一种罗布麻多糖提取物的提取方法、罗布麻多糖提取物及应用与流程

本发明属于天然植物有效成分分离及化妆品添加剂领域，特别是涉及罗布麻多糖提取物在制备抗炎产品中的应用。

背景技术：

罗布麻(apocynumvenetuml.)为捩花目夹竹桃科罗布麻属直立半灌木，叶、根、茎、花、全草均可入药，属于多年生宿根草本植物，具有很强的抗逆性，作为药用植物被收录在《中国药典（2015版）》一部。罗布麻因罗布泊而得名，主要分布于中国辽宁、吉林、内蒙古、甘肃、新疆、陕西、山西等地区。传统中医记载罗布麻叶具有清凉泻火，强心利尿，降血压等功效，而大量药理实验表明，罗布麻活性成分对预防和治疗心血管疾病以及哮喘病、气管炎等呼吸系统疾病有较好的疗效。而作为一种富含植物多糖的天然化妆品原料，目前尚未发现罗布麻在美白方面的应用。

色素沉着是一种非常重要人体皮肤的自我保护机制，它是保护皮肤免受紫外线辐射损伤的首要屏障，但320mm-420mm的长波uva可以穿透到真皮层，激活络氨酸酶的活性，加速黑色素的分裂、增生，引发一系列如色斑、雀斑、黄褐斑和黑色素瘤等色素沉着症。许多研究已经证明，决定人体肤色最主要的因素是黑色素的含量和黑色素的分布，而络氨酸酶活性又决定了黑色素的生成能力，因此抑制络氨酸酶活性及抑制黑色素生成是发挥美白作用的核心机理。

传统的美白添加剂成分均具有细胞毒性、刺激性、致敏性及不良反应大等缺点，其中如汞、氢醌等已被列为化妆品禁用成分，而天然植物成分素来有温和、安全性高、刺激性小等优点。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种罗布麻多糖提取物的提取方法及其在美白化妆品中的应用。本发明提供的制备方法有提取工艺简单、能够降低提取成本和易于扩大生产的优势，通过水提醇沉的方法可以保证所得产物是一种杂质较少的罗布麻多糖提取物，同时该方法提取得到的罗布麻多糖提取物是一种易溶于水、安全性高的美白化妆品原料。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种罗布麻多糖提取物的提取方法，包括以下步骤：

