本发明属于禽病毒疫苗领域。
背景技术：
鸡新城疫病毒(ndv)属于副粘病毒科，单股负链rna病毒。鸡新城疫(nd)是对养禽业危害最大的病毒性传染病之一，致死率极高，给世界各国的养禽业造成了巨大损失。目前，防治nd的主要措施是疫苗接种。
禽流感病毒(aiv)在世界各地流行极为广泛，特别是h9亚型aiv，虽然致病力较低，但其引起的继发感染往往给养禽业带来极大的损失，且有资料表明，h9亚型aiv基因可重组到高致病性aiv中，引起高致病性aiv的变异，进而危害家禽甚至人类的健康。所以研制安全高效的h9亚型aiv疫苗是必然选择。
现今禽类疫苗主要是用鸡胚生产的,而灭活疫苗是用低免种蛋或非免种蛋生产的，就有可能使疫苗中污染一些垂直传播疾病的病原,致使这些疾病随疫苗的应用而发生传播，大规模生产时还存在鸡胚数量不足等问题。病毒培养直接关系到抗原质量和滴度水平，因此病毒培养技术是影响疫苗质量的重要因素之一。以细胞为基质制备疫苗具有无外源因子污染、易于规模化生产、可以较好的维持病毒抗原稳定等优点。
目前，也有部分文献报道采用eb66细胞生产鸡新城疫、禽流感(h9亚型)二联灭活疫苗，但是为二阶培养法，即取部分细胞接毒后吸附培养1h，再补加部分病毒生产培养基培养，操作步骤多，耗时长，容易造成污染。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是，提供一种新的鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗及其制备方法。
本发明的技术方案包括：
一种全悬浮细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的制备方法，它包括如下步骤：
1)使用age1细胞悬浮培养新城疫病毒；
2)使用mdck细胞悬浮培养禽流感病毒；
3)将步骤1)和步骤2)所得病毒灭活，超滤浓缩后，加上药学上可接受的免疫佐剂及其它辅助性成分制备得到疫苗。
如前述的制备方法，所述步骤3)包括：
a.水相制备：将灭活、超滤浓缩后的新城疫病毒和禽流感病毒按1：(0.5-2)的体积比混合，得混合抗原，取混合抗原94-98体积份，加入吐温-802-6体积份，充分搅拌至吐温-80完全溶解，得水相；
b.油相制备：取白油92-96体积份，司本-804-8体积份，混匀，得油相；
c.乳化：将水相与油相按体积比1：(1.5-2.5)比例，混匀，乳化。
如前述的制备方法，所述步骤3)的步骤a中：
新城疫病毒和禽流感病毒体积比为1:1；
和/或，混合抗原与吐温-80的体积比是96:4。
如前述的制备方法，所述步骤3)的步骤b中：
白油为94体积份，司本-80为6体积份。
如前述的制备方法，所述步骤3)的步骤c中：
水相与油相体积比为1:2。
如前述的制备方法，所述步骤1)为：
将age1细胞放大传代至细胞密度为8.0×106/ml以上，接种新城疫病毒，同时添加体积比为10％-20％的无血清dmem培养基，添加终浓度为10-20μg/ml的胰酶，在33-37℃培养，检测ha效价不低于8log2时，收获病毒液。
进一步地，无血清dmem培养基添加的体积比为15％；
进一步地，胰酶终浓度为15μg/ml；
进一步地，培养温度为35℃。
如前述的制备方法，所述步骤2)为：
将mdck细胞放大传代至细胞密度为6.0×106/ml以上，接种禽流感病毒，同时添加终浓度为8-16μg/ml的胰酶，在35-37℃培养，检测ha效价不低于8log2时，收获毒液。
进一步地，所述胰酶的终浓度是12μg/ml。
