小时后，收获细胞并用针对cd19(b细胞)、cd3(t细胞)和cd14(单核细胞)(bd生物科学公司(becton-dickinsonbiosciences))的单克隆抗体(mab)进行表面标记染色。在facsverse(bd生物科学公司)上获得细胞。基于每种细胞类型中的荧光检测cy5-egfp-mrna，并使用flowjo软件(树星公司)分析数据。ph对从lnp释放hepomrna的影响将含有hepomrna的浓度为0.011mg/ml的mc3-lnp在含有150mmnacl(ph7.4、6.6或5.8)的10mm柠檬酸-na2hpo4缓冲溶液中在静态条件下于37℃孵育。在ribogreen测定中，使用0.125mmtritonx-100(vwr蛋白质组学格雷德公司(vwrproteomicsgrade))和0.125mm十二烷基硫酸钠(西格玛公司)在零时测量mrna的总量。为了评估在各种ph(ph7.4、6.6或5.8)下从lnp释放的mrna的比例，使用珀金埃尔默(perkinelmer)ls55发光光谱仪(ex：480nm，em：525nm)用quant-itribogreenrna试剂检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司的英杰公司(invitrogen))分析了mrna的游离量。hepomrna经由ev和mc3-lnp的体内转移实验程序已获瑞典哥德堡区域实验动物伦理委员会(theregionallaboratoryanimalethicscommitteeofgothenburg，sweden)批准(伦理申请号83-2015)。所有程序均符合瑞典动物福利法和规定sjvfs2012：26。9-10周龄的c57bl6/ncrl雌性小鼠(n＝36)购自查尔斯河实验室(charlesriverlaboratory，德国)，并饲养在瑞典默恩达尔阿斯利康(astrazeneca，sweden)的动物设施中。将小鼠按标准条件(21℃rt、12：12h光照-黑暗周期、45％-55％湿度)分组(4只小鼠/笼)，可以自由摄取普通饮食(r70，lactaminab)和水。提供了环境丰容(纸箱、木制压舌板和棉窝垫)。将含相等剂量的1.5μg的hepomrna的、100μl的mc3-lnp来源的ev或mc3-lnp静脉注射给小鼠(n＝4/组)。将100μl的pbs注入对照小鼠。注射ev和lnp后第2、5、24和48小时，通过隐静脉(venasaphena)微采样从每组(n＝4)小鼠采集血液样品。将收集在35μl备有edta的毛细管中的血液样品以1700xg离心以收集血浆，将血浆在-86℃冷冻直至进行分析。注射后5、24和96小时，处死各组小鼠以收集器官。通过异氟烷麻醉使小鼠镇静，并从眶窦放血，然后切开心脏。随后，收集整个器官(肝、肾、脾、胰腺、心脏、胸腺、肺和脑)，在液氮中速冻并保存在-86℃直至进行分析。小鼠血浆中人epo蛋白的检测为了在经由mc3-lnp和mc3-ev递送hepomrna后分析小鼠血浆中的hepo蛋白，在gyros平台上内部开发了hepo测定。使用ez-linksulfo-nhs-lc-biotin试剂盒(赛默飞世尔科技公司，#21327)根据试剂盒说明书对捕获抗体(3f6，maiiadiagnostics公司)进行生物素化。使用单克隆抗体标记试剂盒(赛默飞世尔科技公司，#a20186)对检测抗体(7d3，maiiadiagnostics)进行alexa647标记。使用hepo蛋白(内部)来在rexxipa缓冲液(gyrosproteintechnologies公司)中生成标准曲线，范围为12.2pg/ml至50ng/ml。在分析之前，将小鼠血浆样品在rexxipa-max缓冲液(gyrosproteintechnologies公司)中以1∶1(v∶v)稀释。使用gyrolab仪器(gyrolabxp工作站，gyrosproteintechnologies公司)在gyrolabbioaffy1000cd(gyrosproteintechnologies公司)上分析样品。标准曲线使用5参数曲线拟合。所有标准品和样品的cv均低于10％。