（1）罗布麻与水混合后进行提取得到第一混合物；所述罗布麻与水的料液比为1g:（16~18）ml；

（2）对第一混合物进行回流提取和第一离心，分离收集滤液和滤渣；

（3）取滤渣按步骤（2）的条件再次提取两次，合并三次滤液得到合并滤液；

（4）对合并滤液进行第二离心，取上清液进行浓缩，得到浓缩液；

所述浓缩包括：当浓缩液与上清液的体积比为1:（15~25）时，停止浓缩；

（5）将浓缩液与无水乙醇混合，得到混合液，对混合液进行第一静置和第三离心，得到沉淀；

（6）将沉淀于-30℃~-50℃的环境中进行第二静置，冷冻干燥，得到罗布麻多糖提取物。

优选的，所述步骤（2）中，回流提取条件为提取温度90~93℃，提取时间190~220min。

优选的，所述步骤（2）中第一离心的转速为5000~6500r/min，第一离心的时间为8~15min；

所述步骤（4）中第二离心的转速为8000~10000r/min，第二离心的时间为5~8min；

所述步骤（5）中第三离心的转速为5000~6000r/min，第三离心的时间为10~12min。

优选的，所述步骤（4）中，浓缩的温度为40℃~50℃。

优选的，所述步骤（5）中，浓缩液与无水乙醇混合后，混合液中无水乙醇的终体积百分含量为75%~80%。

优选的，所述步骤（5）中，第一静置的时间为18~24h；

所述步骤（6）中，第二静置的时间为12~24h；所述步骤（6）中，冷冻干燥的时间为8~12h。

本发明提供了上述制备方法制备得到罗布麻多糖提取物。

本发明还提供了一种含有罗布麻多糖提取物的美白产品，所述美白产品包括上述提取方法提取得到的罗布麻多糖提取物和辅料。

本发明提供了上述提取方法提取得到的罗布麻多糖提取物在制备美白产品中的应用。

本发明提供了上述提取方法提取得到的罗布麻多糖提取物在制备具有美白功能的化妆品中的应用。

本发明还提供了一种基于上述提取方法提取得到的罗布麻多糖提取物的美白化妆品，包括以下质量%的组分：peg-4橄榄油酸酯（olivem®700）2.00~4.00%、鲸蜡硬脂醇0.50~2.00%、1，3-丁二醇2.00~8.00%、棕榈酸以及己酯3.00~6.00%、辛酸/癸酸甘油三酯1.00~3.00%、二甲基聚硅氧烷（350cps）0.50~1.50%、矿油2.00~8.00%、鲸蜡基peg/ppg-15/15丁基醚聚二甲基硅氧烷1.00~4.00%、黄原胶0.10~0.40%、卡波姆[carbopo（®uitrez21）]0.10~0.20%、甘油2.00~4.00%、罗布麻多糖提取物0.20~1.00%、苯氧乙醇/乙基己基甘油0.30~0.70%、香精0.20~0.40%、三乙醇胺调ph至5.5，余量为去离子水。

本发明提供了一种罗布麻多糖提取物的提取方法，包括以下步骤：用去离子水和无水乙醇提取罗布麻中的有效物质，得到罗布麻多糖提取物。由实施例数据可知，本发明通过优化提取工艺，有效提高了罗布麻多糖的提取量，提取率高达0.598%，还简化了罗布麻多糖提取物的提取步骤。本发明提取得到的罗布麻多糖提取物安全性高，能通过抑制络氨酸酶活性，减少黑色素生产起到美白的技术效果。

附图说明

图1为料液比对罗布麻多糖提取率的影响；

图2为提取温度对罗布麻多糖提取率的影响；

图3为提取时间对罗布麻多糖提取率的影响；

图4为料液比和提取温度对罗布麻多糖提取率交互作用影响的等高线和响应面图；

图5为料液比和提取时间对罗布麻多糖提取率交互作用影响的等高线和响应面图；

图6为提取温度和提取时间对对罗布麻多糖提取率交互作用影响的等高线和响应面图。

具体实施方式

本发明提供了一种罗布麻多糖提取物的提取方法，包括以下步骤：

（1）罗布麻与水混合后进行提取得到第一混合物；所述罗布麻与水的料液比为1g:（16~18）ml；

（2）对第一混合物进行回流提取和第一离心，分离收集滤液和滤渣；

（3）取滤渣按步骤（2）和（3）的条件再次提取两次，合并3次滤液得到合并滤液；

（4）对合并滤液进行第二离心，取上清液进行浓缩，得到浓缩液；

所述浓缩包括：当浓缩液与上清液的体积比为1:（15~25）时，停止浓缩；

（5）将浓缩液与无水乙醇混合，得到混合液，对混合液进行第一静置和第三离心，得到沉淀；

（6）将沉淀于-30℃~-50℃的环境中进行第二静置，冷冻干燥，得到罗布麻多糖提取物。

本发明提供的提取方法提取工艺简单，提取成本低廉，易于扩大生产；还有效提高罗布麻多糖的提取量的效果，罗布麻多糖的提取率高达0.598%，能够极大程度的提高对罗布麻的利用程度。

本发明将罗布麻的粉末与去离子水混合后进行提取得到第一混合物；所述罗布麻的粉末与去离子水的料液比为1g:（16~18）ml，进一步优选为1g:17.5ml；所述粉末的粒径优选为过120目筛；在本发明中。所述提取的温度优选为90℃~93℃，进一步优选为92℃，提取的时间优选为190~220min，进一步优选为200min。

