一种含叶酸分子的还原响应型维生素E聚乙二醇琥珀酸酯胶束及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束及其制备方法和应用，属于生物医药材料技术领域。

背景技术：

多药耐药(multidrugresistance，mdr)是指肿瘤细胞对某一化疗药物产生耐药性后，对其他无接触过的、化学结构不同且作用靶点和机理都不同的化疗药物也产生交叉耐药的现象，是临床化疗失败的主要原因。多药耐药的产生与运转蛋白密切相关，由于肿瘤细胞膜上的多药耐药的相关蛋白以及p-糖蛋白的过表达会将药物向外输出泵出，从而导致抗肿瘤的药物在细胞里面的集聚会减少。

纳米技术通过将化学治疗药物包载或者结合到纳米载体上面，从而将药物更加准确地运送到目标细胞内，这为规避多药耐药提供了新的思路与前景。维生素e聚乙二醇琥珀酸酯(tpgs)是一种维生素e相关的衍生物，是水溶性的，它是由维生素e琥珀酸酯羧基以及聚乙二醇所酯化成的。tpgs胶束能运转受到糖蛋白所阻滞的一些药物，增加药物在体内的吸收率。tpgs在药剂学中使用比较多，首先tpgs是在用作难溶的药物的促进吸收剂以及增溶剂的时候，会自己形成胶束，并能将药物包裹在它自身里面，由此可以增加药物在水中的溶解程度。

目前商品化的维生素e聚乙二醇琥珀酸酯(tpgs)的主要成分为聚乙二醇与维生素e琥珀酸酯，但该结构的tpgs不具有肿瘤主动靶向性及肿瘤微环境刺激响应行为，由此制备的胶束不能将抗肿瘤药物或成像对比剂通过主动靶向作用富集与肿瘤部位及在肿瘤细胞内实现快速释放。虽然目前已经有报道指出可通过化学反应制备含叶酸分子或含二硫键结构的tpgs衍生物，但同时含有叶酸及二硫键结构的tpgs尚未见有报道。构建一种含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束将有可能实现抗肿瘤药物的靶向传送、智能控制释放及能克服肿瘤细胞的对化疗药物的耐药性。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束，所述胶束包括如下重量份的组分：含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯10份、阿霉素1～2份、超顺磁性氧化铁纳米粒子1～2份，所述含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的结构式如下式所示：

本发明针对现有的维生素e聚乙二醇琥珀酸酯衍生物不能同时具有肿瘤靶向性及肿瘤微环境响应的不足，重新设计与制备一种能同时满足肿瘤靶向性及能对肿瘤微环境作出响应的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯。首先选择商品化的烯丙基聚乙二醇为原料，通过多步化学反应制备得到α-叶酸，ω-叠氮基聚乙二醇；然后通过维生素e琥珀酸酯与炔丙基氨基甲酸乙基二巯基乙胺反应，得到含炔基及二硫键的维生素e衍生物；最后通过高效的点击反应制备得到目标产物含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯。随后通过两亲性聚合物的自组装作用成功实现了对疏水性抗肿瘤药物阿霉素及磁共振成像对比剂氧化铁纳米粒子的包载，制备得到可实现肿瘤诊断与治疗于一体化的纳米平台。该诊疗一体化纳米平台对耐药细胞具有显著的生长抑制作用，同时具有较好的小动物磁共振对比增强效果，在肿瘤一体化应用与研究中具有一定的优势。

本发明含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束为球形，直径大小为100纳米。

本发明含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束的内核由疏水的维生素e组成，胶束亲水外由链接有叶酸分子的聚乙二醇构成，二硫键则起到连接亲水链段与疏水链段的作用，胶束的疏水内核部分负载阿霉素与氧化铁纳米粒子。

作为本发明所述胶束的具体实施方式，所述胶束包括如下重量份的组分：含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯10份、阿霉素1.5份、超顺磁性氧化铁纳米粒子1.5份。

作为本发明所述胶束的具体实施方式，所述含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的制备方法包括以下步骤：