小鼠组织中人epo蛋白的检测根据制造商的说明，使用m-per哺乳动物蛋白提取试剂(赛默飞世尔科技公司)在1％停止蛋白酶抑制剂混合物(赛默飞世尔科技公司)的存在下从器官中提取总蛋白。简而言之，将20-70mg的组织在组织裂解仪ii(tissuelyserii，凯杰公司(qiagen))中通过添加蛋白酶抑制剂(赛默飞世尔科技公司)在200-350μl的裂解缓冲液(取决于组织重量)中以最大速度(30hz)裂解3-5min，并在10,000xg下于4℃离心15min，以清除所有组织碎片。使用qubit2.0荧光计(赛默飞世尔科技公司)将所得上清液用于蛋白质定量。根据制造商的说明，使用促红细胞生成素elisa试剂盒(干细胞技术公司)对50μl的总蛋白进行hepo蛋白检测分析。将每个器官中的hepo蛋白的量(ng)标准化为相对器官重量(g)。小鼠血浆中的细胞因子分析静脉内施用mc3-lnp和mc3-ev后，通过emdmillipore的小鼠细胞因子磁珠试剂盒(merckkgaa，#mcytomag-70k)测量小鼠细胞因子的血浆浓度，以同时定量il-6、kc、mcp-1、rantes、tnfα、ifn-γ、il-1β和ip-10。首先用测定缓冲液以1∶2稀释样品，然后与标准品和质控品一起置于96孔板中。添加含有磁珠的溶液；磁珠是涂有特异性抗体的磁性微球。将混合物在4℃孵育过夜，然后与链霉亲和素-pe偶联物孵育以完成每个微球表面的反应。在分析仪biorad上对板读数。鉴定每个单独的微球，并基于荧光报告信号定量其生物测定结果。使用中值荧光强度(mfi)数据，使用5-参数逻辑曲线拟合方法测量浓度。小鼠器官中人epomrna的检测根据制造商的建议，使用rneasy试剂盒(凯杰公司)从小鼠器官分离总rna。将10-50mg的组织在组织裂解仪ii(凯杰公司)中在rlt缓冲液(600μl)中以最大速度(30hz)裂解3-4min，并在10,000xg下于20℃离心3min，以清除所有组织碎片。随后，将上清液转移至柱上并进一步处理。使用qubit2.0荧光计(赛默飞世尔科技公司)定量rna，并使用nanodrop1000(赛默飞世尔科技公司)评估rna质量。基于rna产量，将0.5至1μg的总rna反转录为cdna，并根据上述方案使用rt-qpcr用100ng检测hepomrna。将每个器官中的hepomrna的量(μg)标准化为相对器官重量(g)。统计学分析对于所有实验，使用graphpadprismv.7(graphpad公司)进行统计分析。通过使用不成对双尾学生t检验对体外数据进行分析；lnp施用对htb-177生长、rna含量和蛋白质含量的影响除外，其均使用单因素anova、然后使用tukey多重比较检验进行分析(显著性p值＜0.05)。使用不成对双尾学生t检验对小鼠血浆和器官中的hepo含量进行分析；而使用单因素anova、然后是sidak多重比较检验对小鼠血浆中的细胞因子水平进行分析。p值的显著性水平表示如下：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，以及****p＜0.0001。ii.结果实例1：脂质纳米颗粒(lnp)的表征本文描述的实验中使用的lnp由五个主要组分构成，即可离子化的脂质(dlin-mc3-dma或dlin-dma)、dspc(1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、胆固醇、聚乙二醇化脂质(peg2000-dmpe)和mrna(hepomrna)。含有dlin-mc3-dma可离子化的脂质的lnp称为mc3-lnp；含有dlin-dma可离子化的脂质的lnp称为dd-lnp。两种lnp配制品均针对几个生物物理参数进行了表征，包括负载效率、平均大小、多分散指数(pdi)和各个lnp组分之间的摩尔百分比(表2)。在表2中的数据表示为平均值±平均值的标准误(sem)(mc3-lnp，n＝4；dd-lnp，n＝9)。hepomrna构建体在lnp中的负载效率(定义为包封率(％ee))介于93％-97％之间。含有mrna构建体的lnp的测量的平均大小在82-90nm之间。lnp中的hepomrna构建体浓度为0.1mg(100μg)。