得到第一混合物后，本发明对第一混合物进行第一离心，分离收集滤液和滤渣；在本发明中，所述第一离心的转速优选为5000~6500r/min，，进一步优选为5000r/min；第一离心的时间优选为8~15min，进一步优选为15min。

分离收集滤液和滤渣后，取滤渣按步骤（2）和（3）的条件再次提取两次，合并3次滤液得到合并滤液。

得到合并滤液后，本发明对合并滤液进行第二离心，取上清液进行浓缩，得到浓缩液；所述浓缩包括：当浓缩液与上清液的体积比为1:（15~25），进一步优选为1:20时，停止浓缩；所述第二离心的转速优选为8000~10000r/min，进一步优选为9000r/min，第二离心的时间优选为5~8min，进一步优选为6min；所述浓缩的温度优选为40℃~50℃，进一步优选为45℃。

得到浓缩液后，本发明将浓缩液与无水乙醇混合，得到混合液，对混合液进行第一静置和第三离心，得到沉淀；所述浓缩液与无水乙醇混合后，混合液中无水乙醇的终体积百分含量优选为75%~80%，进一步优选为75%；所述第三离心的转速优选为5000~6000r/min，进一步优选为5000r/min；第三离心的时间优选为10~12min，进一步优选为12min；所述第一静置的时间优选为18~24h，进一步优选为24h。

得到沉淀后，本发明将沉淀于-30℃~-50℃，进一步优选为-40℃的环境中进行第二静置，冷冻干燥，得到罗布麻多糖提取物；在本发明中，所述第二静置的时间优选为12~24h，进一步优选为12h；所述冷冻干燥的时间优选为8~12h，进一步优选为8h。

本发明通过对提取方法的各步骤进行优化，多个优化步骤相互配合能够有效提高提取方法的效率和效果。

本发明对上述提取原料等物品的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售产品即可。

本发明还提供了一种含有罗布麻多糖提取物的美白产品，所述美白产品包括上述提取方法提取得到的罗布麻多糖提取物和辅料。本发明提供的美白产品具有优越的美白效果，在斑马鱼胚胎细胞中表现出有效抑制络氨酸酶活性、减少黑色素生产的美白作用。

本发明提供了上述制备方法制备得到罗布麻多糖提取物。

本发明提供了上述提取方法提取得到的罗布麻多糖提取物在制备美白产品中的应用。

本发明提供了上述提取方法提取得到的罗布麻多糖提取物在制备具有美白功能的化妆品中的应用。

由本发明提供的提取方法提取得到的罗布麻多糖提取物易溶于水，在制备成具有美白功能的化妆品时不需要额外引入的刺激性有机溶剂，能够大幅度提高具有美白功能的化妆品的安全性。

本发明还提供了一种基于上述提取方法提取得到的罗布麻多糖提取物的美白化妆品，包括以下质量%的组分：peg-4橄榄油酸酯（olivem®700）2.00~4.00%、鲸蜡硬脂醇0.50~2.00%、1，3-丁二醇2.00~8.00%、棕榈酸以及己酯3.00~6.00%、辛酸/癸酸甘油三酯1.00~3.00%、二甲基聚硅氧烷（350cps）0.50~1.50%、矿油2.00~8.00%、鲸蜡基peg/ppg-15/15丁基醚聚二甲基硅氧烷1.00~4.00%、黄原胶0.10~0.40%、卡波姆[carbopo（®uitrez21）]0.10~0.20%、甘油2.00~4.00%、权利要求1~6任一项所述罗布麻多糖提取物0.20~1.00%、苯氧乙醇/乙基己基甘油0.30~0.70%、香精0.20~0.40%、三乙醇胺调ph至5.5，余量为去离子水。