进一步地，培养温度为37℃。
前述方法制备得到的鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明培养病毒的步骤简单，无需二阶培养；
2)本发明可以得到高滴度的新城疫病毒和禽流感病毒，超过现有技术的水平；
3)注射本发明的方法制备得到的二联疫苗比注射鸡胚苗能产生更高的抗体，本发明的疫苗保护效果更优。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1本发明二联疫苗的制备
1病毒在细胞上的增殖
1.1鸡新城疫病毒在悬浮细胞上的增殖
将age1细胞放大传代至7l的生物反应器中，培养液体积为4～5l，ph值设置为7.15，溶氧值设置为60％，转速设置为75r/min，37℃培养。当细胞密度为8.0×106/ml以上时，按0.0001moi接种新城疫病毒asg10株病毒，同时添加体积比为15％的无血清dmem培养基，一次性添加终浓度为15μg/ml的胰酶溶液，将培养温度调至35℃，培养64～80h，取样检测ha效价，当ha效价不低于8log2时，收获病毒液。共制备3批新城疫病毒，测定其ha效价和病毒含量。结果见表1。
表1新城疫病毒在7l生物反应器中的培养
1.2禽流感病毒在悬浮细胞上的增殖
将mdck细胞放大传代至7l的生物反应器中，培养液体积为4～5l，ph值设置为7.0，溶氧值设置为50％，转速设置为65r/min，37℃培养。当细胞密度为6.0×106/ml以上时，按0.01moi接种禽流感g株病毒，一次性添加终浓度为12μg/ml的胰酶溶液，培养42～54h，取样检测ha效价，当ha效价不低于8log2时，收获病毒液。共制备3批禽流感病毒，测定其ha效价和病毒含量。结果见表2。
表2禽流感g株病毒在7l生物反应器中的培养
2病毒液的浓缩
分别将3批ndv和h9aiv病毒液各取3000ml，使用美国pallcorporation超滤系统，选用截留分子量为100kd的超滤膜，浓缩至原体积的1/2。
3病毒液的灭活
3.1新城疫病毒液的灭活分别将3批2倍浓缩的ndvasg10株病毒液加入终浓度为0.1％的甲醛，水浴加热至37℃，开始计时，进行37℃恒温灭活20h，每隔2小时摇匀一次，灭活后取病毒液测定其ha效价，并进行灭活检验。灭活后ha效价并未降低，灭活检验结果显示灭活完全。结果详见表3。
表3ndvasg10株病毒液灭活情况
3.2禽流感病毒的液灭活分别将3批2倍浓缩的h9aivg株病毒液加入终浓度为0.2％的甲醛，水浴加热至37℃，开始计时，进行37℃恒温灭活18h，每隔2小时摇匀一次，灭活后取病毒液测定其ha效价，并进行灭活检验。灭活后ha效价并未降低，灭活检验结果显示灭活完全。结果详见表4。
表4h9亚型aivg株病毒液灭活情况
4疫苗的配制
4.1水相的制备将灭活的3批ndv、aiv两种抗原等体积混合，取混合后的抗原96体积份，加入灭菌冷却后的吐温-804体积份，充分搅拌直至吐温-80完全溶解，制备成水相。
4.2油相的制备取注射用白油94体积份，司本-806体积份搅拌混匀，灭菌后冷却备用。
4.3乳化水相与油相按1:2体积比，先将油相输入乳化罐中搅拌再缓慢加入水相，继续搅拌使油相与水相充分混匀，然后通过剪切机在线乳化，共制备3批疫苗，批号分别为01、02、03。
实施例2本发明二联疫苗的制备
1病毒在细胞上的增殖
1.1鸡新城疫病毒在悬浮细胞上的增殖