lnp中各个组分之间的摩尔百分比为50∶10∶38.5∶1.5(dlin-dma∶dspc∶胆固醇∶peg2000-dmpe)和50∶10∶38.5∶1.5(dlin-mc3-dma∶dspc∶胆固醇∶peg2000-dmpe)。具有两种不同的可离子化的脂质dlin-dma和dlin-mc3的示例性lnp的结构示于图8a中。实例2：经由lnp将hepomrna递送至细胞研究了经由两种不同的lnp配制品将编码人促红细胞生成素(hepo蛋白)的mrna递送至细胞。通过确定细胞内hepomrna的量以及在细胞内和细胞外环境中产生的hepo蛋白的量来检查经由dlin-dma-lnp(称为dd-lnp)和dlin-mc3-lnp(称为mc3-lnp)递送mrna的功效。在独立实验中，将100μg的hepomrna经由dd-lnp或mc3-lnp转移至人上皮(htb-177)细胞。lnp处理96小时后，在受体细胞的裂解物中定量hepomrna。还对受体细胞的裂解物中以及经细胞培养的培养基上清液中的hepo蛋白进行了定量。lnp的两种配制品均能够将hepomrna递送至细胞(图1a)。lnp的两种配制品还导致由外源递送的mrna引起的hepo蛋白产生，受体细胞缺乏该hepo蛋白(图1b和图1c)。与dd-lnp相比，mc3-lnp向细胞递送的hepomrna量显著更高。同样，相对于dd-lnp递送，观察到mc3-lnp递送后hepo蛋白的量显著更高。相比于胞质(图1b)，在胞外级分(图1c)中检测到已被表征为分泌蛋白的较高量的hepo蛋白(bettan等人.(2000)molther.[分子疗法]2(3)：204-10；shapir等人.(2015)humgenetherclindev.[人类基因治疗的临床发展]26(4)：216-27)。纳米颗粒已经显示出引起细胞应激并改变细胞行为(panariti等人.(2012)nanotechnolsciappl.[纳米技术，科学与应用]5：87-100；halamodakenzaoui等人.(2012)biochemj.[生物化学杂志]441(3)：813-21；petersen等人.(2011)eurjpharmbiopharm.[欧洲药物和生物药物杂志]79(1)：150-61)。纳米颗粒还可以由于其化学组成和/或mrna含量而诱导自噬溶酶体活化(klionsky等人.(2016)autophagy[自噬]12(1)：1-222；mizushima等人.(2011)annurevcelldevbiol.[细胞与发育生物学年度综述]27：107-32；yang和klionsky(2010)natcellbiol.[自然细胞生物学]12(9)：814-22；zabirnyk等人.(2007)autophagy[自噬]3(3)：278-81)。为了确定dd-lnp或mc3-lnp是否可能影响细胞生长、总rna合成和/或蛋白质产生，用lnp处理细胞96小时后收获htb-177上皮细胞。收获后，计数细胞并计算世代时间(即，将细胞群体增加一倍的时间(以小时计))。lnp处理后，特别是用含有hepomrna的lnp处理后，细胞世代时间显著增加(图8b)。这表明，与接受空lnp(不含hepomrna)或不接受lnp(未经处理的细胞)相比，接受含hepomrna的lnp时细胞的生长速度可能较慢。在用不含mrna的lnp处理的细胞中，总rna含量略有增加但是没有达到统计学显著性(图8c)。lnp处理后细胞内蛋白质的总含量保持不变(图8d)。然而，在用dd-lnp，特别是具有hepomrna的那些处理后，细胞外环境中分泌的蛋白的总含量显著增加(图8e)。ev的总rna和蛋白质含量的定量含有hepomrna的lnp对细胞衍生的胞外囊泡(ev)的影响的评估表明，用mrna负载mc3-lnp处理的细胞中ev的总rna含量高于未经处理的细胞或用mrna负载dd-lnp处理的细胞中ev的总rna含量。用mc3-lnp、特别是含hepomrna的mc3-lnp处理后，ev的总rna含量增加(图8f)。这表明，经mc3-lnp处理后，细胞rna可最终出现在ev中。