在本发明中，上述化妆品的制备步骤优选包括以下步骤：

1）制备油相：首先准确称取peg-4橄榄油酸酯、鲸蜡硬脂醇、1，3-丁二醇、棕榈酸以及己酯、辛酸/癸酸甘油三酯、二甲基聚硅氧烷、矿油、鲸蜡基peg/ppg-15/15丁基醚聚二甲基硅氧烷，加热至80℃完全熔化；

2）制备水相：准确称取黄原胶、卡波姆、甘油，加入体系所需去离子水中，加热至80℃，搅拌溶解至透明；

3）将水相加入至油相以10000rpm/min的速度均质30s~1min；

4）加入三乙醇胺调节ph至5.5-6.0；

5）将体系搅拌降温至35℃，依次加入罗布麻多糖、苯氧乙醇/乙基己基甘油、香精，继续搅拌均匀；冷却，无菌静置24h后，灌装即得成品。

本发明对上述辅料的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售产品即可。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种罗布麻多糖提取物的提取方法、罗布麻多糖提取物及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

响应面法优化罗布麻多糖提取物的提取工艺

1实验材料与仪器

1.1实验仪器

罗布麻（产于新疆维吾尔自治区阿勒泰地区）江苏省南京野生植物综合利用研究院提供；nh-4数显恒温水浴锅（江苏省金坛市三坛仪器厂）；shz-dⅲ循环式真空泵（巩义市予华仪器责任有限公司）；re-52aa旋转蒸发器（上海亚荣生工仪器厂）；kf-1209型号的电子天平（中国凯丰集团有限公司）；fa2004hm电子天平（常州万泰仪器有限公司）；bcd-183a型号冰箱（合肥荣事达有限公司）；tg1650-ws台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；ds-1组织粉碎机（北京华欣科创科技有限公司）；真空冷冻干燥机（上海继谱电子科技有限公司）；t6紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；

1.2实验试剂

葡萄糖对照品（上海源叶生物科技有限公司）；分析纯乙醇、苯酚和硫酸（南京化学试剂股%有限公司）。

2实验方法

2.1多糖提取及测定方法

2.1.1罗布麻多糖提取物提取

以水作为提取剂，采用水提醇沉法提取罗布麻多糖提取物的提取物。将罗布麻叶片除杂干燥，粉碎后过120目筛，准确称量10.00g罗布麻片粉末，按1:16的料液比加入去离子水，设定提取温度为90℃，提取60min，5000r/min离心10min后，取上清液收集，取滤渣继续按上述实验条件提取两次，合并三次滤液，9000r/min离心5min后取上清液，在45℃条件下减压浓缩至1/20后，加入无水乙醇至溶液中乙醇浓度为75%，静置24h后，在5000r/min条件下离心10min，取沉淀置于-40℃冰箱中冷冻12h后，冷冻干燥8h收集固体粉末，即得罗布麻多糖提取物。

2.1.2标准曲线

准确称取葡萄糖标准品10.0mg，置于100ml的容量瓶中，用纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，得葡萄糖标准品溶液，将葡萄糖标准品溶液稀释成浓度为0.01，0.02，0.03，0.04和0.05mg/ml的溶液，分别精密吸取20μl标准液依照2.1.3的方法测定多糖含量，得线性关系良好的回归方程。

2.1.3样品测定

采用苯酚-硫酸法测定2.1.1提供的罗布麻多糖提取物中罗布麻多糖的含量，向罗布麻多糖提取物样品中加足量纯水充分溶解样品后，取100μl稀释液加入试管中，再依次加入1900μl水，1ml8%苯酚溶液，5ml硫酸溶液，沸水浴20min后放入冰水中，在a490nm处测定最大吸光值，测定公式如下。

其中y为罗布麻多糖的提取率，单位为%；ρ为罗布麻多糖提取物溶液浓度，单位为mg/ml；v为溶解罗布麻多糖提取物所消耗的纯水体积，单位为ml；x为提取罗布麻多糖提取物所用的罗布麻叶片质量，单位为g。

