抗CD20抗体、抗CD37抗体及它们的混合物的制作方法

抗cd20抗体、抗cd37抗体及它们的混合物
技术领域：
：1.本文所述的发明属于重组抗体、编码它们的多核苷酸以及制备和使用此类分子的方法的领域。
背景技术：
：：2.抗cd20和抗cd37抗体已经在本领域中有描述并且显示出具有令人感兴趣的特性。参见例如，heider等人,anovelfc-engineeredmonoclonalantibodytocd37withenhancedadccandhighproapoptoticactivityfortreatmentofb-cellmalignancies,2011,blood118(15):4159-4168；manches等人,invitromechanismsofactionofrituximabonprimarynon-hodgkinlymphomas,2003,blood101:949-954。一些抗cd20抗体正在临床使用中。payandeh等人(2019),biomedpharmacother.109:2415-2426；2019。然而，当前使用抗cd20抗体治疗各种癌症的临床经验表明，尽管最初对治疗有响应，但许多患者对抗cd20抗体治疗具有抗性。smallg.w.等人,analysisofinnateandacquiredresistancetoanti-cd20antibodiesinmalignantandnonmalignantbcells,2013,peerj.1:e31；doi10.7717/peerj.31。在美国，目前没有抗cd37抗体被批准用于临床使用。因此，本领域存在对改进的抗cd20和/或抗cd37抗体和/或包括抗cd20抗体和/或抗cd37抗体的改进的治疗的需求。技术实现要素：3.本文提供了抗cd20和抗cd37抗体和组合，诸如含有至少一种抗人cd20(抗hcd20)和一种抗hcd37抗体的抗体混合物。在一个方面，此类混合物可以由单个细胞系产生，并且由于可能限制由所述细胞系产生的抗体种类的数量的一种或两种抗体改变，纯化由所述细胞系产生的各种抗体种类可能是不必要的。两种抗体都可以是灵长类动物、人或人源化igg抗体。此类混合物可以由单个宿主细胞系产生。在一个方面，本文所述的抗hcd20和/或抗cd37抗体可以分别结合人cd20(hcd20)和/或人cd37(hcd37)。这些抗体可以是人、灵长类动物和/或人源化抗体。在一些实施方案中，这些抗体还可以结合食蟹猴cd20(cynocd20)和/或cynocd37。如本领域已知的，与具有来自非人生物体的框架区的抗体(例如鼠或嵌合抗体)相比，人源化抗体在人类中具有降低的免疫原性。然而，与来自非人生物体的原始抗体相比，人源化抗体也可能具有降低的生物活性。本文所述的人源化抗hcd20或抗hcd37抗体或它们的混合物可以具有稳健的生物活性，例如抗原结合、在存在和/或不存在交联抗体的情况下的直接细胞杀伤、抗体依赖性细胞的细胞毒性(adcc)、补体依赖性细胞毒性(cdc)、b细胞耗竭和/或肿瘤细胞的体外和/或体内杀伤。此外，用含有本文所述的抗hcd20和抗hcd37抗体的混合物的产品治疗患者与单独的抗hcd20或抗hcd37抗体的那些产品相比可能具有增加的生物活性。在使用这些抗体混合物或编码这些混合物的多核苷酸治疗癌症的情况下，在减少或消除癌症方面的功效率可能高于和/或癌症的复发率可能低于使用单独的抗hcd20或抗hcd37抗体时观察到的那些。4.更具体地，本文描述了抗hcd20抗体、抗hcd37抗体及它们的混合物，以及编码此类抗体的多核苷酸和含有此类多核苷酸的混合物或载体，以及制备和使用所述抗体、抗体混合物、多核苷酸和载体的方法。下面编号的条目更详细地描述了这些组合物和方法。5.1.一种包含含hc可变结构域(vh)的重链(hc)和含lc可变结构域(vl)的轻链(lc)的抗人cd20(抗hcd20)抗体，6.其中所述vh包含相对于seqidno:12含有不超过12个、11个、十个、九个、八个、七个、六个或五个改变的氨基酸序列，7.其中所述vl包含相对于seqidno:8含有不超过七个、六个或五个改变的氨基酸序列，并且8.其中所述抗hcd20抗体可以在直接细胞杀伤测定中直接杀伤至少40％的wsu-dlcl2细胞，所述直接细胞杀伤测定是在没有交联抗体的情况下在测定中使用10μg/ml浓度的抗hcd20抗体进行的。9.2.如条目1所述的抗hcd20抗体，10.其中所述vh和所述vl各自包括互补决定区1(cdr1)、cdr2和cdr3，并且11.其中所述vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3(a)分别包含seqidno:1、2、3、4、5和6的氨基酸序列，和/或(b)包含由分别编码seqidno:1、2、3、4、5和6的核苷酸序列编码的氨基酸序列。12.3.如条目1或2所述的抗hcd20抗体，13.其中所述vh包含相对于seqidno:12含有不超过四个或三个改变的氨基酸序列，并且14.其中所述vl包含相对于seqidno:8含有不超过四个或三个改变的氨基酸序列。15.4.如条目3所述的抗hcd20抗体，16.其中所述vh包含相对于seqidno:12含有不超过两个或一个改变的氨基酸序列，并且17.其中所述vl包含相对于seqidno:8含有不超过两个或一个改变的氨基酸序列。18.5.如条目4所述的抗hcd20抗体，其中：19.(a)所述vh包含(1)seqidno:12的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:12的核苷酸序列编码的氨基酸序列；并且20.(b)所述vl包含(1)seqidno:8的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列。21.6.如条目1至5中任一项所述的抗hcd20抗体，其中所述抗hcd20抗体是包含hc和lc的人或人源化igg抗体。22.7.如条目6所述的抗hcd20抗体，其中所述hc包含(a)seqidno:24的氨基酸序列和/或(b)由编码seqidno:24的核苷酸序列编码的氨基酸序列。23.8.如条目7所述的抗hcd20抗体，其中所述hc包含相对于seqidno:18含有不超过七个或六个改变的氨基酸序列。24.9.如条目8所述的抗hcd20抗体，其中所述hc包含相对于seqidno:18含有不超过五个或四个改变的氨基酸序列。25.10.如条目9所述的抗hcd20抗体，其中所述hc包含相对于seqidno:18含有不超过三个改变的氨基酸序列。26.11.如条目10所述的抗hcd20抗体，其中所述hc包含相对于seqidno:18含有不超过两个改变的氨基酸序列。27.12.如条目11所述的抗hcd20抗体，其中所述hc包含相对于seqidno:18含有不超过一个改变的氨基酸序列。28.13.如条目12所述的抗hcd20抗体，其中所述hc包含(a)seqidno:18的氨基酸序列和/或(b)由编码seqidno:18的核苷酸序列编码的氨基酸序列。29.14.如条目7所述的抗hcd20抗体，其中所述hc包含(a)seqidno:36的氨基酸序列和/或(b)由编码seqidno:36的核苷酸序列编码的氨基酸序列。30.15.如条目7所述的抗hcd20抗体，其中所述hc包含(a)seqidno:45的氨基酸序列和/或(b)由编码seqidno:45的核苷酸序列编码的氨基酸序列。31.16.如条目1至7中任一项所述的抗hcd20抗体，其中：32.所述hc包含相对于seqidno:23含有不超过十二个、十一个、十个或九个改变的氨基酸序列；并且33.所述lc包含相对于seqidno:10含有不超过七个或六个改变的氨基酸序列。34.17.如条目16所述的抗hcd20抗体，其中：35.所述hc包含相对于seqidno:23含有不超过八个或七个改变的氨基酸序列；并且36.所述lc包含相对于seqidno:10含有不超过五个或四个改变的氨基酸序列。37.18.如条目17所述的抗hcd20抗体，其中：38.所述hc包含相对于seqidno:23含有不超过六个、五个或四个改变的氨基酸序列；并且39.所述lc包含相对于seqidno:10含有不超过三个或两个改变的氨基酸序列。40.19.如条目18所述的抗hcd20抗体，其中41.(a)所述hc包含(1)相对于seqidno:23含有不超过三个、两个、一个或零个改变的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:23的核苷酸序列编码的氨基酸序列；并且42.(b)所述lc包含(1)相对于seqidno:10含有不超过一个或零个改变的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:10的核苷酸序列编码的氨基酸序列。43.20.如条目6或7所述的抗hcd20抗体，44.其中所述抗hcd20抗体的所述hc包含239d和298a，并且45.其中所述hc包含相对于seqidno:35含有不超过七个或六个改变的氨基酸序列。46.21.如条目20所述的抗hcd20抗体，其中：47.所述hc包含相对于seqidno:35含有不超过五个或四个改变的氨基酸序列；并且48.所述lc包含相对于seqidno:10含有不超过五个或四个改变的氨基酸序列。49.22.如条目21所述的抗hcd20抗体，其中：50.所述hc包含相对于seqidno:35含有不超过三个改变的氨基酸序列；并且51.所述lc包含相对于seqidno:10含有不超过三个改变的氨基酸序列。52.23.如条目22所述的抗hcd20抗体，其中：53.所述hc包含相对于seqidno:35含有不超过两个改变的氨基酸序列；并且54.所述lc包含相对于seqidno:10含有不超过两个改变的氨基酸序列。55.24.