一种具有肿瘤细胞生长抑制效应的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物及其制备与用途的制作方法

本发明涉及一种具有肿瘤细胞生长抑制效应的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物及其制备与用途，属于食品及医药技术领域。

背景技术：

癌症严重威胁人类生命健康，高效而有选择性的杀死癌细胞仍是人类面临的一大难题。化学疗法是治疗癌症的方法之一，虽然有效，但会产生巨大的副作用及耐药性。为了有效控制肿瘤细胞生长，高效、低毒类药物及其制剂研发意义重大。

硒作为人体必需的微量元素之一，具有抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等功效活性，缺硒会导致各种疾病。研究表明，硒可以以多种形式抑制前列腺肿瘤细胞、肺肿瘤细胞和结肠直肠肿瘤细胞的生长。硒纳米粒是硒的一种补充剂形式，可以在一定程度上降低硒的毒性。然而，硒纳米粒不稳定，会相互团聚从而导致其从有活性的有机态转变为无活性的无机态，活性大大降低。针对该问题，一种行之有效的策略是将硒纳米粒与多糖结合。多糖的羟基由于共轭等作用结合在硒纳米粒表面，使其性质稳定，多糖也会由于硒纳米粒的结合而具有纳米尺寸效应。这种多糖纳米粒有利于多糖分子与肠粘膜的黏附与吸收，增加细胞的内吞作用，增强其摄取能力，从而更好的发挥生理功效。

茅草菇生长于安徽省潜山县境内，作为珍稀野生食用菌，其营养价值极高，但生长条件苛刻，尚不能人工栽培，大规模开发利用受限。作为地方特色生物质资源，目前该种茅草菇多糖的功效活性鲜有报道，具有重要的研究开发价值。

技术实现要素：

在上述现有技术的基础上，本发明旨在提供一种具有肿瘤细胞生长抑制效应的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物及其制备方法与用途。

本发明为实现发明目的，采用如下技术方案：

一种具有肿瘤细胞生长抑制效应的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、将茅草菇多糖用去离子水配成0.5-4mg/ml的茅草菇多糖溶液；

步骤2、将0.4-1.6ml所述茅草菇多糖溶液与2.8ml10-40mg/ml的亚硒酸钠溶液在室温-40℃下充分搅拌混合1-2h，搅拌转速为1000-2000rpm，获得混合液；

步骤3、在步骤2所得混合液中加入5.6ml10-40mg/ml的l-抗坏血酸溶液，再补加去离子水使总体积为10ml，常温反应4-8h，即获得具有肿瘤细胞生长抑制效应的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物；

或者直接在步骤2所得混合液中补加去离子水使总体积为10ml，然后100-150℃条件下反应4-8h，即获得具有肿瘤细胞生长抑制效应的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物。

进一步地，步骤1所述茅草菇多糖按如下步骤获得：

(1)对新鲜的茅草菇子实体进行表面消毒后，在无菌环境下取菌肉并接种到pda固体培养基内，26～30℃静置培养3～5天，然后取菌丝体并接种于ypd液体培养基内，26～30℃振荡培养3～5天，固液分离，获得茅草菇发酵菌丝体和茅草菇发酵液；

(2)将所述茅草菇发酵菌丝体烘干粉碎，过60目筛，得粉料；将所得粉料以1g:7-10ml的料液比加入蒸馏水中，60-90℃下浸提3-5h，纱布过滤并重复浸提3-4次，合并提取液；

(3)将步骤(1)所得茅草菇发酵液或步骤(2)所得提取液浓缩至体积的1/3-1/10，向所得浓缩液中加入乙醇至乙醇最终的体积浓度为30-75％，然后4℃静置8-10h，5000-8000rpm离心10-30min，收集沉淀；

(4)将步骤(3)所得沉淀加适量蒸馏水溶解，然后加入等体积的sevage试剂，搅拌3-5h，5000-8000rpm离心10-30min，留取上清液；

(5)将步骤(4)所得上清液使用4-7kda的透析袋充分透析，完全去除小分子、单糖及寡糖，产物再经干燥，即获得茅草菇多糖，其水溶液经紫外-可见全波长扫描(200-800nm)无蛋白或核酸残留。