(1)对甲基苯磺酸烯丙基聚乙二醇酯的制备：将烯丙基聚乙二醇溶于无水二氯甲烷中，冰水浴下搅拌，然后加入对甲基苯磺酰氯、三乙胺，继续搅拌，室温反应，反应完成后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，分离得到有机相，减压蒸馏，得到对甲基苯磺酸烯丙基聚乙二醇酯；

(2)α-烯丙基，ω-叠氮基聚乙二醇的制备：将步骤(1)得到的对甲基苯磺酸烯丙基聚乙二醇酯溶于去离子水中，加入叠氮钠反应，反应完成后冷却至室温，加入二氯甲烷，萃取、分离，减压蒸馏等到α-烯丙基，ω-叠氮基聚乙二醇；

(3)α-氨基，ω-叠氮基聚乙二醇的制备：将步骤(2)得到的α-烯丙基，ω-叠氮基聚乙二醇溶于去离子水中，氩气保护，然后加入半胱胺盐酸盐、过硫酸铵，发生反应，反应完成后用氢氧化钠溶液调节反应液ph值，二氯甲烷萃取、减压蒸馏，得到α-氨基，ω-叠氮基聚乙二醇；

(4)α-叶酸，ω-叠氮基聚乙二醇的制备：将步骤(3)得到的α-氨基，ω-叠氮基聚乙二醇溶于无水二甲基亚砜，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，再加入叶酸，待叶酸完全溶解后于室温下避光反应，反应完成后将混合溶液装入透析袋透析，收集透析液，冷冻干燥，得到α-叶酸，ω-叠氮基聚乙二醇；

(5)含炔基及二硫键的维生素e衍生物的制备：将维生素e琥珀酸酯溶于无水二氯甲烷，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，充分溶解后加入炔丙基氨基甲酸乙基二巯基乙胺，于室温下避光反应，反应完成后减压蒸馏，用二甲基亚砜溶解产物，用透析袋透析纯化，收集透析液，冷冻干燥，得到含炔基及二硫键的维生素e衍生物；

(6)含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的制备：将步骤(4)所制备的α-叶酸，ω-叠氮基聚乙二醇及步骤(5)所制备的含炔基及二硫键的维生素e衍生物溶于二甲基亚砜，通入氩气，10min后加入五水硫酸铜及抗坏血酸钠，继续通氩气10min，然后用橡皮塞密闭瓶口，发生反应，反应结束后用透析袋透析，用去离子水透析48h，收集透析液，冷冻干燥，得到含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯。

上述含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的制备方法的合成路线如下：

作为本发明所述胶束的具体实施方式，所述步骤(1)中，继续搅拌时间为2h，室温反应时间为24h，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，烯丙基聚乙二醇的分子量为500～2000g/mol，烯丙基聚乙二醇和对甲基苯磺酰氯的质量比20∶(2～4)，烯丙基聚乙二醇和三乙胺的质量体积比为20∶(2～6)，烯丙基聚乙二醇和无水二氯甲烷的质量体积比为20∶(200～300)。

优选地，烯丙基聚乙二醇其分子量为500g/mol、1000g/mol、2000g/mol。

作为本发明所述胶束的具体实施方式，所述步骤(2)中，反应时间为24h，反应温度为60～85℃，对甲基苯磺酸烯丙基聚乙二醇酯和叠氮钠的质量比为20∶(1.5～6)。

作为本发明所述胶束的具体实施方式，所述步骤(3)中，反应温度为70℃，反应时间为24h，调节反应液ph值为碱性，α-烯丙基，ω-叠氮基聚乙二醇、半胱胺盐酸盐、过硫酸铵的质量比为10∶(1～3)∶(0.1～0.3)；所述步骤(4)中，反应时间为24h，用去离子水透析48h，α-氨基，ω-叠氮基聚乙二醇、叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及n-羟基琥珀酰亚胺和的质量比为10∶(2～8)∶(0.5～2)∶(1～4)。

