2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶在制备耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌感染药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体的指2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶在制备耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌感染药物中的应用。

背景技术：

铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌，也是我国医院内感染的常见致病菌之一，铜绿假单胞菌的感染多发于重症监护室感染，其感染者往往伴随其他复杂感染，治疗难度很大。铜绿假单胞菌对多种抗生素天然耐药，以往临床上经常使用第三、四代头孢菌素，但由于广谱抗生素的大量使用，出现了越来越多的耐β-内酰胺类抗生素的铜绿假单胞菌菌种。碳青霉烯类抗生素是目前抗菌谱最广，抗菌活性最强的非典型β-内酰胺抗生素，常见的有美罗培南和亚胺培南，已经成为治疗严重细菌感染最主要的抗菌药物之一。但由于此药的抗菌谱非常广，使用非常广泛，也导致了耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌菌株的不断涌现，常常导致非常严重的并发感染，为临床治疗带来了巨大的挑战。因此，解决治疗耐碳青霉烯的铜绿假单胞菌感染的问题，具有十分重要的实际应用价值。

铜绿假单胞菌中的mexab-oprm外排泵系统是铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药最主要的外排泵系统，mexa基因是此外排泵系统中的一个关键调控基因，该系统表达的相应蛋白质会将已经进入细菌内部的碳青霉烯类药物主动运出，从而使药物在细菌内的浓度下降，导致细菌无法被有效杀灭。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对上述背景技术的不足，提供2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶在制备治疗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌感染药物中的应用，所述2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶的结构式如式ⅰ所示：

进一步，所述2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶使用量为5μm时，最低可以使耐碳青霉烯的铜绿假单胞菌菌株的mexa基因的相对表达量降低为0.067。

进一步，所述2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶使用量为5μm时，最低可以使耐碳青霉烯的铜绿假单胞菌菌株的最低抑菌浓度(美罗培南)降低为2μg/ml。

进一步，2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶与美罗培南合用制成治疗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌感染药物。

进一步，所述2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶制备的药品类型为注射剂、粉针剂、口服剂、口含片、喷雾剂、胶囊剂、栓剂等。

本发明使用2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶可以通过和mexa基因的调控因子形成g-四链体结构，影响该基因的转录，对该基因的下游产物的表达产生影响，从而抑制了mexab-oprm外排泵系统对美罗培南的主动外排，因此该化合物与碳青霉烯类抗生素美罗培南合用时，可以降低耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌对美罗培南的最低抑菌浓度，对部分菌株达到使用常规剂量的美罗培南治疗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌感染的作用。

本发明的优点在于：

1.本发明对2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶开发了新的医疗用途，作为治疗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌感染药物会产生可观的经济效益。

2.本发明使用的2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶可以人工合成，合成产品纯度高，能够保证工业化生产。

3.本发明的六氮杂十六元环铜配合物性质稳定，可以作为多种剂型使用，如：注射剂、粉针剂、口服剂、口含片、喷雾剂、胶囊剂、栓剂等。

附图说明

图1为mexa基因核心序列和2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶作用前后的圆二色光谱谱图。

图2为mexa基因核心序列和2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶作用前后的圆二色光谱变温曲线谱图。

图3为mexa基因和2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶作用前后的相对表达量结果。

图4为铜绿假单胞菌和2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶作用前后的最低抑菌浓度(mic值)结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

实施例1：2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶诱导mexa基因核心序列形成g-四链体结构的验证。

1.实验仪器

圆二色光谱仪购自于英国应用光学物理公司

2.实验药品与试剂

2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶购自于艾览(上海)华工科技有限公司，短链mexa核心序列来自genebank(id:877855),dna购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，序列为5’-ggcggcggtggagcag-3’，三甲基氨基甲烷(tris)购自于华美生物工程公司，2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶高浓度储备液为20mm，使用dmso溶解。

3.实验方法

体系1：含终浓度为10μmmexadna和10mm的tris-hcl，总体积200μl，不足部分蒸馏水补齐。

体系2：含终浓度为10μm的mexadna和10mm的tris-hcl，10μm的2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶，总体积200μl，不足部分蒸馏水补齐。

设定圆二色光谱仪测试波长为230-310nm，分别扫描体系1和2的谱图。

4.实验结果

由附图1结果可以看出，单纯的单链dna峰出现在257nm附近，加入2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶后出现了295nm附近的正峰和265nm附近的正峰，表明了反平行结构的g-四链体的生成。该结果表明2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶可以诱导mexa基因核心序列形成g-四链体结构。

实施例2：2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶诱导mexa基因核心序列形成g-四链体结构的稳定性验证。