进一步地，步骤(5)所述干燥为冷冻干燥或真空干燥。

本发明上述制备方法所获得的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物，粒径在50-300nm之间，动态光散射分析显示其具有良好的粒径分布。

本发明所获得的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物可用于制备抗肿瘤药物，抑制肿瘤细胞生长，如肝癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞等。

本发明的有益效果体现在：

1、本发明的茅草菇多糖具有良好的免疫活性、富含大量的羟基基团，可以与硒纳米粒结合形成分散度良好的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物，该复合物具有显著的肿瘤细胞生长抑制效应，相比于单纯的硒纳米粒或单纯的茅草菇多糖，其协同增效作用明显提升。

2、本发明对茅草菇多糖-硒纳米粒复合物的细胞活力检测结果显示：复合物在低浓度时亦表现出明显的细胞抑制效应，并且对正常细胞的抑制作用低。对细胞有选择性的生长抑制特性及低毒特性使其具有重要的研究和开发利用前景。

3、本发明的方法制备的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物经马尔文纳米激光粒径仪检测其纳米粒径为50-300nm，粒径分布集中且稳定性良好。

附图说明

图1为实施例1所制备的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物的透射电子显微镜图，可以看出，茅草菇多糖-硒纳米粒复合物形态均一、分散性良好。

图2为实施例1所制备的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物的溶液照片及其粒径分布测定图，可以看出，产物粒径分布集中，且体系均一、稳定。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，下述实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例所用茅草菇发酵菌丝体和茅草菇发酵液的制备方法如下：

选择新鲜的茅草菇子实体，在无菌的环境下对子实体进行表面消毒，然后在火焰旁将子实体切开，用镊子在近表皮的菌肉处挑取黄豆粒大的组织放入pda固体培养基内，28℃静置培养4天。然后取适量菌丝体接种于ypd液体培养基内，28℃振荡培养4天。固液分离，获得茅草菇发酵菌丝体和茅草菇发酵液。

实施例1：以茅草菇发酵菌丝体为原料制备茅草菇多糖-硒纳米粒复合物及其活性测定

1、将茅草菇发酵菌丝体置于摇摆高速万能粉碎机粉碎，过60目筛，得粉料；以1g:7ml的料液比，在100g所得粉料中加入蒸馏水，80℃下浸提3h，纱布过滤并重复浸提3次，合并提取液。

2、将所得提取液浓缩至体积的1/5，向所得浓缩液中加入95％乙醇至乙醇最终的体积浓度为75％，然后4℃静置10h，5000rpm/min下离心10min，弃上清，收集沉淀。

3、将步骤2得到的沉淀加100ml蒸馏水溶解，然后加入等体积的sevage试剂，搅拌3h，8000rpm下离心10min，留取上清液。

4、将步骤3所得上清液使用7kda透析袋充分透析3天，完全去除小分子、单糖及寡糖，产物经冷冻干燥，获得茅草菇发酵菌丝体多糖，其水溶液经紫外-可见全波长扫描(200-800nm)无蛋白和核酸的残留。

5、将步骤4获得的茅草菇发酵菌丝体多糖用去离子水配成4mg/ml的茅草菇多糖溶液。

6、将0.4ml步骤5中的茅草菇多糖溶液与2.8ml20mg/ml的亚硒酸钠溶液在室温下充分搅拌混合2h，转速为2000rpm，获得混合液。

7、在步骤6所得混合液中加入5.6ml40mg/ml的l-抗坏血酸溶液，再补加去离子水使总体积为10ml，常温反应8h，即获得具有纳米尺寸的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物的溶液。形态观察显示，本实施例所制备的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物形态均一、分散性良好，粒径约80nm。