如条目23所述的抗hcd20抗体，其中：56.所述hc包含相对于seqidno:35含有不超过一个改变的氨基酸序列；并且57.所述lc包含相对于seqidno:10含有不超过一个改变的氨基酸序列。58.25.如条目24所述的抗hcd20抗体，其中：59.(a)所述hc包含(1)seqidno:35的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:35的核苷酸序列编码的氨基酸序列；并且60.(b)所述lc包含(1)seqidno:10的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:10的核苷酸序列编码的氨基酸序列。61.26.如条目20所述的抗hcd20抗体，其中：62.(a)所述hc包含(1)seqidno:44的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:44的核苷酸序列编码的氨基酸序列；并且63.(b)所述lc包含(1)seqidno:10的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:10的核苷酸序列编码的氨基酸序列。64.27.如条目1至26中任一项所述的抗hcd20抗体，其中所述抗hcd20抗体可以在直接细胞杀伤测定中使用10μg/ml浓度的抗hcd20抗体直接杀伤至少50％的wsu-dlcl2细胞。65.28.一种抗人cd37(抗hcd37)抗体，所述抗hcd37抗体包含含有vh的hc和含有vl的lc，66.其中所述vh包含相对于seqidno:57含有不超过八个、七个、六个或五个改变的氨基酸序列，67.其中所述vl包含相对于seqidno:53含有不超过八个、七个、六个、五个或四个改变的氨基酸序列，并且68.其中所述抗hcd37抗体可以在直接细胞杀伤测定中直接杀伤至少50％的ramos细胞，所述直接细胞杀伤测定是在没有交联抗体的情况下使用10μg/ml浓度的抗hcd37抗体进行的。69.29.如条目28所述的抗hcd37抗体，70.其中所述vh和所述vl各自包含cdr1、cdr2和cdr3，并且71.其中所述vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3(a)分别包含seqidno:46、47、48、49、50和51的氨基酸序列，和/或(b)包含由分别编码seqidno:46、47、48、49、50和51的核苷酸序列编码的氨基酸序列。72.30.如条目28或29所述的抗hcd37抗体，73.其中所述vh包含相对于seqidno:57含有不超过四个改变的氨基酸序列，并且74.其中所述vl包含相对于seqidno:53含有不超过三个改变的氨基酸序列。75.31.如条目30所述的抗hcd37抗体，76.其中所述vh包含相对于seqidno:57含有不超过三个改变的氨基酸序列，并且77.其中所述vl包含相对于seqidno:53含有不超过两个改变的氨基酸序列。78.32.如条目31所述的抗hcd37抗体，79.其中所述vh包含相对于seqidno:57含有不超过两个改变的氨基酸序列，并且80.其中所述vl包含相对于seqidno:53含有不超过一个改变的氨基酸序列。81.33.如条目32所述的抗hcd37抗体，其中：82.(a)所述vh包含(1)相对于seqidno:57含有不超过一个或零个改变的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:57的核苷酸序列编码的氨基酸序列；并且83.(b)所述vl包含(1)seqidno:53的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:53的核苷酸序列编码的氨基酸序列。84.34.如条目28至33中任一项所述的抗hcd37抗体，85.其中所述hc包含相对于seqidno:59含有不超过十个、九个或八个改变的氨基酸序列，并且86.其中所述lc包含相对于seqidno:55含有不超过八个或七个改变的氨基酸序列。87.35.如条目34所述的抗hcd37抗体，88.其中所述hc包含相对于seqidno:59含有不超过七个或六个改变的氨基酸序列，并且89.其中所述lc包含相对于seqidno:55含有不超过五个改变的氨基酸序列。90.36.如条目35所述的抗hcd37抗体，91.其中所述hc包含相对于seqidno:59含有不超过五个或四个改变的氨基酸序列，并且92.其中所述lc包含相对于seqidno:55含有不超过四个或三个改变的氨基酸序列。93.37.如条目36所述的抗hcd37抗体，94.其中所述hc包含相对于seqidno:59含有不超过三个或两个改变的氨基酸序列，并且95.其中所述lc包含相对于seqidno:55含有不超过两个改变的氨基酸序列。96.38.如条目37所述的抗hcd37抗体，97.其中所述hc包含相对于seqidno:59含有不超过一个改变的氨基酸序列，并且98.其中所述lc包含相对于seqidno:55含有不超过一个改变的氨基酸序列。99.39.如条目38所述的抗hcd37抗体，100.(a)其中所述hc包含(1)seqidno:59的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:59的核苷酸序列编码的氨基酸序列，并且101.(b)其中所述lc包含(1)seqidno:55的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:55的核苷酸序列编码的氨基酸序列。102.40.如条目28或34所述的抗hcd37抗体，其中所述hc包含34v，并且所述lc包含31n。103.41.如条目28、34或40所述的抗hcd37抗体，其中所述hc包含147d、170c、173c、220g和399r，并且所述lc包含131k、160c、162c和214s。104.42.如条目40或41所述的抗hcd37抗体，105.(a)其中所述hc包含(1)相对于seqidno:65含有不超过四个、三个、两个、一个或零个改变的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:65的核苷酸序列编码的氨基酸序列，并且106.(b)其中所述lc包含(1)相对于seqidno:61含有不超过四个、三个、两个、一个或零个改变的氨基酸序列，和/或(2)由编码seqidno:61的核苷酸序列编码的氨基酸序列。107.43.如条目42所述的抗hcd37抗体，108.(a)其中所述hc包含(1)相对于seqidno:67或71含有不超过四个、三个、两个、一个或零个改变的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:67或71的核苷酸序列编码的氨基酸序列，并且109.(b)其中所述lc包含(1)相对于seqidno:63或69含有不超过四个、三个、两个、或一个改变的氨基酸序列，和/或(2)由编码seqidno:63或69的核苷酸序列编码的氨基酸序列。110.44.如条目28或34所述的抗hcd37抗体，其中所述hc包含34l和64q，并且所述lc包含53s和93e。111.45.如条目44所述的抗hcd37抗体，112.(a)其中所述vh包含(1)相对于seqidno:77含有不超过四个、三个、两个、一个或零个改变的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:77的核苷酸序列编码的氨基酸序列，并且113.(b)其中所述vl包含(1)相对于seqidno:73含有不超过四个、三个、两个、一个或零个改变的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:73的核苷酸序列编码的氨基酸序列。114.46.如条目45所述的抗hcd37抗体，115.(a)其中所述hc包含(1)相对于seqidno:79或83含有不超过四个、三个、两个、一个或零个改变的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:79或83的核苷酸序列编码的氨基酸序列，并且116.(b)其中所述lc包含(1)相对于seqidno:75或81含有不超过四个、三个、两个、一个或零个改变的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:75或81的核苷酸序列编码的氨基酸序列。117.47.一种抗体混合物，所述抗体混合物包含如条目1至27中任一项所述的抗hcd20抗体和如条目28至46中任一项所述的抗hcd37抗体。118.48.如条目47所述的混合物，其中所述混合物不包含除所述抗hcd20抗体和所述抗hcd37抗体之外的主要抗体种类。119.49.一种用于制备如条目1至27中任一项所述的抗hcd20抗体、如条目28至46中任一项所述的抗hcd37抗体或如条目47或48所述的抗体混合物的方法，所述方法包括以下步骤：120.将编码所述抗hcd20抗体、所述抗hcd37抗体或所述抗体混合物的一种或多种dna引入宿主细胞中；121.培养所述宿主细胞；并且122.从细胞团或从细胞培养上清液中回收所述抗体或抗体混合物。123.50.如条目49所述的方法，其中所述宿主细胞是cho细胞或小鼠骨髓瘤细胞。124.51.一种或多种多核苷酸，所述一种或多种多核苷酸编码如条目1至27中任一项所述的抗hcd20抗体、如条目28至46中任一项所述的抗hcd37抗体或如条目47或48所述的抗体混合物。125.52.一种或多种载体，所述一种或多种载体包含如条目51所述的一种或多种多核苷酸。126.53.如条目52所述的一种或多种载体，所述一种或多种载体是一种或多种病毒载体。127.54.