2.2单因素实验

（1）料液比

精密称取罗布麻全草粉末10.0g，共3%，分别加入8、16、24倍体积的水在90℃下提取3次，每次3h，按2.1.3项下方法测定罗布麻多糖提取率。

（2）提取温度

精密称取罗布麻粉末10.0g，共3%，加入16倍体积的水分别在80℃、90℃、100℃下提取3次，每次2h，按2.1.3项下方法测定罗布麻多糖提取率。

（3）提取时间

精密称取罗布麻粉末10.0g，共4%，加入16倍体积的水在90℃下提取3次，分别提取1h、2h、3h、4h，按2.1.3项下方法测定罗布麻多糖提取率。

2.3响应面法优化实验设计

以罗布麻多糖提取率相应数值作为y，以料液比a，提取温度b，提取时间c为自变量，来进行响应面法分析实验。另外进行实验的响应面的控制因素以及相关的数据水平表见表1。

表1响应面实验因素水平表

（4）2.4数据处理

所有数据均为平均值±平均标准误差（s.e.m）。数据分析使用spss12.0软件完成，响应面实验设计及结果分析使用design-expert10.0软件完成。

3结果与分析

3.1标准曲线绘制

计算得知，葡萄糖标准品的吸光值与其质量浓度呈线性关系，并且经过数据的归纳和分析，得到回归方程为：

y=0.0165x-0.0335，r2=0.9972（y为峰面积，x为质量浓度，r为相关因数）。

通过该结果，可以分析出，当罗布麻多糖的进样浓度控制在10~50μg/ml的范围时，其呈现的线性关系良好。

3.2单因素实验结果

（1）料液比对多糖提取率的影响见图1，图1为料液比对罗布麻多糖提取率的影响的折线图。

由图1可知，料液比在1:8到1:16多糖提取率逐渐升高，料液比为1:16时达到一高峰，此时为一峰值，多糖提取率在1:16至1:24时几乎没有变化，造成这一结果的原因可能是料液比在1：16左右时罗布麻叶多糖已经被充分提取。因此，料液比选择为1:16。

（2）提取温度对多糖提取率的影响见图2，图2为提取温度对罗布麻多糖提取率的影响的折线图。

由图2可知，在90℃之前，随着温度的升高，多糖提取率也会增加，在90℃时达到最大峰值，从90℃至100℃时多糖提取率逐渐下降，究其原因可能是温度过低时多糖不能得到充分提取，温度过高则可能导致部分多糖降解。因此提取温度选择为90℃。

（3）提取时间对多糖提取率的影响见图3，图3为提取时间对罗布麻多糖提取率的影响的折线图。

由图3可知，提取时间在1h到3h时，随着时间的增加，多糖提取率呈现先增加后降低的趋势，提取时间为3h时达到最峰值，在3h至4h反而略有下降，原因可能是过长时间保持较高温度的提取导致部分罗布麻叶多糖讲解。因此，提取时间选择为3h。

3.3响应面实验结果及分析

（1）响应面法设计及结果

以罗布麻多糖提取率相应数值作为y，以料液比a，提取温度b，提取时间c作为研究的自变量，来进行响应面法分析实验。实验的方法和结果见表2。

表2box-behnken-design实验设计及结果

（2）多元二次响应面回归模型的建立和方差分析

响应面法比传统的单参数方法更加优化，而且节省时间，节省材料。

根据表2所得结果，对响应面实验结果进行分析可以得知，

罗布麻多糖提取物的提取率=0.58+0.013a+0.012b+0.024c+0.008ab+0.00425ac+0.00425bc-0.029a2-0.016275b2-0.018c2，相关系数r2=0.9784。