作为本发明所述胶束的具体实施方式，所述步骤(5)中，反应时间为24h，透析时间为24h，无水二氯甲烷的用量为100～200ml，维生素e琥珀酸酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺和炔丙基氨基甲酸乙基二巯基乙胺的质量比为10∶(0.5～2)∶(0.5～2)∶4；所述步骤(6)中，反应温度为50℃，反应时间为24h，透析为用截留分子量为3500～5000da的纤维素透析袋透析48h，α-叶酸，ω-叠氮基聚乙二醇、含炔基及二硫键的维生素e衍生物、五水硫酸铜和抗坏血酸钠的质量比为10∶(4～8)∶(0.2～0.4)∶(0.2～0.4)。

第二方面，本发明提供了上述胶束的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯、阿霉素、超顺磁性氧化铁纳米粒子溶于有机溶剂，超声辅助下分散于去离子水中，将所得混合液在去离子水中透析，得到负载抗肿瘤药物及成像对比剂的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束。

作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述有机溶剂为二甲基亚砜，透析时间为24h。

第三方面，本发明提供了上述胶束在制备肿瘤诊断制剂或抗肿瘤药物中的应用。

第四方面，本发明提供了上述胶束在制备肿瘤诊断与治疗一体化制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明的一种含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束，由具有还原相应特性的二硫键分别连接着亲水的聚乙二醇链段及其疏水维生素e链段，通过引入叶酸分子，赋予了胶束肿瘤靶向的特性，通过自组装得到的胶束纳米粒子具有优良生物相容性，该胶束能对肿瘤还原性的微环境中谷胱甘肽作出响应，实现药物的快速释放，具有肿瘤靶向及药物智能控制释放的优点；

(2)本发明利用含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯衍生物在水溶液中自组装形成纳米胶束，并同时负载疏水性抗癌药物阿霉素及磁共振成像对比剂氧化铁纳米粒子，具有良好的肿瘤成像效果和药物治疗效果，有望成为集肿瘤靶向成像及治疗于一体的多功能肿瘤诊疗一体化纳米平台。

附图说明

图1为本发明实施例1中所得的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯衍生¹hnmr谱图。

图2为本发明实施例1制备得到的胶束的透射电镜图。

图3为本发明实施例2制备得到的胶束的透射电镜图。

图4为本发明实施例3制备得到的胶束的透射电镜图。

图5为本发明实施例1～3制备得到的胶束的生物相容性统计图。

图6为本发明实施例1～3制备得到的胶束对耐阿霉素人肝癌细胞(hepg2-adm)的细胞毒性分析的细胞存活率统计图。

图7为本发明实施例2制备得到的胶束在含谷胱甘肽及不含谷胱甘肽条件下的药物释放曲线图。

图8为本发明实施例2制备得到的胶束的磁豫率测定图。

图9为本发明实施例1制备得到的胶束的体内肿瘤靶向磁共振成像效果图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束，其特征在于，所述胶束包括如下重量份的组分：含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯10份、阿霉素1份、超顺磁性氧化铁纳米粒子1份，所述含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的结构式如下式所示：

本实施例胶束的制备方法为：

(1)对甲基苯磺酸烯丙基聚乙二醇酯的制备：将500g/mol烯丙基聚乙二醇20g溶于200ml无水二氯甲烷中，冰水浴下搅拌，然后加入对甲基苯磺酰氯4g、三乙胺6ml，继续搅拌2h，室温反应24h，反应完成后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，分离得到有机相，减压蒸馏，除去二氯甲烷，得到对甲基苯磺酸烯丙基聚乙二醇酯；

(2)α-烯丙基，ω-叠氮基聚乙二醇的制备：将步骤(1)得到的20g对甲基苯磺酸烯丙基聚乙二醇酯溶于200ml去离子水中，加入6g叠氮钠反应，反应时间为24h，反应温度为85℃，反应完成后冷却至室温，加入200ml二氯甲烷，萃取、分离，减压蒸馏等到α-烯丙基，ω-叠氮基聚乙二醇；

(3)α-氨基，ω-叠氮基聚乙二醇的制备：将步骤(2)得到的10gα-烯丙基，ω-叠氮基聚乙二醇溶于100ml去离子水中，氩气保护，然后加入3g半胱胺盐酸盐、0.3g过硫酸铵，氩气保护下70℃反应24h，反应完成后用氢氧化钠溶液调节反应液ph值至碱性，二氯甲烷萃取、减压蒸馏，得到α-氨基，ω-叠氮基聚乙二醇；