如条目53所述的一种或多种载体，所述一种或多种载体是一种或多种溶瘤病毒载体。128.55.如条目54所述的一种或多种载体，所述一种或多种载体是一种或多种逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(aav)、痘苗病毒、改良痘苗病毒安卡拉(mva)、疱疹病毒、慢病毒、麻疹病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒、呼肠孤病毒和/或痘病毒载体。129.56.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如条目51所述的一种或多种多核苷酸或如条目52所述的一种或多种载体。130.57.如条目56所述的宿主细胞，其是哺乳动物细胞。131.58.如条目57所述的宿主细胞，其是cho细胞或小鼠骨髓瘤细胞。132.59.一种药物组合物，所述药物组合物包含如条目1至27中任一项所述的抗hcd20抗体、如条目28至46中任一项所述的抗hcd37抗体、如条目47或48所述的抗体混合物、如条目51所述的一种或多种多核苷酸或如条目52至55中任一项所述的一种或多种载体。133.60.一种人或人源化igg抗体，其中所述igg抗体的hc包含seqidno:24的氨基酸序列和/或由编码seqidno:24的核苷酸序列编码的氨基酸序列。134.61.如条目60所述的igg抗体，其中所述igg抗体的hc包含相对于seqidno:36的氨基酸序列含有不超过六个、五个、四个或三个改变的氨基酸序列。135.62.如条目61所述的igg抗体，其中所述igg抗体的hc包含相对于seqidno:36的氨基酸序列含有不超过三个改变的氨基酸序列。136.63.如条目62所述的igg抗体，其中所述igg抗体的hc包含相对于seqidno:36的氨基酸序列含有不超过两个改变的氨基酸序列。137.64.如条目63所述的igg抗体，其中所述igg抗体的hc包含相对于seqidno:36的氨基酸序列含有不超过一个改变的氨基酸序列。138.65.如条目64所述的igg抗体，其中所述igg抗体的hc包含seqidno:36的氨基酸序列和/或由编码seqidno:36的核苷酸序列编码的氨基酸序列。139.66.如条目60或61所述的igg抗体，其中所述igg抗体的hc包含seqidno:45的氨基酸序列和/或由编码seqidno:45的核苷酸序列编码的氨基酸序列。140.67.一种用于治疗患有癌症或b细胞介导的疾病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用如条目1至27中任一项所述的抗hcd20抗体、如条目28至46中任一项所述的抗hcd37抗体、如条目47或48所述的抗体混合物、如条目51所述的一种或多种多核苷酸或如条目52至55中任一项所述的一种或多种载体。141.68.如条目67所述的方法，其中所述患者患有癌症。142.69.如条目68所述的方法，其中所述癌症是b细胞非霍奇金淋巴瘤(b-nhl)或慢性淋巴细胞性白血病(cll)。143.70.如条目69所述的方法，其中所述癌症是b-nhl，并且其中所述b-nhl选自由以下组成的组：滤泡性淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤(malt淋巴瘤)、伯基特淋巴瘤、或套细胞淋巴瘤。144.71.如条目67所述的方法，其中所述患者患有b细胞介导的疾病。145.72.如条目71所述的方法，其中所述b细胞介导的疾病选自由以下组成的组：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和多发性硬化症。146.73.一种抗hcd20抗体，所述抗hcd20抗体包含含有vh的hc和含有vl的lc，147.其中所述vh包含相对于seqidno:12含有不超过12个、11个、十个、九个、八个、七个、六个或五个改变的氨基酸序列，148.其中所述vl包含相对于seqidno:8含有不超过七个、六个或五个改变的氨基酸序列，并且149.其中所述抗hcd20抗体可以在没有交联抗体的情况下进行的直接细胞杀伤测定中以不超过5、4、3、2或1.5nm的给出50％最大响应的浓度(ec50)直接杀伤wsu-dlcl2细胞，和/或所述抗hcd20抗体可以在没有交联抗体的情况下在测定中使用10μg/ml的抗hcd20抗体浓度进行的直接细胞杀伤测定中直接杀伤至少20％、30％或40％的wsu-dlcl2细胞。150.74.如条目73所述的抗hcd20抗体，其中所述抗hcd20抗体可以在没有交联抗体的情况下进行的直接细胞杀伤测定中以不超过1.0nm的ec50直接杀伤wsu-dlcl2细胞，和/或所述抗hcd20抗体可以在没有交联抗体的情况下在测定中使用10μg/ml浓度的所述抗hcd20抗体进行的直接细胞杀伤测定中直接杀伤至少30％的wsu-dlcl2细胞。151.75.如条目74所述的抗hcd20抗体，其中所述抗hcd20抗体可以在没有交联抗体的情况下进行的直接细胞杀伤测定中以不超过0.6nm的ec50直接杀伤wsu-dlcl2细胞，和/或所述抗hcd20抗体可以在没有交联抗体的情况下在测定中使用10μg/ml浓度的所述抗hcd20抗体进行的直接细胞杀伤测定中直接杀伤至少40％的wsu-dlcl2细胞。152.76.如条目75所述的抗hcd20抗体，其中所述抗hcd20抗体可以在没有交联抗体的情况下进行的直接细胞杀伤测定中以不超过0.45nm的ec50直接杀伤wsu-dlcl2细胞，和/或所述抗hcd20抗体可以在没有交联抗体的情况下在测定中使用10μg/ml浓度的所述抗hcd20抗体进行的直接细胞杀伤测定中直接杀伤至少40％的wsu-dlcl2细胞。153.77.如条目73至76中任一项所述的抗hcd20抗体，154.其中所述vh和所述vl各自包含cdr1、cdr2和cdr3，并且155.其中所述vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3(a)分别包含seqidno:1、2、3、4、5和6的氨基酸序列，和/或(b)包含由分别编码seqidno:1、2、3、4、5和6的核苷酸序列编码的氨基酸序列。156.78.如条目73至77中任一项所述的抗hcd20抗体，157.其中所述vh包含相对于seqidno:12含有不超过四个或三个改变的氨基酸序列，并且158.其中所述vl包含相对于seqidno:8含有不超过四个或三个改变的氨基酸序列。159.79.如条目78所述的抗hcd20抗体，160.其中所述vh包含相对于seqidno:12含有不超过两个或一个改变的氨基酸序列，并且161.其中所述vl包含相对于seqidno:8含有不超过两个或一个改变的氨基酸序列。162.80.如条目79所述的抗hcd20抗体，其中：163.(a)所述vh包含(1)seqidno:12的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:12的核苷酸序列编码的氨基酸序列；并且164.(b)所述vl包含(1)seqidno:8的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列。165.81.如条目73至80中任一项所述的抗hcd20抗体，其中所述抗hcd20抗体是人或人源化igg抗体。166.82.如条目81所述的抗hcd20抗体，其中所述hc包含(a)seqidno:24的氨基酸序列和/或(b)由编码seqidno:24的核苷酸序列编码的氨基酸序列。167.83.如条目82所述的抗hcd20抗体，其中所述hc包含相对于seqidno:18含有不超过七个或六个改变的氨基酸序列。168.84.如条目83所述的抗hcd20抗体，其中所述hc包含相对于seqidno:18含有不超过五个或四个改变的氨基酸序列。169.85.如条目84所述的抗hcd20抗体，其中所述hc包含相对于seqidno:18含有不超过三个改变的氨基酸序列。170.86.如条目85所述的抗hcd20抗体，其中所述hc包含相对于seqidno:18含有不超过两个改变的氨基酸序列。171.87.如条目86所述的抗hcd20抗体，其中所述hc包含相对于seqidno:18含有不超过一个改变的氨基酸序列。172.88.如条目73至76中任一项所述的抗hcd20抗体，其中所述hc包含(a)seqidno:18的氨基酸序列和/或(b)由编码seqidno:18的核苷酸序列编码的氨基酸序列。173.89.如条目82所述的抗hcd20抗体，其中所述hc包含(a)seqidno:36的氨基酸序列和/或(b)由编码seqidno:36的核苷酸序列编码的氨基酸序列。174.90.如条目82所述的抗hcd20抗体，其中所述hc包含(a)seqidno:45的氨基酸序列和/或(b)由编码seqidno:45的核苷酸序列编码的氨基酸序列。175.91.如条目73至82中任一项所述的抗hcd20抗体，其中：176.所述hc包含相对于seqidno:23含有不超过十二个、十一个、十个或九个改变的氨基酸序列；并且177.所述lc包含相对于seqidno:10含有不超过七个或六个改变的氨基酸序列。178.92.如条目91所述的抗hcd20抗体，其中：179.所述hc包含相对于seqidno:23含有不超过八个或七个改变的氨基酸序列；并且180.所述lc包含相对于seqidno:10含有不超过五个或四个改变的氨基酸序列。181.93.如条目92所述的抗hcd20抗体，其中：182.所述hc包含相对于seqidno:23含有不超过六个、五个或四个改变的氨基酸序列；并且183.所述lc包含相对于seqidno:10含有不超过三个或两个改变的氨基酸序列。184.94.如条目93所述的抗hcd20抗体，其中185.