根据响应面实验结果进行方差分析，见表3。

表3实验结果方差分析表

“*”表示对结果影响显著（p＜0.05），“**”表示对结果影响极显著（p＜0.01）

由表3可知，模型的“pr＞f”＜0.01，所以该模型是高度显著的。失拟项“pr＞f”=0.3147不显著，说明选取的这个模型是合理的，可以通过此模型来预测罗布麻多糖提取物最优提取条件。回归方程中a、b、a2、b2、c2对罗布麻多糖提取物提取率影响极显著，b对多糖提取率影响显著，说明料液比、提取温度和提取时间都对罗布麻多糖提取物提取率影响明显，并且各因素之间有相互作用关系，说明几个因素对多糖提取率的影响并不是简单的线性关系。研究方程的变量系数值可看出，各个影响因素对多糖提取两次影响大小的关系是提取时间＞料液比＞提取温度。

（3）响应面法分析因素间的相互作用

根据回归方程，固定1个因素在零水平上，研究另外2个因素间的相互作用效应，做响应曲面图，分析各实验因素对多糖提取率的影响以及个因素间的交互效应；响应面影响因素料液比（a）和提取温度（b）、提料液比（a）和提取时间（c）、提取温度（b）和提取时间（c）的交互作用的等高线和响应面分别如图4-6所示。如果响应面坡度比较平缓表示两因素交互作用不显著，如果坡度相对而言较陡小时两因素交互作用比较显著；形状不同的等高线可反映出交互效应的强与弱，越密集的等高线，表明二者交互作用更加显著，等高线越疏则相反，椭圆形的等高线表示两因素交互组非常显著，而圆形则相反。

如图4-6，等高线和响应面图显示出在将一个因素固定在零水平条件下，其他两个因素对罗布麻叶多糖提取率的影响。其中料液比和提取时间的交互作用、提取温度和提取时间的交互作用对多糖提取率的影响非常显著，而料液比和提取温度交互作用较为显著，表现为曲线较为平缓。如图4，多糖提取率随着料液比和提取温度的增大先增大后减小。如图5，多糖提取率随着提取时间的延长逐渐增高，随着料液比的增大先增大后减小。如图6，多糖提取率在一定范围内随着提取时间和提取温度的增大逐渐增大，达到最大值后不再提高。综合等高线图和响应面图得出，提取时间、提取温度和料液比对多糖提取率都具有显著极影响性（p＜0.01）。

2.5验证实验

根据响应面法软件对各种参数的最优化相关结果进行系列分析，理想状态下得出最优条件参数为料液比1：17.462（g/ml），提取温度92.858℃，提取时间3.403h，罗布麻中多糖提取率理论值为0.598%。为了验证此方法的可靠性与其可行性，在条件最优情况下进行实验。

考虑到在实际实验中各方面操作的可行性与方便性，为了与实际操作契合，将多糖的最佳提取条件修改成料液比1：17.5（g/ml），提取温度93℃，提取时间3.4h进行验证，此时实验结果得出罗布麻中多糖提取率的实际值为0.600%，与理论值仅存在0.002%的相对误差，非常接近理论值。通过响应面法精心设计的实验，使得多糖提取率得到很大提高。因此，利用响应面分析法得到的罗布麻提取条件真实可靠，具有实际利用价值。

综合响应面法优化结果，结合实际生产需求，确定罗布麻多糖提取物的提取工艺为：罗布麻准确称量后粉碎，过120目筛，按1:16~18的料液比加入去离子水，设定提取温度为90℃~95℃，提取100~120min，5000~6500r/min离心8~15min后，取上清液收集，取滤渣继续按上述实验条件提取两次，合并三次滤液，8000~10000r/min离心5~8min后取上清液，在40℃~50℃条件下减压浓缩至1/（15~25）后，加入无水乙醇至溶液中乙醇浓度为75~80%，静置18~24h后，在5000~60000r/min条件下离心10~12min，取沉淀置于-30~-50℃冰箱中保存12~24h，冷冻干燥8~12h后收集固体粉末，即得罗布麻多糖提取物。