(4)α-叶酸，ω-叠氮基聚乙二醇的制备：将步骤(3)得到的10gα-氨基，ω-叠氮基聚乙二醇溶于无水二甲基亚砜，加入2g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4gn-羟基琥珀酰亚胺，再加入8g叶酸，待叶酸完全溶解后于室温下避光反应24h，反应完成后将混合溶液装进截留分子量为3500～5000da的纤维素透析袋透析，用去离子水透析48h，收集透析液，冷冻干燥，得到α-叶酸，ω-叠氮基聚乙二醇；

(5)含炔基及二硫键的维生素e衍生物的制备：将10g维生素e琥珀酸酯溶于200ml无水二氯甲烷，加入)2g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和2gn-羟基琥珀酰亚胺，充分溶解后加入4g炔丙基氨基甲酸乙基二巯基乙胺，于室温下避光反应24h，反应完成后减压蒸馏，用二甲基亚砜溶解产物，装进截留分子量为3500～5000da的纤维素透析袋透析24h，收集透析液，冷冻干燥，得到含炔基及二硫键的维生素e衍生物；

(6)含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的制备：将步骤(4)所制备的1gα-叶酸，ω-叠氮基聚乙二醇及步骤(5)所制备的0.8g含炔基及二硫键的维生素e衍生物溶于10ml二甲基亚砜，通入氩气，10min后加入0.04g五水硫酸铜及0.04g抗坏血酸钠，继续通氩气，然后用橡皮塞密闭瓶口，发生反应，反应温度为50℃，反应时间为24h，反应结束后用透析袋透析，用去离子水透析48h，收集透析液，冷冻干燥，得到含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯。

将本步骤得到的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯溶于dmso-d6，样品浓度为10mg/ml，以四甲基硅烷(tms)为内标，利用400兆超导核磁共振谱仪brukeravance400(brukerco.，switzerland)对样品结构进行1hnmr表征，结果如图1所示。从图1的核磁谱图中可以看出，含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的核磁谱图在6.5-8.5ppm处出现叶酸苯环结构上质子的核磁共振峰，在3.65ppm处出现了peg质子的核磁共振峰，而维生素e琥珀酸酯的质子峰出现1.0-3.0ppm之间，说明成功合成还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯。

(7)将步骤(6)得到的10mg含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯、1mg阿霉素、1mg超顺磁性氧化铁纳米粒子溶于1ml二甲基亚砜中，超声辅助下分散于4ml去离子水中，将所得混合溶液装入截留分子量为3500da的透析袋中透析，25℃下透析24h除去有机溶剂，得到负载抗肿瘤药物及成像对比剂的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束。

由紫外光谱测定阿霉素在485纳米波长处的吸光度，根据工作曲线计算出阿霉素的浓度，阿霉素负载率(doxloadingcapacity，dlc)根据以下公式计算：dlc＝(m1/m0)×100，其中m0为含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的质量；m1为载入的dox的质量。经计算，阿霉素的负载率(dlc)约为6.2％。

使用原子吸收分光光度计(aas)测定spio的负载量。将装载dox/spio的胶束加入到1mhcl溶液中，使得胶束解聚和完全溶解spio。fe浓度基于预先建立的校准曲线在特定fe吸收波长(248.3nm)处测定。spio负载量计算为spio与负载spio的胶束的总重量的比率。slc(％)＝m3/m0×100，其中m0为含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的质量，m3是负载的spio的质量。经计算，spio的负载率(slc)约为9.2％。

将本实施例所得负载抗肿瘤药物及成像对比剂的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束稀释至10ml，经孔径为0.45μm和0.22μm的针式过滤器过滤，然后取10μl胶束溶液，滴于200目表面镀有碳膜的铜网上，自然干燥60s，然后将铜网浸泡在2％(w/v)磷钨酸溶液中，染色60s，利用120kv透射电镜feitecnaig2spirit(feico.netherlands)对纳米粒子的形貌进行观察，结果如图2所示。从图2的透射电镜图中可以看出，本实施例所得纳米粒子呈球形结构，大小为60nm。