按如下方式检测本实施例所制备的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物的抗肿瘤活性及毒性；

取生长状态良好的肝癌细胞及肝正常细胞，分别用细胞培养基配制成细胞悬液并接种到96孔板中，接种量为100μl，每孔细胞数为5000个。置于5％co2细胞培养箱中培养24h，吸出孔板内的培养基。将茅草菇多糖-硒纳米粒复合物用新鲜的细胞培养基配制成60μm的溶液，加入上述的96孔板中，培养24h。吸出培养上清液，往各孔中加入100μlmtt溶液(0.5％)，培养4h后，弃去上清液。再向各孔中加入100μldmso，将96孔板包裹在锡箔纸中，摇床上低速振荡混合均匀。15min后放入酶标仪中，570nm波长下测量吸光值，根据吸光值的大小计算茅草菇多糖-硒纳米粒对细胞生长的抑制率。

结果表明，60μm的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物对肝癌细胞的生长抑制率为71.4％、对肝正常细胞的生长抑制率为48.8％。

为进行对比，本实施例还按上述相同的方法测定了单纯硒纳米粒和单纯茅草菇多糖对肝癌细胞及肝正常细胞的生长抑制率，结果表明，60μm的单纯硒纳米粒对二者的生长抑制率分别为56.1％、50.2％，800μg/ml的茅草菇多糖对二者的抑制率分别为6.37％、0.854％。

可知，本实施例所得茅草菇多糖-硒纳米粒复合物对肝癌细胞的生长抑制率比单纯硒纳米粒与单纯茅草菇多糖显著提升，其协同增效作用明显提升。且本实施例的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物对正常细胞的抑制作用低。

实施例2：以茅草菇发酵菌丝体为原料制备茅草菇多糖-硒纳米粒复合物及其活性测定

1、将茅草菇发酵菌丝体置于摇摆高速万能粉碎机粉碎，过60目筛，得粉料；以1g:10ml的料液比，在200g所得粉料中加入蒸馏水，80℃下浸提3h，纱布过滤并重复浸提3次，合并提取液。

2、将所得提取液浓缩至体积的1/3，向所得浓缩液中加入95％乙醇至乙醇最终的体积浓度为45％，然后4℃静置10h，8000rpm离心15min，弃上清，收集沉淀。

3、将步骤2得到的沉淀加150ml蒸馏水溶解，然后加入等体积的sevage试剂，搅拌3h，8000rpm下离心20min，留取上清液。

4、将步骤3所得上清液使用6kda透析袋充分透析3天，完全去除小分子、单糖及寡糖，产物经真空干燥，获得茅草菇发酵菌丝体多糖，其水溶液经紫外-可见全波长扫描(200-800nm)无蛋白和核酸的残留。

5、将步骤4获得的茅草菇发酵菌丝体多糖用去离子水配成2.5mg/ml的茅草菇多糖溶液。

6、将1.6ml步骤5中的茅草菇多糖溶液与2.8ml20mg/ml的亚硒酸钠溶液在40℃下充分搅拌混合1h，搅拌转速为1500rpm，获得混合液。

7、在步骤6所得混合液中加入5.6ml20mg/ml的l-抗坏血酸溶液，再补加去离子水使总体积为10ml，常温反应6h，即获得具有纳米尺寸的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物的溶液。形态观察显示，本实施例所制备的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物形态均一、分散性良好，粒径约142nm。

本实施例按实施例1相同的方法检测所制备的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物的抗肿瘤活性及毒性，结果表明：60μm的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物对肝癌细胞的生长抑制率为75％，比单纯硒纳米粒的抑制作用提升了16.2％，对肝正常细胞的生长抑制率低于单纯的硒纳米粒。

实施例3：以茅草菇发酵菌丝体为原料制备茅草菇多糖-硒纳米粒复合物及其活性测定

1、将茅草菇发酵菌丝体置于摇摆高速万能粉碎机粉碎，过60目筛，得粉料；以1g:8ml的料液比，在200g所得粉料中加入蒸馏水，80℃下浸提3h，纱布过滤并重复浸提4次，合并提取液。

2、将所得提取液浓缩至体积的1/6，向所得浓缩液中加入95％乙醇至乙醇最终的体积浓度为75％，然后4℃静置10h，6000rpm离心20min，弃上清，收集沉淀。