实施例2

含罗布麻多糖提取物的美白化妆品的制备方法

按照以下质量%准备组分：

peg-4橄榄油酸酯（olivem®700）3.00%、鲸蜡硬脂醇1.00%、1，3-丁二醇3.00%、棕榈酸以及己酯5.00%、辛酸/癸酸甘油三酯2.00%、二甲基聚硅氧烷（350cps）1.00%、矿油4.00%、鲸蜡基peg/ppg-15/15丁基醚聚二甲基硅氧烷3.00%、黄原胶0.20%、卡波姆[carbopo（®uitrez21）]0.10%、甘油1.00%、实施案例1提供的罗布麻多糖0.50%、苯氧乙醇/乙基己基甘油0.50%、香精0.30%、三乙醇胺调ph至5.5，余量为去离子水。

制备步骤如下：1）制备油相：首先准确称取peg-4橄榄油酸酯、鲸蜡硬脂醇、1，3-丁二醇、棕榈酸以及己酯、辛酸/癸酸甘油三酯、二甲基聚硅氧烷、矿油、鲸蜡基peg/ppg-15/15丁基醚聚二甲基硅氧烷，加热至80℃完全熔化；2）制备水相：准确称取黄原胶、卡波姆、甘油，加入体系所需去离子水中，加热至80℃，搅拌溶解至透明；3）将水相加入至油相以10000rpm/min的速度均质30s~1min；4）加入三乙醇胺调节ph至5.5-6.0；5）将体系搅拌降温至35℃，依次加入罗布麻多糖、苯氧乙醇/乙基己基甘油、香精，继续搅拌均匀；冷却，无菌静置24h后，灌装即得成品。

实施例3

罗布麻多糖提取物的安全性实验

1实验方法

1.1实验用鱼及其受精卵的采集

将性成熟斑马鱼雌雄分缸饲养于斑马鱼养殖单元中。水温：26±2℃；ph7.2；电导率：520µs/cm；光照/黑暗周期：14h:10h。暴露实验开始前一天将斑马鱼以雌雄比为1:2配对，光照刺激下自然交配产卵。

1.2暴露实验

1.2.1鱼胚安全性实验

（1）挑选发育至0~3hpf（hourspost-fertilization）的健康斑马鱼鱼胚置于6孔细胞培养板中，20尾/孔，每孔加入5ml一定浓度的实施例1提供的罗布麻多糖提取物的溶液。以斑马鱼养殖水为空白对照组。

（2）分别于24hpf、48hpf和72hpf时在体视显微镜下观察并统计鱼胚的孵化、畸形和死亡数量。其中畸形形态包括：头部畸形、心包水肿、卵黄囊水肿、血液堵塞、脊柱弯曲、尾部弯曲、发育迟缓等；死亡状态判断为：卵黄囊凝结、心跳停止。

2实验结果

2.1罗布麻多糖提取物和对鱼胚安全性的影响

罗布麻多糖提取物对鱼胚死亡率、孵化率和畸形率的影响见表4、5、6。

表4罗布麻多糖提取物对鱼胚死亡率（%）的影响

注：与空白对照组比较：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

表5罗布麻多糖提取物对鱼胚孵化率（%）的影响

注：与空白对照组比较：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

表6罗布麻多糖提取物对鱼胚畸形率（%）的影响

注：与空白对照组比较：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

注：死亡率%=死亡胚胎数/n×100%；孵化率%=孵化胚胎数/存活胚胎数×100%；畸形率%=（死亡胚胎数+畸形胚胎数）/n×100%。

通过分析表4~表6可知，罗布麻多糖提取物浓度一直至8%时在致死量、孵化率及畸形率三方面均无显著性差异，可以得出结论即本发明提供的罗布麻多糖在至少8.0%的浓度下是安全的，无任何毒副作用的。