实施例2

一种含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束，其特征在于，所述胶束包括如下重量份的组分：含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯10份、阿霉素1.5份、超顺磁性氧化铁纳米粒子1.5份.所述含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的结构式同实施例1。

本实施例胶束的制备方法为：

(1)对甲基苯磺酸烯丙基聚乙二醇酯的制备：将1000g/mol烯丙基聚乙二醇20g溶于250ml无水二氯甲烷中，冰水浴下搅拌，然后加入对甲基苯磺酰氯2g、三乙胺3ml，继续搅拌2h，室温反应24h，反应完成后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，分离得到有机相，减压蒸馏，除去二氯甲烷，得到对甲基苯磺酸烯丙基聚乙二醇酯；

(2)α-烯丙基，ω-叠氮基聚乙二醇的制备：将步骤(1)得到的20g对甲基苯磺酸烯丙基聚乙二醇酯溶于250ml去离子水中，加入3g叠氮钠反应，反应时间为24h，反应温度为80℃，反应完成后冷却至室温，加入200ml二氯甲烷，萃取、分离，减压蒸馏等到α-烯丙基，ω-叠氮基聚乙二醇；

(3)α-氨基，ω-叠氮基聚乙二醇的制备：将步骤(2)得到的10gα-烯丙基，ω-叠氮基聚乙二醇溶于100ml去离子水中，氩气保护，然后加入1.5g半胱胺盐酸盐、0.1.5g过硫酸铵，氩气保护下70℃反应24h，反应完成后用氢氧化钠溶液调节反应液ph值至碱性，二氯甲烷萃取、减压蒸馏，得到α-氨基，ω-叠氮基聚乙二醇；

(4)α-叶酸，ω-叠氮基聚乙二醇的制备：将步骤(3)得到的10gα-氨基，ω-叠氮基聚乙二醇溶于无水二甲基亚砜，加入1g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和2gn-羟基琥珀酰亚胺，再加入4g叶酸，待叶酸完全溶解后于室温下避光反应24h，反应完成后将混合溶液装进截留分子量为3500～5000da的纤维素透析袋透析，用去离子水透析48h，收集透析液，冷冻干燥，得到α-叶酸，ω-叠氮基聚乙二醇；

(5)含炔基及二硫键的维生素e衍生物的制备：将10g维生素e琥珀酸酯溶于200ml无水二氯甲烷，加入)1g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1gn-羟基琥珀酰亚胺，充分溶解后加入4g炔丙基氨基甲酸乙基二巯基乙胺，于室温下避光反应24h，反应完成后减压蒸馏，用二甲基亚砜溶解产物，装进截留分子量为3500～5000da的纤维素透析袋透析24h，收集透析液，冷冻干燥，得到含炔基及二硫键的维生素e衍生物；

(6)含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的制备：将步骤(4)所制备的1gα-叶酸，ω-叠氮基聚乙二醇及步骤(5)所制备的0.4g含炔基及二硫键的维生素e衍生物溶于10ml二甲基亚砜，通入氩气，10min后加入0.02g五水硫酸铜及0.02g抗坏血酸钠，继续通氩气，然后用橡皮塞密闭瓶口，发生反应，反应温度为50℃，反应时间为24h，反应结束后用透析袋透析，用去离子水透析48h，收集透析液，冷冻干燥，得到含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯。

(7)将步骤(6)得到的10mg含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯、1.5mg阿霉素、1.5mg超顺磁性氧化铁纳米粒子溶于2ml二甲基亚砜中，超声辅助下分散于5ml去离子水中，将所得混合溶液装入截留分子量为3500da的透析袋中透析，25℃下透析24h除去有机溶剂，得到负载抗肿瘤药物及成像对比剂的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束。

由紫外光谱测定阿霉素在485纳米波长处的吸光度，根据工作曲线计算出阿霉素的浓度，阿霉素负载率(doxloadingcapacity，dlc)根据以下公式计算：dlc＝(m1/m0)×100，其中m0为含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的质量；m1为载入的dox的质量。经计算，阿霉素的负载率(dlc)约为11.1％。