(a)所述hc包含(1)相对于seqidno:23含有不超过三个、两个、一个或零个改变的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:23的核苷酸序列编码的氨基酸序列；并且186.(b)所述lc包含(1)相对于seqidno:10含有不超过一个或零个改变的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:10的核苷酸序列编码的氨基酸序列。187.95.如条目81或82所述的抗hcd20抗体，188.其中所述抗hcd20抗体的所述hc包含239d和298a，并且189.其中所述hc包含相对于seqidno:35含有不超过七个或六个改变的氨基酸序列。190.96.如条目95所述的抗hcd20抗体，其中：191.所述hc包含相对于seqidno:35含有不超过五个或四个改变的氨基酸序列；并且192.所述lc包含相对于seqidno:10含有不超过五个或四个改变的氨基酸序列。193.97.如条目96所述的抗hcd20抗体，其中：194.所述hc包含相对于seqidno:35含有不超过三个改变的氨基酸序列；并且195.所述lc包含相对于seqidno:10含有不超过三个改变的氨基酸序列。196.98.如条目97所述的抗hcd20抗体，其中：197.所述hc包含相对于seqidno:35含有不超过两个改变的氨基酸序列；并且198.所述lc包含相对于seqidno:10含有不超过两个改变的氨基酸序列。199.99.如条目98所述的抗hcd20抗体，其中：200.所述hc包含相对于seqidno:35含有不超过一个改变的氨基酸序列；并且201.所述lc包含相对于seqidno:10含有不超过一个改变的氨基酸序列。202.100.如条目99所述的抗hcd20抗体，其中：203.(a)所述hc包含(1)seqidno:35的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:35的核苷酸序列编码的氨基酸序列；并且204.(b)所述lc包含(1)seqidno:10的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:10的核苷酸序列编码的氨基酸序列。205.101.如条目95所述的抗hcd20抗体，其中：206.(a)所述hc包含(1)seqidno:44的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:44的核苷酸序列编码的氨基酸序列；并且207.(b)所述lc包含(1)seqidno:10的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:10的核苷酸序列编码的氨基酸序列。208.102.如条目73至101中任一项所述的抗hcd20抗体，其中所述抗hcd20抗体可以在没有交联抗体的情况下进行的直接细胞杀伤测定中以不超过0.40nm的ec50直接杀伤wsu-dlcl2细胞。209.103.一种抗hcd37抗体，所述抗hcd37抗体包含含有vh的hc和含有vl的lc，210.其中所述vh包含相对于seqidno:57含有不超过八个、七个、六个或五个改变的氨基酸序列，211.其中所述vl包含相对于seqidno:53含有不超过八个、七个、六个、五个或四个改变的氨基酸序列，并且212.其中所述抗hcd37抗体可以在没有交联抗体的情况下进行的直接细胞杀伤测定中以不超过5、4或3nm的ec50直接杀伤ramos细胞，和/或所述抗hcd37抗体可以在没有交联抗体的情况下使用10μg/ml浓度的所述抗hcd37抗体进行的直接细胞杀伤测定中直接杀伤至少40％或50％的ramos细胞。213.104.如条目103所述的抗hcd37抗体，其中所述抗hcd37抗体可以在没有交联抗体的情况下进行的直接细胞杀伤测定中以不超过2nm的ec50直接杀伤ramos细胞，和/或所述抗hcd37抗体可以在没有交联抗体的情况下使用10μg/ml浓度的所述抗hcd37抗体进行的直接细胞杀伤测定中直接杀伤至少50％的ramos细胞。214.105.如条目104所述的抗hcd37抗体，其中所述抗hcd37抗体可以在没有交联抗体的情况下进行的直接细胞杀伤测定中以不超过1nm的ec50直接杀伤ramos细胞，和/或所述抗hcd37抗体可以在没有交联抗体的情况下使用10μg/ml浓度的所述抗hcd37抗体进行的直接细胞杀伤测定中直接杀伤至少60％的ramos细胞。215.106.如条目103至105中任一项所述的抗hcd37抗体，216.其中所述vh和所述vl各自包含cdr1、cdr2和cdr3，并且217.其中所述vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3(a)分别包含seqidno:46、47、48、49、50和51的氨基酸序列，和/或(b)包含由分别编码seqidno:46、47、48、49、50和51的核苷酸序列编码的氨基酸序列。218.107.如条目103至106中任一项所述的抗hcd37抗体，219.其中所述vh包含相对于seqidno:57含有不超过四个改变的氨基酸序列，并且220.其中所述vl包含相对于seqidno:53含有不超过三个改变的氨基酸序列。221.108.如条目107所述的抗hcd37抗体，222.其中所述vh包含相对于seqidno:57含有不超过三个改变的氨基酸序列，并且223.其中所述vl包含相对于seqidno:53含有不超过两个改变的氨基酸序列。224.109.如条目108所述的抗hcd37抗体，225.其中所述vh包含相对于seqidno:57含有不超过两个改变的氨基酸序列，并且226.其中所述vl包含相对于seqidno:53含有不超过一个改变的氨基酸序列。227.110.如条目109所述的抗hcd37抗体，其中：228.(a)所述vh包含(1)相对于seqidno:57含有不超过一个或零个改变的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:57的核苷酸序列编码的氨基酸序列；并且229.(b)所述vl包含(1)seqidno:53的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:53的核苷酸序列编码的氨基酸序列。230.111.如条目103至110中任一项所述的抗hcd37抗体，231.其中所述hc包含相对于seqidno:59含有不超过十个、九个或八个改变的氨基酸序列，并且232.其中所述lc包含相对于seqidno:55含有不超过八个或七个改变的氨基酸序列。233.112.如条目111所述的抗hcd37抗体，234.其中所述hc包含相对于seqidno:59含有不超过七个或六个改变的氨基酸序列，并且235.其中所述lc包含相对于seqidno:55含有不超过五个改变的氨基酸序列。236.113.如条目112所述的抗hcd37抗体，237.其中所述hc包含相对于seqidno:59含有不超过五个或四个改变的氨基酸序列，并且238.其中所述lc包含相对于seqidno:55含有不超过四个或三个改变的氨基酸序列。239.114.如条目113所述的抗hcd37抗体，240.其中所述hc包含相对于seqidno:59含有不超过三个或两个改变的氨基酸序列，并且241.其中所述lc包含相对于seqidno:55含有不超过两个改变的氨基酸序列。242.115.如条目114所述的抗hcd37抗体，243.其中所述hc包含相对于seqidno:59含有不超过一个改变的氨基酸序列，并且244.其中所述lc包含相对于seqidno:55含有不超过一个改变的氨基酸序列。245.116.如条目115所述的抗hcd37抗体，246.(a)其中所述hc包含(1)seqidno:59的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:59的核苷酸序列编码的氨基酸序列，并且247.(b)其中所述lc包含(1)seqidno:55的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:55的核苷酸序列编码的氨基酸序列。248.117.如条目103或111所述的抗hcd37抗体，其中所述hc包含34v，并且所述lc包含31n。249.118.如条目103、111或117所述的抗hcd37抗体，其中所述hc包含147d、170c、173c、220g和409r，并且所述lc包含131k、160c、162c和214s。250.119.如条目117或118所述的抗hcd37抗体，251.(a)其中所述hc包含(1)相对于seqidno:65含有不超过四个、三个、两个、一个或零个改变的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:65的核苷酸序列编码的氨基酸序列，并且252.(b)其中所述lc包含(1)相对于seqidno:61含有不超过四个、三个、两个、一个或零个改变的氨基酸序列，和/或(2)由编码seqidno:61的核苷酸序列编码的氨基酸序列。253.120.如条目119所述的抗hcd37抗体，254.(a)其中所述hc包含(1)相对于seqidno:67或71含有不超过四个、三个、两个、一个或零个改变的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:67或71的核苷酸序列编码的氨基酸序列，并且255.(b)其中所述lc包含(1)相对于seqidno:63或69含有不超过四个、三个、两个、或一个改变的氨基酸序列，和/或(2)由编码seqidno:63或69的核苷酸序列编码的氨基酸序列。256.121.