将age1细胞放大传代至7l的生物反应器中，培养液体积为4～5l，ph值设置为7.15，溶氧值设置为60％，转速设置为75r/min，37℃培养。当细胞密度为8.0×106/ml以上时，按0.0001moi接种新城疫病毒asg10株病毒，同时添加体积比为15％的无血清dmem培养基，一次性添加终浓度为10μg/ml的胰酶溶液，将培养温度调至33℃，培养64～80h，取样检测ha效价，当ha效价不低于8log2时，收获病毒液。
1.2禽流感病毒在悬浮细胞上的增殖
将mdck细胞放大传代至7l的生物反应器中，培养液体积为4～5l，ph值设置为7.0，溶氧值设置为50％，转速设置为65r/min，37℃培养。当细胞密度为6.0×106/ml以上时，按0.01moi接种禽流感g株病毒，一次性添加终浓度为8μg/ml的胰酶溶液，培养42～54h，取样检测ha效价，当ha效价不低于8log2时，收获病毒液。
2病毒液的浓缩
分别将ndv和h9aiv病毒液各取3000ml，使用美国pallcorporation超滤系统，选用截留分子量为100kd的超滤膜，浓缩至原体积的1/2。
3病毒液的灭活
3.1新城疫病毒液的灭活将2倍浓缩的ndvasg10株病毒液加入终浓度为0.1％的甲醛，水浴加热至37℃，开始计时，进行37℃恒温灭活20h，每隔2小时摇匀一次，灭活后取病毒液测定其ha效价，并进行灭活检验。
3.2禽流感病毒的液灭活将2倍浓缩的h9aivg株病毒液加入终浓度为0.2％的甲醛，水浴加热至37℃，开始计时，进行37℃恒温灭活18h，每隔2小时摇匀一次，灭活后取病毒液测定其ha效价，并进行灭活检验。
4疫苗的配制
4.1水相的制备将灭活的ndv、aiv两种抗原按体积比2:1混合，取混合后的抗原94体积份，加入灭菌冷却后的吐温-806体积份，充分搅拌直至吐温-80完全溶解，制备成水相。
4.2油相的制备取注射用白油92体积份，司本-808体积份搅拌混匀，灭菌后冷却备用。
4.3乳化水相与油相按1:1.5的体积比，先将油相输入乳化罐中搅拌再缓慢加入水相，继续搅拌使油相与水相充分混匀，然后通过剪切机在线乳化。
实施例3本发明二联疫苗的制备
1病毒在细胞上的增殖
1.1鸡新城疫病毒在悬浮细胞上的增殖
将age1细胞放大传代至7l的生物反应器中，培养液体积为4～5l，ph值设置为7.15，溶氧值设置为60％，转速设置为75r/min，37℃培养。当细胞密度为8.0×106/ml以上时，按0.0001moi接种新城疫病毒asg10株病毒，同时添加体积比为20％的无血清dmem培养基，一次性添加终浓度为20μg/ml的胰酶溶液，将培养温度调至37℃，培养64～80h，取样检测ha效价，当ha效价不低于8log2时，收获病毒液。
1.2禽流感病毒在悬浮细胞上的增殖
将mdck细胞放大传代至7l的生物反应器中，培养液体积为4～5l，ph值设置为7.0，溶氧值设置为50％，转速设置为65r/min，37℃培养。当细胞密度为6.0×106/ml以上时，按0.01moi接种禽流感g株病毒，一次性添加终浓度为16μg/ml的胰酶溶液，培养42～54h，取样检测ha效价，当ha效价不低于8log2时，收获病毒液。
2病毒液的浓缩
分别将ndv和h9aiv病毒液各取3000ml，使用美国pallcorporation超滤系统，选用截留分子量为100kd的超滤膜，浓缩至原体积的1/2。
3病毒液的灭活
3.1新城疫病毒液的灭活将2倍浓缩的ndvasg10株病毒液加入终浓度为0.1％的甲醛，水浴加热至37℃，开始计时，进行37℃恒温灭活20h，每隔2小时摇匀一次，灭活后取病毒液测定其ha效价，并进行灭活检验。