使用原子吸收分光光度计(aas)测定spio的负载量。将装载dox/spio的胶束加入到1mhcl溶液中，使得胶束解聚和完全溶解spio。fe浓度基于预先建立的校准曲线在特定fe吸收波长(248.3nm)处测定。spio负载量计算为spio与负载spio的胶束的总重量的比率。slc(％)＝m3/m0×100，其中m0为含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的质量，m3是负载的spio的质量。经计算，spio的负载率(slc)约为13.2％。

将本实施例所得负载抗肿瘤药物及成像对比剂的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束稀释至10ml，经孔径为0.45μm和0.22μm的针式过滤器过滤，然后取10μl胶束溶液，滴于200目表面镀有碳膜的铜网上，自然干燥60s，然后将铜网浸泡在2％(w/v)磷钨酸溶液中，染色60s，利用120kv透射电镜feitecnaig2spirit(feico.netherlands)对纳米粒子的形貌进行观察，结果如图3所示。从图3的透射电镜图中可以看出，本实施例所得纳米粒子呈球形结构，大小为75nm。

实施例3

一种含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束，其特征在于，所述胶束包括如下重量份的组分：含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯10份、阿霉素2份、超顺磁性氧化铁纳米粒子2份，所述含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的结构式同实施例1。

本实施例胶束的制备方法为：

(1)对甲基苯磺酸烯丙基聚乙二醇酯的制备：将2000g/mol烯丙基聚乙二醇20g溶于300ml无水二氯甲烷中，冰水浴下搅拌，然后加入对甲基苯磺酰氯2g、三乙胺2ml，继续搅拌2h，室温反应24h，反应完成后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，分离得到有机相，减压蒸馏，除去二氯甲烷，得到对甲基苯磺酸烯丙基聚乙二醇酯；

(2)α-烯丙基，ω-叠氮基聚乙二醇的制备：将步骤(1)得到的20g对甲基苯磺酸烯丙基聚乙二醇酯溶于250ml去离子水中，加入1.5g叠氮钠反应，反应时间为24h，反应温度为70℃，反应完成后冷却至室温，加入200ml二氯甲烷，萃取、分离，减压蒸馏等到α-烯丙基，ω-叠氮基聚乙二醇；

(3)α-氨基，ω-叠氮基聚乙二醇的制备：将步骤(2)得到的20gα-烯丙基，ω-叠氮基聚乙二醇溶于200ml去离子水中，氩气保护，然后加入1.0g半胱胺盐酸盐、0.10g过硫酸铵，氩气保护下70℃反应24h，反应完成后用氢氧化钠溶液调节反应液ph值至碱性，二氯甲烷萃取、减压蒸馏，得到α-氨基，ω-叠氮基聚乙二醇；

(4)α-叶酸，ω-叠氮基聚乙二醇的制备：将步骤(3)得到的10gα-氨基，ω-叠氮基聚乙二醇溶于无水二甲基亚砜，加入0.5g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.0gn-羟基琥珀酰亚胺，再加入2g叶酸，待叶酸完全溶解后于室温下避光反应24h，反应完成后将混合溶液装进截留分子量为3500～5000da的纤维素透析袋透析，用去离子水透析48h，收集透析液，冷冻干燥，得到α-叶酸，ω-叠氮基聚乙二醇；

(5)含炔基及二硫键的维生素e衍生物的制备：将10g维生素e琥珀酸酯溶于100ml无水二氯甲烷，加入)0.5g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.5gn-羟基琥珀酰亚胺，充分溶解后加入4g炔丙基氨基甲酸乙基二巯基乙胺，于室温下避光反应24h，反应完成后减压蒸馏，用二甲基亚砜溶解产物，装进截留分子量为3500～5000da的纤维素透析袋透析24h，收集透析液，冷冻干燥，得到含炔基及二硫键的维生素e衍生物；

(6)含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的制备：将步骤(4)所制备的1gα-叶酸，ω-叠氮基聚乙二醇及步骤(5)所制备的0.8g含炔基及二硫键的维生素e衍生物溶于10ml二甲基亚砜，通入氩气，10min后加入0.04g五水硫酸铜及0.04g抗坏血酸钠，继续通氩气，然后用橡皮塞密闭瓶口，发生反应，反应温度为50℃，反应时间为24h，反应结束后用透析袋透析，用去离子水透析48h，收集透析液，冷冻干燥，得到含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯。