如条目103或111所述的抗hcd37抗体，其中所述hc包含34l和64q，并且所述lc包含53s和93e。257.122.如条目121所述的抗hcd37抗体，258.(a)其中所述vh包含(1)相对于seqidno:77含有不超过四个、三个、两个、一个或零个改变的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:77的核苷酸序列编码的氨基酸序列，并且259.(b)其中所述vl包含(1)相对于seqidno:73含有不超过四个、三个、两个、一个或零个改变的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:73的核苷酸序列编码的氨基酸序列。260.123.如条目122所述的抗hcd37抗体，261.(a)其中所述hc包含(1)相对于seqidno:79或83含有不超过四个、三个、两个、一个或零个改变的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:79或83的核苷酸序列编码的氨基酸序列，并且262.(b)其中所述lc包含(1)相对于seqidno:75或81含有不超过四个、三个、两个、一个或零个改变的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:75或81的核苷酸序列编码的氨基酸序列。263.124.一种抗体混合物，所述抗体混合物包含如条目73至102中任一项所述的抗hcd20抗体和如条目103至123中任一项所述的抗hcd37抗体。264.125.如条目124所述的混合物，其中所述混合物不包含除所述抗hcd20抗体和所述抗hcd37抗体之外的主要抗体种类。265.126.如条目124或125所述的混合物，266.其中所述抗hcd20抗体是如条目100或101中任一项所述的抗cd20抗体，并且267.其中所述抗hcd37抗体是如条目120或123所述的抗cd37抗体。268.127.一种用于制备如条目73至102中任一项所述的抗hcd20抗体、如条目103至123中任一项所述的抗hcd37抗体或如条目124至126中任一项所述的抗体混合物的方法，所述方法包括以下步骤：269.培养包含编码所述抗hcd20抗体、所述抗hcd37抗体或所述抗体混合物的一种或多种dna的宿主细胞；并且270.从细胞团或从细胞培养上清液中回收所述抗hcd20抗体、所述抗hcd37抗体或所述抗体混合物。271.128.如条目127所述的方法，其中所述宿主细胞是cho细胞或小鼠骨髓瘤细胞。272.129.一种或多种多核苷酸，所述一种或多种多核苷酸编码如条目73至102中任一项所述的抗hcd20抗体、如条目103至123中任一项所述的抗hcd37抗体或如条目124至126中任一项所述的抗体混合物。273.130.一种或多种载体，所述一种或多种载体包含如条目129所述的一种或多种多核苷酸。274.131.如条目130所述的一种或多种载体，所述一种或多种载体是一种或多种病毒载体。275.132.如条目131所述的一种或多种载体，所述一种或多种载体是一种或多种溶瘤病毒载体。276.133.如条目132所述的一种或多种载体，所述一种或多种载体是一种或多种逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(aav)、痘苗病毒、改良痘苗病毒安卡拉(mva)、疱疹病毒、慢病毒、麻疹病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒、呼肠孤病毒和/或痘病毒载体。277.134.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如条目129所述的一种或多种多核苷酸或如条目130所述的一种或多种载体。278.135.如条目134所述的宿主细胞，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。279.136.如条目135所述的宿主细胞，所述宿主细胞是cho细胞或小鼠骨髓瘤细胞。280.137.一种药物组合物，所述药物组合物包含如条目73至102中任一项所述的抗hcd20抗体、如条目103至123中任一项所述的抗hcd37抗体、如条目124至126中任一项所述的抗体混合物、如条目129所述的一种或多种多核苷酸或如条目130至133中任一项所述的一种或多种载体。281.138.一种人或人源化igg抗体，其中所述igg抗体的hc包含seqidno:24的氨基酸序列和/或由编码seqidno:24的核苷酸序列编码的氨基酸序列。282.139.如条目138所述的igg抗体，其中所述igg抗体的hc包含相对于seqidno:36的氨基酸序列含有不超过六个、五个、四个或三个改变的氨基酸序列。283.140.如条目139所述的igg抗体，其中所述igg抗体的hc包含相对于seqidno:36的氨基酸序列含有不超过三个改变的氨基酸序列。284.141.如条目140所述的igg抗体，其中所述igg抗体的hc包含相对于seqidno:36的氨基酸序列含有不超过两个改变的氨基酸序列。285.142.如条目141所述的igg抗体，其中所述igg抗体的hc包含相对于seqidno:36的氨基酸序列含有不超过一个改变的氨基酸序列。286.143.如条目142所述的igg抗体，其中所述igg抗体的hc包含seqidno:36的氨基酸序列和/或由编码seqidno:36的核苷酸序列编码的氨基酸序列。287.144.如条目138或139所述的igg抗体，其中所述igg抗体的hc包含seqidno:45的氨基酸序列和/或由编码seqidno:45的核苷酸序列编码的氨基酸序列。288.145.一种用于治疗患有癌症或b细胞介导的疾病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用如条目73至102中任一项所述的抗hcd20抗体、如条目103至123中任一项所述的抗hcd37抗体、如条目124至126中任一项所述的抗体混合物、如条目129所述的一种或多种多核苷酸或如条目130至133中任一项所述的一种或多种载体。289.146.如条目145所述的方法，其中所述患者患有癌症。290.147.如条目146所述的方法，其中所述患者在施用所述抗hcd20抗体、所述抗hcd37抗体、所述抗体混合物、所述多核苷酸或所述载体之前、之后或同时用放射线或化学治疗剂进行治疗。291.148.如条目146或147所述的方法，其中所述癌症是b细胞非霍奇金淋巴瘤(b-nhl)或慢性淋巴细胞性白血病(cll)。292.149.如条目148所述的方法，其中所述癌症是b-nhl，并且其中所述b-nhl选自由以下组成的组：滤泡性淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤(malt淋巴瘤)、伯基特淋巴瘤、或套细胞淋巴瘤。293.150.如条目145所述的方法，其中所述患者患有b细胞介导的疾病。294.151.如条目150所述的方法，其中所述b细胞介导的疾病选自由以下组成的组：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和多发性硬化症。295.附图简述296.图1：抗cd20抗体可变结构域的氨基酸序列比对。小图a，托西莫单抗(一种嵌合抗hcd20抗体；顶行)、抗hcd20ab1(标记为“acd20ab1”，本文所述的人源化抗hcd20抗体；第二行)、具有托西莫单抗的cdr和下文列出的人类种系的框架区的cdr接枝的抗cd20抗体(标记为“cdr接枝物”，第三行)和包含由ighv1-46*01和ighd1-1*01和ighj3*01编码的氨基酸序列的组装的人种系(标记为“种系”，底行)的的vh的氨基酸序列比对。小图b，托西莫单抗(顶行)、抗hcd20ab1(第二行)、具有托西莫单抗的cdr和下文列出的人类种系的框架区的cdr接枝的抗cd20抗体(第三行)和包含由igkv6-21*02和igkj2*01编码的氨基酸序列的组装的人种系(底行)的vl的氨基酸序列比对。抗体如小图a中所标识。在两个小图中编号都是根据kabat等人进行的。kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版,u.s.departmentofhealthandhumanservices,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,nih出版号91-3242,1991。标有“#”的位置是未分配额外编号的位置，因为所述位置在所有可变区中没有被氨基酸填充。例如，在vh中的位置82之后是三个在它们上面有“#”的氨基酸。这些在本文中被称为82a、82b和82c。其他添加的氨基酸也以类似的方式编号。cdr被标记并且在两个小图中均以粗体字型指示。除了重链(hc)cdr1之外所示的符合kabat等人，同上中的定义的cdr除了包括氨基酸31-35之外还包括氨基酸26-30(如kabat等人，同上所定义)。在两个小图的第二行中，以粗体字型、加下划线所示的残基是从cdr接枝序列中存在的位置改变为托西莫单抗鼠序列中存在的位置的、在抗hcd20ab1vh或vl序列中的位置，如实施例1中所解释。在小图a中在acd20ab1vh的位置16处的斜体粗体字的丝氨酸残基被引入以减少预测的空间位阻。在小图a中在acd20ab1vh的cdr2中的加下划线的斜体粗体字的谷氨酰胺残基(q)被引入以减少此残基的预测突出。在两个小图中，比对序列下面的符号行表示如下：星号(*)表示残基在所有序列中都是相同的；点(.)或冒号(:)表示序列在此位置处保守变化，冒号表示比点更多相似性；并且没有符号(或空格)表示在此位置的氨基酸以非保守方式不同。在实施例1中描述了人源化过程的细节。