3、将步骤2得到的沉淀加80ml蒸馏水溶解，然后加入等体积的sevage试剂，搅拌4h，8000rpm下离心15min，留取上清液。

4、将步骤3所得上清液使用6kda透析袋充分透析3天，完全去除小分子、单糖及寡糖，产物经冷冻干燥，获得茅草菇发酵菌丝体多糖，其水溶液经紫外-可见全波长扫描(200-800nm)无蛋白和核酸的残留。

5、将步骤4获得的茅草菇发酵菌丝体多糖用去离子水配成3mg/ml的茅草菇多糖溶液。

6、将0.8ml步骤5中的茅草菇多糖溶液与2.8ml20mg/ml的亚硒酸钠溶液在室温下充分搅拌混合2h，转速为2000rpm，获得混合液。

7、在步骤6所得混合液中补加去离子水使总体积为10ml，然后150℃条件下搅拌反应8h，转速为2000rpm，即获得具有纳米尺寸的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物的溶液。形态观察显示，本实施例所制备的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物形态均一、分散性良好，粒径约105.4nm。

本实施例按实施例1相同的方法检测所制备的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物的抗肿瘤活性及毒性，结果表明：60μm的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物对宫颈癌细胞的生长抑制率为72.1％，比单纯硒纳米粒的抑制作用提升了18％，对宫颈正常细胞的生长抑制率低于单纯的硒纳米粒。

实施例4：以茅草菇发酵液为原料制备茅草菇多糖-硒纳米粒复合物及其活性测定

1、将茅草菇发酵液浓缩至体积的1/10，向所得浓缩液中加入95％乙醇至乙醇最终的体积浓度为75％，然后4℃静置8h，8000rpm/min下离心30min，弃上清，收集沉淀。

2、将步骤1得到的沉淀加100ml蒸馏水溶解，然后加入等体积的sevage试剂，搅拌4h，8000rpm下离心30min，留取上清液。

3、将步骤2所得上清液使用7kda透析袋充分透析3天，完全去除小分子、单糖及寡糖，产物经真空干燥，获得茅草菇发酵液多糖，其水溶液经紫外-可见全波长扫描(200-800nm)无蛋白和核酸的残留。

4、将步骤3获得的茅草菇发酵液多糖用去离子水配成4mg/ml的茅草菇多糖溶液。

5、将0.6ml步骤4中的茅草菇多糖溶液与2.8ml20mg/ml的亚硒酸钠溶液在室温下充分搅拌混合1h，搅拌转速为1500rpm，获得混合液。

6、在步骤5所得混合液中补加去离子水使总体积为10ml，然后100℃条件下搅拌反应6h，转速为1500rpm，即获得具有纳米尺寸的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物的溶液。形态观察显示，本实施例所制备的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物形态均一、分散性良好，粒径约54nm。

本实施例按实施例1相同的方法检测所制备的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物的抗肿瘤活性及毒性，结果表明：60μm的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物对乳腺癌细胞的生长抑制率为73.4％，比单纯硒纳米粒的抑制作用提升了14.5％，对乳腺正常细胞的生长抑制率低于单纯的硒纳米粒。

实施例5：以茅草菇发酵液为原料制备茅草菇多糖-硒纳米粒复合物及活性测定

1、将茅草菇发酵液浓缩至体积的1/6，向所得浓缩液中加入95％乙醇至乙醇最终的体积浓度为55％，然后4℃静置10h，5000rpm下离心30min，弃上清，收集沉淀。

2、将步骤1得到的沉淀加90ml蒸馏水溶解，然后加入等体积的sevage试剂，搅拌3h，6000rpm下离心20min，留取上清液。

3、将步骤2所得上清液使用5kda透析袋充分透析3天，完全去除小分子、单糖及寡糖，产物经真空干燥，获得茅草菇发酵菌丝体多糖，其水溶液经紫外-可见全波长扫描(200-800nm)无蛋白和核酸的残留。

4、将步骤3获得的茅草菇发酵液多糖用去离子水配成4mg/ml的茅草菇多糖溶液。

5、将1ml步骤4中的茅草菇多糖溶液与2.8ml20mg/ml的亚硒酸钠溶液在室温下充分搅拌混合2h，搅拌转速为2000rpm，获得混合液。

6、在步骤5所得混合液中补加去离子水使总体积为10ml，然后150℃条件下搅拌反应6h，转速为2000rpm，即获得具有纳米尺寸的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物的溶液。形态观察显示，本实施例所制备的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物形态均一、分散性良好，粒径约187.4nm。