(7)将步骤(6)得到的10mg含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯、2mg阿霉素、2mg超顺磁性氧化铁纳米粒子溶于2ml二甲基亚砜中，超声辅助下分散于5ml去离子水中，将所得混合溶液装入截留分子量为3500da的透析袋中透析，25℃下透析24h除去有机溶剂，得到负载抗肿瘤药物及成像对比剂的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束。

由紫外光谱测定阿霉素在485纳米波长处的吸光度，根据工作曲线计算出阿霉素的浓度，阿霉素负载率(doxloadingcapacity，dlc)根据以下公式计算：dlc＝(m1/m0)×100，其中m0为含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的质量；m1为载入的dox的质量。经计算，阿霉素的负载率(dlc)约为10.6％。

使用原子吸收分光光度计(aas)测定spio的负载量。将装载dox/spio的胶束加入到1mhcl溶液中，使得胶束解聚和完全溶解spio。fe浓度基于预先建立的校准曲线在特定fe吸收波长(248.3nm)处测定。spio负载量计算为spio与负载spio的胶束的总重量的比率。slc(％)＝m3/m0×100，其中m0为含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的质量，m3是负载的spio的质量。经计算，spio的负载率(slc)约为12.2％。

将本实施例所得负载抗肿瘤药物及成像对比剂的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束稀释至10ml，经孔径为0.45μm和0.22μm的针式过滤器过滤，然后取10μl胶束溶液，滴于200目表面镀有碳膜的铜网上，自然干燥60s，然后将铜网浸泡在2％(w/v)磷钨酸溶液中，染色60s，利用120kv透射电镜feitecnaig2spirit(feico.netherlands)对纳米粒子的形貌进行观察，结果如图4所示。从图4的透射电镜图中可以看出，本实施例所得纳米粒子呈球形结构，大小为90nm。

实施例4

使用cck-8(cellcountingkit-8)试剂盒分别评价实施例1～3所制备的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯的生物相容性评价。将生长良好的人脐静脉内皮细胞(huvec)以每孔4×10³个接种到96孔板中，经过24小时再培养箱中的培养后，根据每种空白探针分成不同的浓度0、50、100、150、200、250μg/ml，每个浓度设置4个复孔，然后在培养箱放置24小时，舍弃含空白探针的培养基，每孔加入10μl新配置好的cck-8试剂，然后在培养箱中放置2-4小时，再用酶标仪测试吸光度(od值)。然后按照公式生长抑制率＝[(对照组od值-实验组od值)/对照组od值]×100％，横坐标为浓度梯度，纵坐标为生长抑制率，再将不同的空白探针拼合成柱状图对比，结果如图5所示。

从图5的细胞毒性实验结果中可以看出，本发明所制备的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束具有良好的生物安全性，对正常的huvec细胞的生长不存在明显的生长抑制作用。

实施例5

使用cck-8(cellcountingkit-8)试剂盒评价实施例1～3中所制备的负载抗肿瘤药物及成像对比剂的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束对耐阿霉素人肝癌细胞(hepg2-adm)的细胞毒性。细胞毒性实验将生长良好的耐药肝癌细胞以每孔4×10³个接种到96孔板中，经过24小时再培养箱中的培养后再如上述步骤一样，将游离阿霉素、负载抗肿瘤药物及成像对比剂的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束以不同的浓度0，10，20，30，40，50μg/ml，每个浓度设置4个复孔，然后在培养箱放置24小时，舍弃含有药物的培养基，再往每个孔中加入10μl新配置好的cck-8试剂，然后在培养箱中放置2-4小时，再用酶标仪测试吸光度(od值)。然后按照公式生长抑制率＝[(对照组od值-实验组od值)/对照组od值]×100％，横坐标为浓度梯度，纵坐标为生长抑制率，结果如图6所示。

从图6的细胞毒性实验结果中可以看出，本发明所制备的包载阿霉素及氧化铁纳米粒子的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束对耐阿霉素人肝癌细胞具有较好的生长抑制作用，而且其生长抑制效果远优于相同浓度的游离阿霉素。