1.实验仪器

圆二色光谱仪购自于英国应用光学物理公司

2.实验药品与试剂

2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶购自于艾览(上海)华工科技有限公司，短链mexa核心序列来自genebank(id:877855),dna购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，序列为5’-ggcggcggtggagcag-3’，三甲基氨基甲烷(tris)购自于华美生物工程公司，2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶高浓度储备液为20mm，使用dmso溶解。

3.实验方法

体系1：含终浓度为20μmmexadna和10mm的tris-hcl，总体积200μl，不足部分蒸馏水补齐。

体系2：含终浓度为20μm的mexadna和10mm的tris-hcl，20μm的2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶，总体积200μl，不足部分蒸馏水补齐。

设定圆二色光谱仪测试波长为265nm，温度由10℃程序逐步升温至85℃，每一摄氏度分别扫描体系1和2的谱图，使用origin8软件分别计算出体系1和体系2的半解链温度。

4.实验结果

dna的半解链温度可以代表g-四链体的稳定性，半解链温度越高，g-四链体结构越稳定。由附图2结果可以看出，未加入2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶时，mexa核心序列dna的半解链温度为32.7℃，加入2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶后，mexa核心序列dna的半解链温度上升至46.2℃，半解链温度上升了13.5℃。该结果表明2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶可以诱导mexa基因启动区域核心序列形成稳定的g-四链体结构。

实施例3：2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶抑制耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌中mexa基因表达的验证。

1.实验仪器

荧光定量pcr仪购自于美国bio-rad公司，nanodrop2000超微量分管光度剂购自于美国赛默飞公司，隔水式恒温培养箱购自于上海树立仪器仪表有限公司。

2.菌株

收集某医院微生物检验室2018年7月至12月分离的铜绿假单胞菌菌株，排除同一病人的重复菌株，根据中华医学会和卫生部颁布的抗菌药物敏感性试验执行标准(第二十二版)鉴定出其中耐碳青霉烯类抗生素的铜绿假单胞菌菌株，共收集11株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌菌株。质控菌株采用铜绿假单胞菌atcc27853，购自于广东环凯微生物科技有限公司。

3.实验药品与试剂

2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶购自于艾览(上海)华工科技有限公司，m-h肉汤粉购自于英国oxoid公司，血平板购自于合肥天达生物有限公司，trizol细菌rna分离试剂盒购自于美国赛默飞公司，primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser和sybrpremixextaqii试剂盒购自于宝生物工程(大连)有限公司，pcr引物购自于生工生物工程(上海)有限公司，rnasefreedepc水购自于碧云天生物技术有限公司。m-h肉汤配制：称取m-h肉汤粉10.5g溶于500ml蒸馏水中，待充分溶解后用氢氧化钠或盐酸调整溶液ph至7.0，高压蒸汽灭菌，4℃保存备用。2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶高浓度储备液为20mm，使用dmso溶解。

4.实验方法

4.1.菌株培养。

从菌种保存管复种铜绿假单胞菌，转种于血平板上35℃空气环境下培养18小时，挑取单个菌落，分别置于10mlm-h肉汤或含5μm2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶的m-h肉汤中，35℃摇菌培养20小时。

4.2铜绿假单胞菌总rna提取

取2ml步骤4.1所得菌液于ep管中，按照trizol细菌rna分离试剂盒说明书进行操作，提取所得rna溶解于rnasefreedepc水中，使用nanodrop2000测定rna浓度。

4.3荧光定量pcr

1)将步骤4.2所得的rna逆转录成cdna，逆转录步骤按primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒说明书进行。

2)将上述操作所得的cdna进行荧光定量pcr扩增，扩增时的反应条件和体系按照sybrpremixextaqii试剂盒说明书进行操作。选取16srrna作为内参，以atcc27853菌株为阳性对照，以rnasefreedepc水为阴性对照。mexa基因和16srrna均平行测定三个重复孔。分别计算得到每个样本每个基因的三个重复孔的平均ct值。荧光定量pcr结果采用广泛使用的2^-△△ct法进行计算：△ct值为目的基因的ct值-内参基因的ct值，△△ct值为加入2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶孵育菌种的△ct值-未加入2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶孵育菌种的△ct值。

5.实验结果

荧光定量pcr结果可以直观的反应目的基因的表达量，ct值与扩增片段的拷贝数成反比。样品的△ct值约小，2^-△△ct越大，基因的表达水平越高。由附图3结果可以看出，5μm的2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶和铜绿假单胞菌共同培养20小时后，11株菌株中有9株菌株的mexa基因的相对表达量出现了不同程度的下降，最低下降为0.067(pa6)，该结果表明2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶可以抑制这些铜绿假单胞菌菌株中mexa基因的表达。两株菌株mexa基因的表达量无明显变化(pa7和pa11)。由于铜绿假单胞菌耐碳青霉烯类抗生素的机制比较复杂，mexa基因调控的mexab-oprm外排泵系统是其主要耐药机制，这两株铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药的原因可能是其他外排泵系统所致。