3.2禽流感病毒的液灭活将2倍浓缩的h9aivg株病毒液加入终浓度为0.2％的甲醛，水浴加热至37℃，开始计时，进行37℃恒温灭活18h，每隔2小时摇匀一次，灭活后取病毒液测定其ha效价，并进行灭活检验。
4疫苗的配制
4.1水相的制备将灭活的ndv、aiv两种抗原按体积比1:2混合，取混合后的抗原98体积份，加入灭菌冷却后的吐温-802体积份，充分搅拌直至吐温-80完全溶解，制备成水相。
4.2油相的制备取注射用白油96体积份，司本-804体积份搅拌混匀，灭菌后冷却备用。
4.3乳化水相与油相按1:2.5的体积比，先将油相输入乳化罐中搅拌再缓慢加入水相，继续搅拌使油相与水相充分混匀，然后通过剪切机在线乳化。
实验例1细胞源疫苗的免疫原性研究
选取1批鸡胚源鸡新城疫、禽流感(h9亚型)二联灭活疫苗，以及实施例1所得到的3批细胞源生产的新城疫、禽流感二联灭活疫苗进行免疫原性试验。
其中，鸡胚源疫苗的配制方法如下：
取1批鸡胚生产的ndv和aiv浓缩灭活抗原液，按照实施例1第4节的方法配制成鸡新城疫、禽流感(h9亚型)二联灭活疫苗，批号为j01。
1鸡新城疫部分的免疫及攻毒
用30～60日龄spf鸡40只分为4组，10只/组，分别经颈部皮下注射4批疫苗20μl/只，另取5只鸡不免疫作对照。免疫后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，用鸡新城疫病毒(asg10株)血凝抑制试验抗原测定hi抗体效价。免后28日细胞源的nd部分抗体平均水平在7.3～7.7log2，远远高出标准6log2，而鸡胚源的抗体均值为6.3log2，低于细胞源。
采血后每只鸡各肌肉注射鸡新城疫强毒sg10株0.2ml(含105.0eld50)，观察14日，并在攻毒后第5日采集鸡泄殖腔拭子，接种10日龄spf鸡胚，进行病毒分离。攻毒后对照鸡在5日内均全部死亡，免疫组均无新城疫临床症状，细胞源免疫组鸡病毒分离均10/10阴性，鸡胚源免疫组病毒分离为9/10阴性，细胞源保护效果更好。结果详见表5。
表5鸡新城疫部分的效力试验结果
注：“/”表示无此项。
2禽流感部分的免疫及攻毒
用21～35日龄spf鸡40只，分为4组，10只/组，分别经颈部皮下注射4批疫苗0.25ml/只，另取5只鸡不免疫作对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，用禽流感病毒(g株)血凝抑制试验抗原测定hi抗体效价。免后21日细胞源的ai部分抗体平均水平在9.1～9.5log2，远远高出标准7log2，而鸡胚源的抗体均值为8.8log2，低于细胞源。
采血后每只鸡各静脉注射h9亚型禽流感病毒g株0.2ml(含106.0eid50)。攻毒后第5日，分别采集每只鸡的喉头及泄殖腔棉拭子，混合后经尿囊腔接种10日龄spf鸡胚进行病毒分离，细胞源免疫组鸡均10/10病毒分离阴性，鸡胚源免疫组9/10病毒分离阴性，对照组鸡5/5病毒分离阳性，细胞源保护效果更好。结果详见表6。
表6禽流感部分的效力试验结果
抗体检测和攻毒试验结果显示，鸡胚源和细胞源两种灭活疫苗抗体效价均符合规定，攻毒保护试验均能达到保护效果，但细胞源产生的抗体的水平较鸡胚源更高，保护效果更强，并且三个批次的疫苗试验结果批间差异小，表明该生产工艺稳定、质量可控，可用于大规模生产。
综上，本发明全悬浮细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的制备方法，能够得到高滴度的病毒；通过本发明的方法制备得到的二联疫苗，能够产生比鸡胚苗更高的抗体，提供更强的保护。