297.图2：小图a。抗hcd20ab1与raji肿瘤细胞的结合。如实施例2所述，将细胞与测试或对照抗体混合，并且通过荧光激活细胞分选(facs)分析来检测与细胞的结合。x轴显示几何平均荧光强度(geomfi，其是结合强度的量度)，并且y轴显示细胞计数，其指示在给定的geomfi下结合细胞的数量。由实线勾勒出并填充有深灰色的最左侧的峰代表人igg1同种型对照(其是阴性对照)与细胞的结合。由实线勾勒出并填充有深灰色的最右侧的峰代表利妥昔单抗(一种igg1抗hcd20抗体；阳性对照)与细胞的结合。由虚线勾勒出的峰代表奥比妥珠单抗(obinutuzumab)(igg1抗hcd20抗体；阳性对照)的结合。填充有浅灰色的峰代表抗hcd20ab1(本文所述的人源化igg1抗hcd20抗体)与细胞的结合。小图b。通过抗cd20抗体直接杀伤raji细胞。在实施例2中描述了方法。x轴标识了如下所测试的抗体：1、利妥昔单抗；2、奥比妥珠单抗；3、抗hcd20ab1；和4、人igg1抗体(预期不会杀伤细胞的阴性对照抗体)。每组两个条中填充有竖直线的最左侧的条代表来自96孔微量滴定板的数据，并且每组两个条中填充有水平线的最右侧的条代表来自48孔微量滴定板的数据。y轴指示检测到的母细胞数量(母细胞#)，其表明细胞杀伤的程度(较低的数字表明更多的细胞杀伤)。此测定是在不存在交联抗体的情况下进行的。298.图3：抗hcd20ab1的变体与各种人类肿瘤细胞系的结合。小图a、b、c和d分别显示了来自wsu-dlcl2肿瘤细胞、raji细胞、ramos细胞和ramos细胞的数据。x轴指示如下所测试的抗体(在10微克/毫升(μg/ml))：t1，抗hcd20ab1-t1；t2，抗hcd20ab1-t2；t3，抗hcd20ab1-t3；t4，抗hcd20ab1-t4；t5，抗hcd20ab1-t5；t6，抗hcd20ab1-t6；t7，抗hcd20ab1-t7；t8，抗hcd20ab1-t8；ts(包含托西莫单抗的可变结构域的嵌合抗cd20，其在下文更详细地定义)；ob，奥比妥珠单抗；g1，人igg1(阴性对照)；-，无抗体；和rx，利妥昔单抗。提供d小图来比较本测定中各种基准抗体的活性。在实施例1和3中描述了方法。geomfi(结合强度的指示)显示在y轴上。在小图a-c中，填充棋盘图案的条没有特殊意义。在小图d中，每组两个条代表来自含有1μg/ml抗体的样品的数据(填充有竖直线的最左侧的条)或含有10μg/ml抗体的样品的数据(填充有水平线的最右侧的条)。299.图4：在存在或不存在交联抗体的情况下通过抗hcd20ab1的变体直接杀伤肿瘤细胞系。在实施例2和3中描述了方法。在所有小图中，每组两个条代表来自与多克隆山羊抗人fc抗体交联(即，“交联抗体”)(填充有棋盘图案的最左侧的条)或不交联(填充有水平线的最右侧的条)的样品的数据。针对小图a-c在小图c的x轴上标识了如下在每个样品中使用的抗体：t1，抗hcd20ab1-t1；t2，抗hcd20ab1-t2；t3，抗hcd20ab1-t3；t4，抗hcd20ab1-t4；t5，抗hcd20ab1-t5；t6，抗hcd20ab1-t6；t7，抗hcd20ab1-t7；t8，抗hcd20ab1-t8；ts；ob，奥比妥珠单抗；g1，人igg1(阴性对照)；和-，没有抗体。y轴指示母细胞数量(母细胞#)，其指示细胞杀伤，较低的数字表明更多的细胞杀伤。在小图a、b和c中，所使用的细胞分别是wsu-dlcl2肿瘤细胞、raji细胞和ramos细胞。300.图5：具有改变的恒定结构域的抗hcd20ab1变体的结合和直接细胞杀伤。小图a显示了与wsu-dlcl2细胞结合的数据，并且小图b显示了在不存在交联抗体的情况下进行的直接wsu-dlcl2细胞杀伤测定的结果。在实施例2和4中描述了方法。在两个小图中，沿着x轴指示如下在样品中使用的抗体：ts；t7，抗hcd20ab-t7；1.1，抗hcd20ab1.1；1.2，抗hcd20ab1.2；1.3，抗hcd20ab1.3；1.4，抗hcd20ab1.4；和-，没有抗体。y轴显示了小图a中的geomfi和小图b中的母细胞数量(母细胞#)。301.图6：在增加的浓度下在没有抗hcd20ab1变体与改变的恒定结构域的交联抗体的情况下的直接细胞杀伤活性。x轴上指示抗体浓度(nm)，并且y轴上显示母细胞数量(母细胞#)。样品中抗体的身份如图5所指示，除了g1指示用作阴性对照的人igg1抗体。小图a和b分别显示了来自wsu-dlcl2细胞和ramos细胞的数据。在实施例2和4中描述了方法和实验。302.图7：抗hcd20ab1.2变体的效应子功能。小图a显示了使用wsu-dlcl2作为靶细胞和使用nk细胞作为效应细胞的抗体依赖性细胞的细胞毒性(adcc)的测定结果。在x轴上指示抗体浓度(nm)，并且在y轴上指示特异性细胞毒性百分比(特异性细胞毒性％)。抗体名称在小图a的图例中缩写如下：rx，利妥昔单抗；1.2，抗hcd20ab1.2；1.2.1，抗hcd20ab1.2.1；1.2.2，抗hcd20ab1.2.2；1.2.3，抗hcd20ab1.2.3；1.2.4，抗hcd20ab1.2.4；和g1，用作阴性同种型对照的人igg1。仅在最高浓度(10nm)下测试同种型对照。小图b显示了使用wsu-dlcl2细胞作为靶细胞和通过兔血清提供的补体进行的补体依赖性细胞毒性(cdc)测定的结果。沿x轴指示了抗体浓度(nm)，并且y轴显示死亡细胞的百分比(死亡细胞％)，其指示细胞毒性。抗体名称如小图a中缩写，除了含有热灭活兔补体而无抗体的样品由hi指示(仅在30nm处测试)，并且奥比妥珠单抗缩写为ob。在实施例5中描述了实验。303.图8：抗cd37抗体可变结构域序列的比对。小图a，以下各项的的vh的氨基酸序列比对：g28.1(标记为“g28.1”，一种鼠抗hcd37抗体；顶行)、抗hcd37ab1(标记为“acd37ab1”，本文所述的人源化抗hcd37抗体；第二行)、具有g28.1的cdr和下文列出的人类种系的框架区的cdr接枝的抗cd37抗体(标记为“cdr接枝的”，第三行)、和包含由ighv1-3*01和ighd1-26*01和ighj4*01编码的氨基酸序列的组装的人种系(标记为“种系”，底行)。小图b，g28.1(顶行)、抗hcd37ab1(第二行)、具有g28.1的cdr和下文列出的人类种系的框架区的cdr接枝的抗cd37抗体(第三行)和包含由igkv1-27*01和igkj4*01编码的氨基酸序列的组装的人种系(底行)的的vl的氨基酸序列比对。抗体如小图a中所标识。在两个小图中编号都是根据kabat等人进行的。kabat等人，同上。“#”如图1中所表示。粗体字型指示cdr的位置。加下划线的粗体字型表示抗cd37ab1的氨基酸序列与cdr接枝的抗cd37抗体的氨基酸序列不同并且与g28.1的氨基酸序列相同的位置。斜体的粗体字型指示预期最小化空间位阻的取代被引入抗cd37ab1的位置。加下划线的斜体粗体字型指示为了使抗体表面更光滑而引入的取代被引入抗cd37ab1中的位置。在两个小图中，比对序列下面的符号行如图1的简述中所解释的表示。在实施例6中描述了人源化过程的细节。304.图9：抗cd37抗体与肿瘤细胞系的结合。在实施例2和7中描述了方法。小图c的x轴标识了如下在所有小图中所测试的抗体：ob，奥比妥珠单抗，一种人源化抗hcd20抗体；g28.1，嵌合抗hcd37抗体；h37，源自g28.1的人源化抗hcd37抗体；ab1，如本文实施例6所述的人源化抗hcd37ab1；和g1，用作同种型对照的人igg1抗体。y轴显示了geomfi，如图所指示。小图a、b和c分别显示来自wsu-dlcl2细胞、raji细胞和ramos细胞的数据。305.图10：通过抗hcd37ab1变体的直接细胞杀伤。在实施例2和7中描述了方法。如在图9的描述中所解释，在小图b的x轴下方指示了在两个小图中测试的抗体的身份。如图所指示，y轴显示母细胞数量(母细胞#)，其指示细胞杀伤(较低的数字表明更多的细胞杀伤)。在所有小图中，每组两个条代表来自与多克隆山羊抗人fc抗体交联(即，“交联抗体”)(填充有竖直线的最左侧的条)或不交联(填充有水平线的最右侧的条)的样品的数据。小图a和b分别显示来自wsu-dlcl2细胞和raji细胞的数据。306.图11：抗hcd20和抗hcd37抗体在ramos细胞中的直接细胞杀伤。在实施例2和7中描述了方法。两个小图中显示的结果均来自ramos细胞。除了没有添加抗体的样品通过虚线(-)标识之外，如图9的描述中所解释标识所使用的抗体。如图10的描述中所解释标识具有和不具有交联抗体的样品。小图a显示了在添加抗体后24小时的结果。小图b显示了在添加抗体后72小时的结果。307.图12：通过facs分析测试抗hcd37ab1igg1突变体的变体与食蟹猴cd37(cynocd37)的结合。实施例8中描述了方法，其还描述了抗hcd37ab1的变体。简而言之，将食蟹猴外周血单核细胞(pbmc)与(1)apc缀合的鼠抗hcd20抗体(其也可以与食蟹猴cd20结合)、(2)抗hcd37ab1或其变体和(3)异硫氰酸荧光素缀合的(fitc缀合的)鼠抗人iggfc特异性抗体混合。处理后，通过facs分析这些细胞。如加框区域所指示，将cd20+细胞门控出，并且评估抗cd37抗体与所述细胞亚群的结合。x轴显示fitc荧光强度，较高的数字表明抗cd37抗体与细胞的结合较强。y轴显示apc荧光强度，较高的数字表明抗cd20抗体与细胞的结合较强。如所指示，小图中分析的抗体如下：小图a，抗hcd37ab1；小图b，抗hcd37ab1.a1；小图c，抗hcd37ab1.d11；小图d，抗hcd37ab1.h7；小图e，抗hcd37ab1.n12；和小图f，抗hcd37ab1.n19。308.图13：抗hcd37ab1.a1与人和食蟹猴cd19+细胞的结合。在实施例8中描述了方法。