另外，mc3-lnp处理后总ev蛋白含量增加(图8g)。综上所述，这些结果表明当细胞接受lnp时，它们可分泌更多的蛋白质，并且可以在培养的上清液和分泌的ev中检测到分泌的蛋白质(图8e和图8g)。因此，lnp的施用可引起细胞应激，导致细胞生长和/或细胞分泌的蛋白质的量的改变。ev的大小确定和浓度通过纳米颗粒跟踪分析(nta)针对大小和浓度对ev进行了表征。来自未经处理的细胞的平均值±semev众数大小(从三次重复样品测量)为100.2±3.7nm，而来自mc3-lnp处理的细胞的为116.4±9.23nm(图16a和图16b；另请参阅表3-8)。来自未经处理的细胞的平均值±semev浓度(从三次重复样品测量)为5.81x1011±2.25x1010颗粒/ml，而来自mc3-lnp处理的细胞的为1.25x1012±1.54x1011颗粒/ml。表3.未经处理的ev(i)。平均值107.2+/-2.4nm众数93.5+/-3.4nm标准偏差(sd)35.0+/-2.7nmd1070.3+/-2.2nmd50102.7+/-1.5nmd90146.8+/-8.5nm颗粒/ml5.77x1011+/-2.39x1010表4.未经处理的ev(ii)。平均值127.5+/-4.8nm众数101.3+/-3.2nm标准偏差(sd)53.7+/-5.4nmd1084.1+/-2.3nmd50114.0+/-1.9nmd90180.8+/-13.1nm颗粒/ml6.09x1011+/-2.031010表5.未经处理的ev(iii)。平均值125.2+/-4.2nm众数103.9+/-4.5nm标准偏差(sd)44.2+/-5.6nmd1083.5+/-2.6nmd50114.7+/-2.6nmd90179.6+/-11.7nm颗粒/ml5.58x1011+/-2.34x1010表6.mc3-ev(i)。平均值98.6+/-5.2nm众数83.7+/-7.9nm标准偏差(sd)41.0+/-3.0nmd1062.1+/-3.5nmd5088.7+/-5.0nmd90145.9+/-10.0nm颗粒/ml1.78x1012+/-3.35x1011表7.mc3-ev(ii)。平均值160.0+/-5.3nm众数109.7+/-10.2nm标准偏差(sd)70.3+/-3.1nmd1095.4+/-2.0nmd50137.1+/-5.1nmd90263.9+/-8.3nm颗粒/ml1.70x1012+/-1.12x1011表8.mc3-ev(iii)。平均值228.9+/-9.7nm众数155.9+/-9.6nm标准偏差(sd)89.4+/-7.8nmd10139.9+/-4.0nmd50204.1+/-9.0nmd90364.5+/-26.0nm颗粒/ml2.94x1011+/-1.37x1010实例3：ev中lnp来源的可离子化的脂质和mrna的检测研究表明，大多数lnp递送的rna经历了溶酶体降解和/或胞吞循环途径，而只有很少一部分从内体逃逸；例如，据估计lnp递送的sirna的净流出可能小于2％(semple等人.(2010)natbiotechnol.[自然生物技术]28(2)：172-6；sahay等人.(2013)natbiotechnol.[自然生物技术]31(7)：653-8；sahay等人.(2010)jcontrolrelease[控释杂志]145(3)：82-95)。与这些结果一致，本文进行和描述的实验还表明，通过递送lnp-mrna，在lnp处理的细胞的胞质中可以检测到少于1％的施用的mrna(图1d)。经由含dlin-mc3-dma的lnp配制品递送的mrna的内体逃逸比经由含dlin-dma的lnp配制品递送的mrna约高两倍。不希望受到理论的束缚，假设胞吞(lnp的摄取)和胞吐之间可存在联系，因为某些被胞吞的lnp组分可最终出现在分泌的内体来源的ev中(“外泌体”或“内体-ev”)(图1e)。为了研究lnp递送的mrna和lnp的其他组分在被细胞摄取时的命运，在向细胞施用lnp(100μg的hepomrna)96小时后，通过qpcr对ev中的hepomrna进行定量。结果表明，由lnp处理的细胞分泌的内体-ev获得了hepomrna(图1f)。