实施例4：2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶降低耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌最低抑菌浓度(mic值)的验证。

1.实验仪器

麦氏比浊仪购自于北京天安联合科技有限公司，隔水式恒温培养箱购自于上海树立仪器仪表有限公司。

2.菌株

收集某医院微生物检验室2018年7月至12月分离的铜绿假单胞菌菌株，排除同一病人的重复菌株，根据中华医学会和卫生部颁布的抗菌药物敏感性试验执行标准(第二十二版)鉴定出其中耐碳青霉烯类抗生素的铜绿假单胞菌菌株，共收集11株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌菌株。质控菌株采用铜绿假单胞菌atcc27853，购自于广东环凯微生物科技有限公司。

3.实验药品与试剂

2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶购自于艾览(上海)华工科技有限公司，m-h肉汤粉购自于英国oxoid公司，血平板购自于合肥天达生物有限公司，美罗培南购自于日本住友制药株式会社。m-h肉汤配制：称取m-h肉汤粉10.5g溶于500ml蒸馏水中，待充分溶解后用氢氧化钠或盐酸调整溶液ph至7.0，高压蒸汽灭菌，4℃保存备用。美罗培南高浓度储备液为20mg/ml，蒸馏水溶解。2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶高浓度储备液为20mm，使用dmso溶解。

4.实验方法

4.1.菌株培养。

从菌种保存管复种铜绿假单胞菌，转种于血平板上上35℃空气环境下培养18小时。

4.2微量肉汤稀释法

1)使用无菌棉挑选单个菌落，溶于灭菌生理盐水中，配制成0.5麦氏浊度的菌种悬浮液，再用m-h肉汤稀释100倍。

2)配制美罗培南对倍稀释系列培养基，美罗培南浓度范围0.5-256μg/ml。

3)配制含有2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶的美罗培南对倍稀释系列培养基，2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶的浓度为5μm，美罗培南浓度范围0.5-256μg/ml。

4)将菌液接种到上述步骤2,3所配制的对倍稀释系列培养基中，35℃摇菌培养20小时。

实验结果根据中华医学会和卫生部颁布的抗菌药物敏感性试验执行标准(第二十二版)进行判定。

5.实验结果

微量肉汤稀释法可以直观的看出铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素美罗培南的敏感程度。根据中华医学会和卫生部颁布的抗菌药物敏感性试验执行标准(第二十二版)规定，对于铜绿假单胞菌菌株，最低抑菌浓度mic值≥8μg/ml时定义为美罗培南耐药，不能使用该药物治疗相应菌株导致的感染；mic值为4μg/ml时定义为美罗培南中介，使用该药物治疗相应菌株导致的感染时需提高剂量；mic值≤2μg/ml时定义为美罗培南敏感，使用该药物治疗相应菌株导致的感染时常规剂量有效。由附图4结果可以看出，未加入2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶培养时，所有11株菌株的mic值均大于8μg/ml，均为美罗培南耐药菌株，无法使用常规剂量的美罗培南治疗该菌株所引起的感染。5μm的2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶和铜绿假单胞菌共同培养20小时后，11株菌株中有9株的mic值出现了明显的下降，最低使mic值降低了16倍(pa6)，最低的mic值降低为2μg/ml(pa5)。其中三株(pa3,pa6,pa10)对美罗培南表现为中介，一株(pa5)对美罗培南表现为敏感,说明该菌株所引起的感染可以使用美罗培南进行治疗。五株(pa1,pa2,pa4,pa8,pa9)由于其本身的mic值太高，加入2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶共同孵育后mic值虽然有明显下降，但仍然≥8μg/ml的耐药定义值，定义为美罗培南耐药。因其mic值已明显下降，如果没有其它抗生素可用的情况下，一般认为在其mic值≤16μg/ml的情况下，可以尝试增大美罗培南的剂量治疗相应菌株导致的感染。两株菌株(pa7和pa11)的mic值无明显变化，这和实施例3的结果一致，可能是由于这两株铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药的机制是其他外排泵系统所致。

因此，综合以上实验结果说明本发明使用的2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶可以和铜绿假单胞菌中mexa基因的核心序列形成g-四链体结构，从而抑制了其关键耐药因素mexab-oprm外排泵系统的表达。通过药敏实验验证2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶可以降低耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌对美罗培南的最低抑菌浓度，对部分菌株达到使用常规剂量的美罗培南治疗耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌感染的作用。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。