简而言之，将抗hcd37ab1.a1的apc缀合的形式或igg1同种型对照抗体以不同的浓度与人或食蟹猴pbmc和fitc缀合的抗cd19抗体混合。处理后，对cd19+细胞的门控群体进行facs分析，以确定抗hcd37ab1.a1或同种型对照与这些细胞的结合强度。x轴指示抗hcd37ab1.a1或同种型对照igg1抗体的浓度。y轴指示由于cd19+细胞(即，b细胞)之间的apc荧光引起的几何mfi。符号表示如下：由实线连接的填充圆，抗hcd37ab1.a1加食蟹猴pbmc；由实线连接的填充正方形，同种型对照igg1抗体加食蟹猴pbmc；由实线连接的填充的向上指向三角形，抗hcd37ab1.a1加人pbmc；由实线连接的填充的向下指向三角形，同种型对照igg1抗体加人pbmc。309.图14：抗hcd37ab1变体的直接细胞杀伤活性。在每个小图的图例中列出了所使用的抗体，并且在实施例8中描述了这些抗体。在没有交联抗体的情况下进行测定。如图所指示，x轴显示抗体浓度(nm)，并且y轴显示母细胞数量。小图a显示使用wsu-dlcl2细胞的数据，并且小图b显示使用ramos细胞的数据。310.图15：抗hcd20ab1.2.2与人和食蟹猴b细胞的结合。在实施例9中描述了方法。简而言之，将apc缀合的抗hcd20ab1.2.2或同种型对照抗体与人或食蟹猴pbmc以及fitc缀合的抗cd19抗体混合，并且通过facs分析以检测在cd19+细胞(即，b细胞)的门控群体中的apc荧光(由于抗hcd20ab1.2.2或同种型对照的结合)。使用50μg/ml(小图a)或10μg/ml(小图b)的抗hcd20ab1.2.2或同种型对照抗体。在两个小图中x轴均显示apc荧光(标记的apc-a)的geomfi。y轴显示细胞计数。两个小图中的虚线代表来自与抗hcd20ab1.2.2混合的人cd19+细胞的数据。两个小图中的实线代表来自与抗hcd20ab1.2.2混合的食蟹猴cd19+细胞的数据。在两个小图中用虚线定义并填充有灰色的峰代表来自与同种型对照抗体混合的人cd19+细胞的数据。311.图16：抗hcd20ab1.2.2和抗hcd37ab1.a1的表征。在实施例10中描述了实验。小图a显示抗hcd20ab1.2.2igg、奥比妥珠单抗(一种igg1抗hcd20抗体)、利妥昔单抗(一种igg1抗hcd20抗体)和针igg1同种型对照抗体(标记的huigg1)与raji细胞的结合。x轴显示抗体浓度(nm)，并且y轴显示结合能力(geomfi)。小图b显示了在存在抗hcd20ab1.2.2、抗hcd37ab1.a1或igg1同种型对照抗体(标记的huigg1)的情况下评估nk细胞对raji细胞的杀伤的adcc测定结果。在x轴上显示抗体浓度(nm)，并且在y轴上显示特异性细胞毒性百分比。在实施例10中描述了实验。312.图17：评估抗hcd20ab1.2.2和抗hcd37ab1.a1的hc和lc之间的非同源lc/hc配对程度的瞬时转染expi293tm细胞上清液的蛋白质印迹。在实施例11中描述了实验。左侧印迹和右侧印迹包含平行运行的重复样品(1是1'的副本，等等)。泳道1和1'中的转染细胞上清液来自含有编码抗hcd20ab1.2.2的lc和hc(lc1和hc1)的质粒dna的细胞。泳道4和4'中的转染细胞上清液来自含有编码抗hcd37ab1.a1的lc和hc(lc2和hc2)的质粒dna的细胞。泳道2和2'中的转染细胞上清液来自含有编码hc1和lc2的质粒dna的细胞。泳道3和3'中的转染细胞上清液来自含有编码lc1和hc2的质粒dna的细胞。泳道5和5'中的转染细胞上清液来自含有编码抗her2抗体曲妥珠单抗的lc和hc的质粒dna的细胞。hc和lc或曲妥珠单抗的氨基酸序列可以分别在seqidno:89和87中找到。313.图18：抗hcd20ab1.2.2.1、抗hcd37ab1.a1.1、抗hcd37ab1.n12.1及它们的混合物的非还原和还原样品的sds-page分析。在实施例12中描述了该实验。非还原(小图a和c)和还原(小图b和d)样品在4-15％criteriontmtgxstain-freetmprecastsds-page凝胶中运行，并且如实施例12中所述可视化抗体。蛋白质分子量标准在最左侧泳道中运行，并且指示了以千道尔顿(kda)为单位的大小。在小图a和b中，泳道包含以下样品：泳道1和1'，曲妥珠单抗(一种igg1抗her2抗体)；泳道2和2'，抗hcd20ab1.2.2.1；泳道3和3'，抗hcd37ab1.a1.1；和泳道4和4'，抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1的mabpair(即，在单个宿主细胞中产生的一对抗体)。在小图c和d中，泳道包含以下样品：泳道5和5'，曲妥珠单抗；泳道6和6'，抗hcd20ab1.2.2.1；泳道7和7'，抗hcd37ab1.n12.1；和泳道8和8'，抗hcd20ab1.2.2.1igg和抗hcd37ab1.n12.1igg1的mabpair。314.图19：通过低ph阳离子交换色谱(cex)分析非还原抗hcd20和抗hcd37mabpair混合物。小图显示了如实施例12中所述在低ph下运行的cex柱的示踪。横轴显示从柱洗脱开始以来的时间(分钟)，并且纵轴显示在柱流出中检测到的214nm处的吸光度(表示为“au”，其反映了蛋白质浓度)。小图a显示了来自由抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1组成的mabpair的示踪，并且小图b显示了来自由抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.n12.1组成的mabpair的示踪。两个mabpair都是在用编码这些抗体的dna转染的expichotm宿主细胞中生产的。小图a表明所分析的mabpair混合物中43％的抗体是抗hcd20ab1.2.2.1并且57％的抗体是抗hcd37ab1.a1.1。小图b表明mabpair混合物中49％的抗体是抗hcd20ab1.2.2.1并且51％的抗体是抗hcd37ab1.n12.1。315.图20：完整mabpair抗体混合物的质谱(ms)分析。在实施例12中描述了程序。x轴显示去卷积的质量，并且y轴显示计数，它们反映了给定质量的蛋白质的丰度。小图a显示了来自主要由抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1组成的mabpair的数据。小图b显示了来自主要由抗hcd20ab1.2.2.1igg和抗hcd37ab1.n12.1igg1组成的mabpair的数据。在每个峰的上方指示了每个单独抗体的抗体名称和检测到的质量，并且质量误差(与理论质量的差异，以百万份中的份数(ppm)表示)显示在每个峰的侧边。小图a中145,075.35da处的小峰是o-糖基化抗hcd37ab1.a1.1(由总蛋白质的2.1％组成)，并且小图b中145,058.90da处的中间小峰是o-糖基化抗hcd37ab1.n12.1(由总蛋白质的1.8％组成)。316.图21：抗hcd37ab1.n12.1中的o-糖基化的分析。小图a显示了来自反相hplc柱的uv示踪，表明了由脱糖基化(用png酶f)和抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.n12.1mabpair混合物的还原产生的物质，如实施例12中所解释。x轴显示采集时间(分钟)，并且y轴显示响应，它们反映了给定时间下的蛋白质的量。用箭头指示的区域高于基线，表明可能存在一些另外的次要蛋白质物质。因此，进一步通过ms分析了这一区域。小图b示出了这种ms分析，其中x轴指示去卷积质量，y轴指示计数，它们反映了蛋白质的量。y轴按比例缩放以显示该样品中以相对小的量存在的物质。如实施例12中所解释，检测到的物质的大小表明这些是hc抗hcd37ab1.n12.1的o-糖基化物质。小图c显示小图a中所示的抗hcd37抗体的hc主峰的ms分析。317.图22：由抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1组成的脱糖基化和还原的mabpair样品的ms分析。在实施例12中描述了这些实验。小图a显示了抗hcd20ab1.2.2.1的lc的分析。小图b显示了抗hcd37ab1.a1.1的lc的分析。小图c显示了抗hcd20ab1.2.2.1的hc的分析。小图d显示了抗hcd37ab1.a1.1的hc的分析。x轴显示去卷积的质量，并且y轴显示计数，它们反映了给定质量下的蛋白质的量。每个峰都标记有其测量的去卷积质量。在每个峰旁边指示了所分析的分子的预期质量。318.图23：由抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.n12.1组成的脱糖基化和还原的mabpair样品的ms分析。在实施例12中描述了这些实验。小图a显示了抗hcd20ab1.2.2.1的lc的分析。小图b显示了抗hcd37ab1.n12.1的lc的分析。小图c显示了抗hcd20ab1.2.2.1的hc的分析。小图d显示了抗hcd37ab1.n12.1的hc的分析。x轴显示去卷积的质量，并且y轴显示计数，它们反映了给定质量下的蛋白质的量。319.图24：从抗hcd20/抗hcd37mabpair抗体混合物产生的fab'片段的ms分析。在实施例12中描述了实验。小图a显示了由ides蛋白酶消化和2-mea/edta处理产生的源自抗hcd20ab1.2.2.1/抗hcd37ab1.a1.1mabpair的fab'片段的ms分析。小图b显示了由ides蛋白酶消化和2-mea/edta处理产生的源自抗hcd20ab1.2.2.1/抗hcd37ab1.n12.1mabpair的fab'片段的ms分析。