使用相同施用剂量的hepomrna，从mc3-lnp处理的细胞获得的内体-ev包含比从dd-lnp处理的细胞获得的内体-ev高近1000倍的hepomrna(图1f)。值得注意的是，lnp处理的细胞的胞质及其分泌的ev中的hepomrna定量均表明，与mrna加dlin-dma配制品相比，mrna加dlin-mc3-dma配制品表现出更多的内体逃逸。使用dlin-mc3-dma配制品，在ev中也检测到更多的mrna(图1d和图1f)。此外，在ev中分析了lnp可离子化的脂质(dlin-mc3-dma或dlin-dma)的存在。转移到细胞中的mc3-lnp和dd-lnp含有3∶1摩尔比(mol/mol)的可离子化的脂质：hepomrna核苷酸(图1g)。还发现从lnp处理的细胞分泌的ev包含可离子化的脂质。然而，与lnp相比，ev包含较少的可离子化的阳离子脂质/hepomrna分子(图1h和图1i)。ev包含1∶1摩尔比(mol/mol)的可离子化的脂质：hepomrna核苷酸(图1j)。对于uplc-ms分析，将dlin-mc3-dma样品溶于乙醇、1％(w/w)tritonx-100或含添加的、固定量的“空”ev的1％(w/w)tritonx-100中，并注入到uplc-ms系统中。与溶解在纯乙醇中的样品的反应相比，tritonx-100样品(含有和不含“空”ev)的反应要低，但是估计量化误差小于10％(图18)。考虑到样品制剂的差异(用于mrna和脂质定量)以及qpcr(mrna)和uplc-ms(脂质)分析，仍然有可能将mrna和可离子化的脂质作为复合的化学计量盐(1∶1)共转运进入分泌的ev中。此外，对于不同的ev样品，在使用qpcr测量的核苷酸浓度和使用uplc-ms确定的脂质浓度之间观察到强相关(图1j)。由于在lnp递送后在胞质中检测到hepomrna且其被翻译成hepo蛋白(图1a-c)，并且在分泌的ev中检测到hepomrna(图1f)，因此进行实验以测试ev是否已从lnp处理的细胞获得了hepo蛋白质。简而言之，裂解从lnp处理的细胞分离的ev，并通过人促红细胞生成素elisa分析hepo蛋白。在ev中未检测到hepo蛋白，表明产生的hepo蛋白可源自经由ev递送的hepomrna(数据未显示)。此外，还评估了lnp和ev在细胞外相互作用以及将lnp-mrna直接转移到ev中的可能性。将ev与含有hepomrna的lnp直接混合(在没有细胞的情况下)。孵育2小时后，重新分离ev，并评估ev中hepomrna的存在。结果显示，当在不存在细胞的情况下与lnp直接混合时，ev是hepomrna阴性的(图9)，这表明lnp不会将hepomrna直接转移至细胞外的ev。而是，当用lnp处理细胞时，ev可经由lnp的胞吞获得mrna。实例4：经由ev将hepomrna递送至上皮细胞和免疫细胞上述实验表明，在lnp的胞吞后，外源hepomrna可以掺入内体-ev中(图1f和图9)。接下来，研究了(a)然后ev是否可以通过充当递送载体将外源hepomrna转运至受体细胞；和(b)经由ev递送至细胞的hepomrna具有功能，即可以翻译该mrna以产生hepo蛋白。将从mc3-lnp处理的细胞分离出的mc3-ev和从dd-lnp处理的细胞分离出的dd-ev转移到受体htb-177上皮细胞。递送hepomrna96小时后，收集细胞及其培养的上清液，并通过人促红细胞生成素elisa评估hepo蛋白。在细胞裂解物中以及在受体细胞(即缺少hepo蛋白并且自身不表达hepo蛋白的细胞)的培养的上清液中可检测到hepo蛋白(图10a-c)。与mc3-lnp的细胞递送一致(图1b和图1c)，相对于dd-ev介导的hepo递送(图10c)，mc3-ev介导的hepomrna递送显示了更高水平的hepo蛋白产生。基于lnp的递送导致对细胞行为的某些不利影响(图8c-e)。相反，使用含有hepomrna的ev或缺乏hepomrna的ev，基于ev的递送不影响细胞世代时间或细胞蛋白质含量(图10d-f)。这表明，对基于lnp的递送应激的细胞可能对基于ev的递送更具耐受性。接下来，检查了ev是否可以将外源mrna(即hepomrna)递送至免疫细胞，而免疫细胞通常很难用其他递送载体进行转染。