实施例6

在还原性条件下，在截留分子量为3500da的透析袋中装入3ml实施例2所制备的负载抗肿瘤药物及成像对比剂的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯载药胶束溶液，外面为27ml，ph为7.4及谷胱甘肽浓度为10mm的pbs透析液中释放。在非还原性条件下，在截留分子量为3500da的透析袋中装入3ml实施例2所制备的负载抗肿瘤药物及成像对比剂的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯载药胶束溶液，外面为27ml的ph为7.4的pbs透析液中震荡释放。

在特定的时间间隔里，每次在透析袋外液中取样3ml(ve)，后补加3ml的pbs，以维持总体积不变。阿霉素的浓度用标准工作曲线进行测定，每个样品的测定均重复三次。药物的累计释放百分数(er)用以下进行计算：

mdox代表在胶束中的阿霉素的质量，v0为释放介质的总体积(v0＝30ml)，ci为第i个样品中阿霉素的浓度，结果如图7所示。

由图7可知，在含有谷胱甘体的还原性条件下，阿霉素在24小时内的累积释放量接近100％，而在不含有谷胱甘肽的非还原性条件下，阿霉素24小时内的累积释放量只有35％左右，明显慢于还原性条件下的释放量，表明实施例2制备的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯载药胶束能在肿瘤还原性微环境下实验药物的快速释放。

实施例7

采用德国siemenserlangenverio3.0tmr扫描仪，小动物磁共振成像专用线圈扫描测定实施例2中所制备的负载抗肿瘤药物及成像对比剂的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束。对配制含fe浓度分别为0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml和0.03125μg/ml的胶束溶液，以去离子水为对照组进行mr扫描，具体参数为：se序列，tr1000ms，te80ms，反转角150°，层厚3mm，体素0.5mm×0.5mm×3.0mm，矩阵444×448。获取5幅t2wi-anatomical原始图及1幅t2wimap图后，在t2wimap图上测量ep管轴面每个roi的t2wi弛豫时间值，每个roi测量3次，取平均值。弛豫率计算公式如下。以水溶液作为对照，样品的弛豫时间为t0，加入浓度为c的材料，t即为材料相应的弛豫时间。驰豫时间t、t0及浓度c之间的关系为：

将浓度c作为x轴，1/t作为y轴，k值为斜率，1/t0为截距。通过用一定浓度的材料和测量出的驰豫时间求出弛豫率拟合曲线，斜率k即为弛豫率，结果如图8所示。

由图8可知，实施例2制备得到的负载抗肿瘤药物及成像对比剂的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯载药胶束其磁豫率大约为230femm^-1s^-1，具有较好的阴性对此增强效果。

实施例8

hepg2细胞株由华南理工大学第二附属广州市第一人民医院检验科实验室提供。无特定病原(specificpathgenfree，spf)级balb/c裸小鼠皮下异位肝癌移植瘤，购自广东省实验动脉中心，鼠龄6～8周，体重18～25g，雄性。在无菌条件下，用1ml注射器在裸小鼠背部肩胛区皮肤及肝区注射0.2mlhepg2细胞株悬液(1×10⁷个/ml)。接种后的裸鼠在广东省实验动物中心饲养，实验动物使用许可证号为syxk(粤)2013-0002，定期观察裸鼠精神、饮食及排便等情况。当肿瘤直径达1～2cm时，以铁浓度为5mg/kg的剂量经尾静脉注射实施例1中所制备的负载抗肿瘤药物及成像对比剂的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯胶束。采用医用10％水合氯醛(20mg/kg)对裸小鼠进行腹腔注射麻醉，于注射前及注射后不同时点(2、4、12h)分别进行mri扫描，结果如图9所示。

由图9可知，小鼠注射负载抗肿瘤药物及成像对比剂的含叶酸分子的还原响应型维生素e聚乙二醇琥珀酸酯载药胶束后，肿瘤区域的磁共振信号逐渐增强，在8小时达到最大值，表明对比剂逐渐富集于肿瘤部位，而在12小时后磁共振信号变弱，可能是因为对比剂被逐步代谢排出体外。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。