实施例5

罗布麻多糖提取物减缓传统防腐剂负面作用实验

1实验方法

参见实施例4实验方法，设定空白对照组、1%苯氧乙醇组和添加1%苯氧乙醇的实施例1提供的罗布麻多糖提取物组（下面简称样品），探究其对鱼胚死亡率和畸形率的影响。

2实验结果

2.1样品对鱼胚安全性的影响

（1）1%苯氧乙醇对鱼胚死亡率和畸形率的影响见表7和表8。

表71%苯氧乙醇对鱼胚死亡率（%）的影响

注：与空白对照组比较：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

表81%苯氧乙醇对鱼胚畸形率（%）的影响

注：与空白对照组比较：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

（2）样品对鱼胚死亡率和畸形率的影响见表9和表10。

表9样品对鱼胚死亡率（%）的影响

注：与空白对照组比较：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

表10样品对鱼胚畸形率（%）的影响

注：与空白对照组比较：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

注：死亡率%=死亡胚胎数/n×100%；畸形率%=（死亡胚胎数+畸形胚胎数）/n×100%

通过分析表7、表9可知，罗布麻多糖提取物和苯氧乙醇协同作用时对苯氧乙醇致死率无影响，但是对比表8、表10可知，两者在协同作用时，罗布麻多糖提取物在一定程度上可以减弱传统防腐剂苯氧乙醇的致畸作用。

实施例6

罗布麻多糖的美白实验

1实验方法

1.1黑色素生成研究

1.1.1挑选受精卵后9hpf（hourspost-fertilization）的健康ab系斑马鱼胚胎随机置于6孔细胞培养板，30枚/孔，每孔加入5ml溶液。实验另设立阳性对照组（熊果苷）和空白对照组（斑马鱼养殖水），每组设3个复孔。置于曲线控制生化培养箱中孵育。

1.1.2孵育至72h时加入裂解液溶液，并超声制备成匀浆液。离心，取沉淀，并震动使离心管中黑色素充分溶解。取100μl溶液置于96孔板中，用酶标仪于405nm波长处测定吸光度。按下列公式计算样品对黑色素合成的抑制率:

1.2酪氨酸酶活性研究

1.2.1挑选受精卵后9hpf（hourspost-fertilization）的健康ab系斑马鱼胚胎随机置于6孔细胞培养板，30枚/孔，每孔加入5ml溶液。实验另设立阳性对照组（熊果苷）和空白对照组（斑马鱼养殖水），每组设3个复孔。置于曲线控制生化培养箱中孵育。

1.2.2孵育至72h时加入裂解液溶液，并超声制备成匀浆液。离心，取上清液置于96孔板中，同时加入左旋多巴溶液，孵育1h。使用酶标仪检测各实验组的吸光值（od475值）。酪氨酸酶活性抑制率按下列公式计算:

2实验结果

2.1黑色素生成研究

罗布麻多糖对斑马鱼黑色素生成的抑制效果见表11。由表11可知，空白对照组斑马鱼体内存在大量黑色素沉着，罗布麻多糖处理组斑马鱼体内黑色素沉着则显著减少，其中随着罗布麻多糖浓度增大，斑马鱼体内黑色素沉着也在相应减少，即当罗布麻多糖浓度大于等于0.2%时，对斑马鱼体内黑色素合成有抑制作用，且与浓度呈正相关性。

表11罗布麻多糖对黑色素抑制率的影响

（注：**表示具有统计学差异，**p＜0.01）

2.2络氨酸酶活性研究

罗布麻多糖对斑马鱼络氨酸酶活性研究的结果见表12。由表12可知，当罗布麻多糖浓度大于等于0.2%时，对斑马鱼体内络氨酸酶活性有较强的的抑制作用，且与浓度呈正相关。

表12罗布麻多糖对络氨酸酶活性抑制率的影响

（注：**表示具有统计学差异，**p＜0.01）