从健康人血沉棕黄层分离出外周血单核细胞(pbmc)并接种。在适当的免疫细胞刺激下过夜孵育后，将含有cy5-egfp-mrna的dd-ev(源自dd-lnp处理的细胞)分别持续5小时、24小时和48小时以单剂量递送至受体细胞。在经由ev转移cy5-egfp-mrna的不同间隔(5小时、24小时、48小时)后收获细胞，并用针对cd19(b细胞)、cd3(t细胞)和cd14(单核细胞)(bd生物科学公司)的表面标记单克隆抗体(mab)染色。进行facs分析以检测受体细胞中的cy5-egfp-mrna，并且基于抗体荧光和cy5-荧光来估计每种包含cy5-egfp-mrna的细胞类型的百分比。在ev介导的mrna递送5小时后，在受体免疫细胞中可检测到cy5-egfp-mrna，表明ev可将mrna递送至免疫细胞(图2b-d和图11)。在ev递送24小时后，近70％的htb-177细胞呈现cy5-egfp-mrna的摄取(图2a)。ev递送5小时、24小时和48小时后，分别有6％、30％和40％的b细胞含有cy5-egfp-mrna(图2b)。5小时ev递送，17％的t细胞和71％的单核细胞包含cy5-egfp-mrna(图2c和图2d)。实例5：经由ev将人epomrna递送至小鼠在确定内体-ev可以在体外递送hepomrna后，研究了这些ev是否还能够在体内递送外源mrna(即hepomrna)。在体内施用hepomrna之前，从未经处理的健康c57bl6/ncrl小鼠采集血液，并通过人促红细胞生成素elisa检查hepo蛋白，以确认受体小鼠缺乏且不表达人形式的epo蛋白(hepo)。如所预期的，未处理的小鼠的血浆是hepo蛋白阴性的(图12)。接下来，向c57bl6/ncrl小鼠注射单次静脉内剂量的mc3-ev(1.5μghepomrna/小鼠)，并在血浆和器官中检查hepo蛋白的产生。ev介导的hepomrna递送2小时后并持续24小时，在小鼠血浆中检测到hepo蛋白，表明ev可以将外源mrna递送给小鼠并引起目的蛋白的产生(图3)。另外，在不同时间点(5小时、24小时和96小时)处死的小鼠的八种器官中检查了hepomrna和hepo蛋白的存在。结果表明，ev不仅可以将hepomrna递送至不同的器官，而且还允许产生hepo蛋白，表明ev可以将功能性mrna递送至器官(图4a-p)。在心脏、肺、肝和脾中，可检测到hepomrna和hepo蛋白(图4a-h)。在心脏和肺中，在ev介导的mrna递送5小时后可检测到hepomrna以及翻译的hepo蛋白，并且持续24小时可检测到mrna(图4a-d)。在肝脏中，仅在ev递送5小时后可检测到hepomrna，但在5小时后并持续24小时可检测到翻译的hepo蛋白(图4e和图4f)。但是，在脾中模式相反。在脾中，hepomrna在5小时后并持续24小时可检测到，但是翻译的hepo蛋白仅在5小时后可检测到(图4g和图4h)。值得注意的是，在hepomrna阳性的所有四种器官中，肝是hepo蛋白含量最高的器官(图4f)，而脾是hepomrna含量最高的器官(图4g)。在5小时在脾中检测到的hepo蛋白的量与在其他器官中检测到的量相当。肾显示出相对少量的hepomrna，但是没有可检测到的蛋白(图4i和图4j)。在所分析的八种器官中的三种中(胸腺、胰腺和脑)，没有可检测到的hepomrna和hepo蛋白(图4k-p)。还使用mc3-lnp进行了平行实验，以检查lnp介导的hepomrna递送。给c57bl6/ncrl小鼠静脉内注射单剂量的mc3-lnp(1.5μghepomrna/小鼠)，并在血浆和器官中检查hepo蛋白的产生。数据显示，在lnp介导的hepomrna递送2小时后并持续5小时，血浆中可检测到hepo蛋白(图13)。另外，在lnp递送5小时、24小时和96小时后处死的小鼠的八种器官中分析了hepomrna和hepo蛋白的存在。在五种器官中可检测到hepomrna和hepo蛋白，特别是在心脏、肺、肝、脾和肾中(图14a-j)。在所有hepomrna和hepo蛋白阳性的器官中，在肾中检测到最多的hepomrna(持续24小时)，其次是脾(持续96小时)。