本实施例按实施例1相同的方法检测所制备的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物的抗肿瘤活性及毒性，结果表明：60μm的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物对结肠癌细胞的生长抑制率为69.9％，比单纯硒纳米粒的抑制作用提升了15.2％，对结肠正常细胞的生长抑制率低于单纯的硒纳米粒。

实施例6：以茅草菇发酵液为原料制备茅草菇多糖-硒纳米粒复合物及活性测定

1、将茅草菇发酵液浓缩至体积的1/4，向所得浓缩液中加入95％乙醇至乙醇最终的体积浓度为65％，然后4℃静置9h，6000rpm下离心20min，弃上清，收集沉淀。

2、将步骤1得到的沉淀加100ml蒸馏水溶解，然后加入等体积的sevage试剂，搅拌4h，7000rpm下离心20min，留取上清液。

3、将步骤2所得上清液使用5kda透析袋充分透析3天，完全去除小分子、单糖及寡糖，产物经冷冻干燥，获得茅草菇发酵液多糖，其水溶液经紫外-可见全波长扫描(200-800nm)无蛋白和核酸的残留；

4、将步骤3获得的茅草菇发酵液多糖用去离子水配成2.5mg/ml的茅草菇多糖溶液。

5、将0.4ml步骤4中的茅草菇多糖溶液与2.8ml20mg/ml的亚硒酸钠溶液在40℃下充分搅拌混合1h，搅拌转速为1000rpm，获得混合液。

6、在步骤5所得混合液中加入5.6ml40mg/ml的l-抗坏血酸溶液，再补加去离子水使总体积为10ml，常温反应4h，即获得具有纳米尺寸的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物的溶液。形态观察显示，本实施例所制备的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物形态均一、分散性良好，粒径约60.7nm。

本实施例按实施例1相同的方法检测所制备的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物的抗肿瘤活性及毒性，结果表明：60μm的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物对宫颈癌细胞的生长抑制率为68.8％，比单纯硒纳米粒的抑制作用提升了19.8％，对宫颈正常细胞的生长抑制率低于单纯的硒纳米粒。

实施例7：以茅草菇发酵液为原料制备茅草菇多糖-硒纳米粒复合物及其活性测定

1、将茅草菇发酵液浓缩至体积的1/6，向所得浓缩液中加入95％乙醇至乙醇最终的体积浓度为75％，然后4℃静置10h，8000rpm下离心10min，弃上清，收集沉淀。

2、将步骤1得到的沉淀加90ml蒸馏水溶解，然后加入等体积的sevage试剂，搅拌3h，7000rpm下离心20min，留取上清液。

3、将步骤2所得上清液使用7kda透析袋充分透析3天，完全去除小分子、单糖及寡糖，产物经真空干燥，获得茅草菇发酵液多糖，其水溶液经紫外-可见全波长扫描(200-800nm)无蛋白和核酸的残留。

4、将步骤3获得的茅草菇发酵液多糖用去离子水配成4mg/ml的茅草菇多糖溶液。

5、将0.5ml步骤4中的茅草菇多糖溶液与2.8ml20mg/ml的亚硒酸钠溶液在室温下充分搅拌混合1h，搅拌转速为2000rpm，获得混合液。

6、在步骤5所得混合液中加入5.6ml40mg/ml的l-抗坏血酸溶液，再补加去离子水使总体积为10ml，常温反应8h，即获得具有纳米尺寸的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物的溶液。形态观察显示，本实施例所制备的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物形态均一、分散性良好，粒径约217.5nm。

本实施例按实施例1相同的方法检测所制备的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物的抗肿瘤活性及毒性，结果表明：60μm的茅草菇多糖-硒纳米粒复合物对乳腺癌细胞的生长抑制率为59.9％，比单纯硒纳米粒的抑制作用提升了12.8％，对乳腺正常细胞的生长抑制率低于单纯的硒纳米粒。