在肝中检测到最多的hepo蛋白。然而，在心脏和肺中，注射后5小时检测到hepomrna和hepo蛋白两者。胸腺、胰腺和脑的hepomrna和hepo蛋白均为阴性(图14k-p)。综上所述，这些数据表明，ev可用作递送载体，以表达来自外源存在的mrna的任何目的蛋白质。实例6：经由ev或lnp将人epomrna递送至小鼠为了确定相对于mc3-lnp，ev递送hepomrna的效率如何，在体内基于lnp和ev的hepomrna递送后，比较了hepo蛋白的产生。在器官中，来自基于lnp的hepomrna递送的hepo蛋白的量与ev总体相当，但脾除外，脾的蛋白产生显示了显著差异，然后是心脏(差异显著较低)(图5)。与ev相比，对于lnp递送，血液中hepo蛋白的量更高(图5)。另外，检查了mc3-lnp和mc3-ev对组织重量的影响。mc3-lnp和mc3-ev对受体小鼠的器官重量没有显示出显著影响(图15a-h)。实例7：相对于lnp，ev引起减少的免疫/炎症反应为了研究与lnp相比，ev对受体小鼠的免疫原性是否较低，将单剂量的mc3-lnp(1.5μghepomrna/小鼠)和mc3-ev(每只小1.5μghepomrna/小鼠)静脉内注射到c57bl6/ncrl小鼠中。在两个时间间隔(5小时和24小时)在小鼠血浆中测定通常参与免疫和炎症反应的8种不同细胞因子的浓度。注射后5小时检测到的几种促炎性细胞因子(尤其是il-6、ip-10、rantes、mcp-1和kc)的分泌水平在lnp递送后显著高于ev递送后的水平(图6a-e)。这些结果表明，lnp的全身递送可引起炎症反应升高，而ev的免疫原性较低，并且似乎被受体小鼠很好地耐受。尽管lnp可比ev产生更多的hepo蛋白(图5)，但lnp可比ev更具免疫原性，这可能使ev成为将治疗性rna递送给人类患者的更安全的载体。实例8：检测ev标记和cd63/cd9阳性ev中的外源mrna为了确认ev携带lnp-mrna，用或不用含100μg的cy5-mrna的mc3-lnp对htb-177细胞进行处理。96小时后，通过差速超离心从lnp处理的细胞(mc3-ev)和未经处理的细胞(ev)的培养基中分离出总ev、重悬于pbs中并定量。将25μg或50μg的总mc3-ev或未处理的总ev与20μl的顺磁性dynabeads磁珠(结合有抗cd63抗体)一起孵育，并使用外泌体-人cd63分离/检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司)特异性分离cd63阳性ev。然后用小鼠抗人pe-cd9抗体(bdpharmingen，目录号555372)对cd63阳性ev染色，并通过facs对cy5-mrna检测进行分析。facs分析表明，来自未经处理的细胞的大约96％的免疫沉淀的ev(50μg测定)是cd63和cd9阳性的、但是mrna阴性的。相比之下，来自lnp-mrna处理的细胞的大约88％的免疫沉淀的ev(50μg测定)是cd63和cd9阳性的，而26％包含在含有cy5-mrna的lnp胞吞后分泌的mrna(cy5-mrna)(图17a)。在阴性对照(仅磁珠和源自未经处理的细胞的cd63/cd9阳性ev)中未检测到cy5-mrna信号，表明mrna由ev(cd63/cd9阳性ev)携带。实例9：ev-mrna保护实验为了确认mrna位于ev内并且受到保护，而不是与ev膜相关联，将含有hepomrna的mc3-ev暴露于rna酶处理。rna酶处理后，从ev中分离总rna并通过qpcr定量hepomrna。尽管rna酶具有有效的内切核酸酶活性(关于无ev的rna显示的)，但与未经rna酶处理的mc3-ev相比，在rna酶处理的mc3-ev中仅观察到hepomrna含量降低了2ct倍数变化。实验以三次生物重复(n＝3)进行，并且hepomrnaqpcr数据表示为散点图加平均标准偏差(sd)(图17b)。将源自未经处理的细胞(未经rna酶处理)的ev用作阴性对照。尽管递送的mrna的一小部分可能会附着在ev的外膜层上，但发现大多数hepomrna均受到保护而免除核酸内切酶活性作用，并且存在于ev中。当前第1页12