如两个小图所指示，x轴显示去卷积的质量，并且y轴显示计数，它们反映了给定质量下的蛋白质的量。在每个峰的顶部指示了确定的峰质量，并且在峰旁边指示了包含同源hc/lc对的两个fab'片段的预期质量。320.图25：在不存在交联抗体的情况下通过抗hcd20/抗hcd37mabpair混合物对wsu-dlcl2细胞(小图a)和ramos细胞(小图b)的直接杀伤。在实施例14中描述了测定。在两个小图中，x轴指示抗体浓度(nm)，并且y轴指示母细胞数量(母细胞#)。在两个小图中，符号表示如下在样品中使用的抗体：由实线连接的向上指向的填充三角形，抗hcd20ab1.2.2.1；由实线连接的填充圆，抗hcd37ab1.a1.1；由虚线连接的空心圆，包含cd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1的mabpair混合物；由实线连接的向下指向的填充三角形，抗hcd37ab1.n12.1；由虚线连接的向下指向的空心三角形，包含cd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.n12.1的mabpair混合物；和填充的正方形(仅小图a中的单个样品，并在小图b中由实线连接)，人igg1/κ同种型对照抗体。321.图26：抗cd20和抗cd37抗体及它们的混合物的b细胞耗竭活性。在实施例15中描述了这些实验。小图a、b和c中所示的数据来自使用来自分别被称为供体1198、1056和2004的三名不同人类供体的pbmc的实验。如图所指示，x轴显示抗体浓度(nm)，并且y轴显示b细胞耗竭百分比。所使用的抗体如下所指示：由虚线连接的半填充的向上指向三角形，奥比妥珠单抗(一种抗hcd20igg1抗体)；由点和破折号交替的线连接的半填充菱形，利妥昔单抗(一种抗hcd20igg1抗体)；由实线连接的向上指向的填充三角形，抗hcd20ab1.2.2.1；由实线连接的向下指向的填充三角形，抗hcd37ab1.a1.1；和由实线连接的填充圆，主要由抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1组成的mabpair混合物。322.图27：在ramos异种移植的小鼠模型中通过抗hcd20抗体、抗hcd37抗体和抗hcd20/抗hcd37mabpair的抗体混合物的肿瘤生长抑制的体内测试。在实施例16中描述了实验。如图所指示，y轴指示单个动物的肿瘤体积，单位为立方毫米(mm3)，并且x轴指示肿瘤开始后的天数。在每个小图的图例中指示了用于治疗小鼠的抗体的身份。“huigg1”指示同种型阴性对照抗体。323.序列列表的简要说明324.325.326.[0327][0328]详述[0329]目前用抗cd20抗体治疗的各种癌症在癌细胞表面上表达cd20。payandeh等人,theapplicationsofanti-cd20antibodiestotreatvariousbcellsdisorders,2019,biomedpharmacother.109:2415-2426。一些此类癌症也在其细胞表面上表达cd37。尽管一些抗cd20抗体作为某些癌症的治疗具有一定功效，并且已被批准在美国销售，但许多用抗cd20抗体治疗的患者会产生耐药性，这会降低功效。small等人建议多种机制，包括下调癌细胞上的cd20水平、降低由宿主免疫细胞介导的补体依赖性细胞溶解(cdc)和抗体依赖性细胞溶解(adcc)的水平、以及降低对凋亡的敏感性。small等人,analysisofinnateandacquiredresistancetoanti-cd20antibodiesinmalignantandnonmalignantbcells,2013,peerj.1:e31。尽管抗cd37抗体在早期临床试验中显示出活性，但目前没有一种抗cd37抗体在美国被批准用于临床试验。因此，本领域存在对改进的抗cd20和/或抗cd37抗体和/或包括抗cd20抗体和/或抗cd37抗体的改进的治疗的需求。[0330]在一些方面，与现有的抗cd20和/或抗cd37抗体相比，此类改进的抗cd20和/或抗cd37抗体可以具有不同的生物活性，诸如不同的杀伤细胞模式，并且可以潜在地用于治疗对市售的抗cd20抗体具有抗性或难治性的患者。在其他方面，此类改进的抗cd20和/或抗cd37抗体可以具有与免疫原性、跨物种结合活性、稳定性和/或在宿主细胞中的表达有关的改进的治疗和/或实用特性。其他改进可能潜在地包括抗cd20和/或抗cd37抗体彼此或与其他治疗分子的组合。在下文所述的各种组合物和方法中，抗cd20和抗cd37抗体及它们的组合与本领域已知的抗体相比具有有用的特性。[0331]许多非霍奇金淋巴瘤(nhl)和慢性淋巴细胞性白血病(cll)细胞在其细胞表面上表达cd20和cd37两者。deckert等人,anovelanti-cd37antibody-drugconjugatewithmultipleanti-tumormechanismsforthetreatmentofb-cellmalignancies,2013,blood122(20):3500-3510；dahle等人,evaluatingantigentargetingandanti-tumoractivityofanewanti-cd37radioimmunoconjugateagainstnon-hodgkin’slymphoma,2013,anticancerresearch33:85-96。对于此类癌症，用包含抗cd20和抗cd37抗体的混合物治疗可以减少产生耐药性的患者的数量，从而相比于使用单独的抗cd20抗体观察到的提高治疗功效，并且可以提供比目前批准的疗法更有效的长期维持疗法。此外，此类抗体混合物可以在单个宿主细胞系中使用例如在以下文献中所描述的技术来制备：美国申请美国申请公开号2019/0248899，从而在单个生产过程中而不是在两个单独的过程中产生抗体混合物。使用此过程制备的抗体对在本文中被称为mabpair。将申请美国申请公开号2019/0248899的描述此过程的部分(即，实施例1-12和其中提到的附图)通过引用并入本文。因此，此生产方法可以显著地提高抗体混合物的生产效率，更不用说同时降低生产成本。[0332]定义[0333]如本文所意指，“改变”是氨基酸序列或核苷酸序列中的变化。改变可以是插入、缺失或取代。“改变”是单个氨基酸或核苷酸的插入、缺失或取代。例如，如果缺失从氨基酸或核苷酸序列中去除三个氨基酸或三个核苷酸，则发生了三个改变(在这种情况下为多个缺失)。可以通过陈述原始序列中存在的氨基酸加上氨基酸在原始序列中的位置加上置换原始氨基酸的氨基酸来指代作为氨基酸取代的改变。例如，g133m表示最初存在于原始序列中的位置133处的甘氨酸被甲硫氨酸置换。此外，133m表示在位置133处的氨基酸是甲硫氨酸，但不指定原始氨基酸的身份，其可以是包括甲硫氨酸在内的任何氨基酸。最后，g133表示甘氨酸是原始序列中的位置133处的氨基酸。此外，g133m/a表示最初存在于原始序列中的位置133处的甘氨酸被甲硫氨酸或丙氨酸置换。[0334]如本文所意指，“不利于异二聚体的改变”是在第三重链恒定结构域(ch3)氨基酸序列(任选地人或灵长类动物ch3氨基酸序列)内的单个氨基酸的取代、插入或缺失，其中在抗体混合物的情况下，所示取代、插入或缺失不利于异二聚体hc/hc对的形成。抗体可以包含超过一个不利于异二聚体的改变，并且多个不利于异二聚体的改变可以发生在抗体混合物中的一个或多个抗体中的多个位点。在一些情况下，不利于异二聚体的改变可能仅具有很小的作用或没有作用，但是当在抗体混合物中的相同抗体中或不同抗体中存在不利于异二聚体形成的一个或多个其他改变时，可以抑制异二聚体形成。改变中可以包括的是将野生型序列中存在的可以是带电荷的也可以是不带电荷的残基取代为带电荷的残基。可替代地，取代可以在异二聚体hc/hc对中产生干扰正确的重链/重链(hc/hc)配对的空间位阻，诸如邻接另一个“突出(protuberance)”的“突出”或邻接另一个“臼(hole)”的“臼”。突出(或杵)和孔在美国专利号8,679,785的第12列第12行到第13列第2行中有描述，所述美国专利通过引用并入本文。igg重链中可能一起不利于异二聚体形成的的一对改变的实例是d399k/r加k409d/e。[0335]如本文所意指，“抗体”是含有至少一个vh或vl的蛋白质。抗体通常含有vh和vl两者。vh和vl在以下参考文献中有全面详细的描述：例如，kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第五版,u.s.departmentofhealthandhumanservices,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,nih出版号91-3242,1991，第xvi-xix页和第103-533页，其通过引用并入本文。“抗体”包括具有不同形式的分子，所述不同形式诸如单链fv抗体(scfv，其包含由接头连接的vh和vl)、fab、f(ab')2、fab'、scfv:fc抗体(如在carayannopoulos和capra,fundamentalimmunology中的第9章，第3版,paul编辑,ravenpress,newyork,1993，第284-286页中所述，其通过引用并入本文)，以及如下文所定义的igg抗体，以及许多其他可能的形式。在一些实施方案中，“抗体”涵盖包括重链和轻链可变结构域加上t细胞受体的部分的嵌合抗原受体(car)。[0336]“抗cd20”或“抗cd37”抗体分别特异性地“结合”cd20或cd37，任选地人或食蟹猴cd20或cd37。由于cd20和cd37两者都是多次跨越细胞膜的细胞表面蛋白，因此难以产生可溶形式的cd20或cd37来测试结合。因此，在例如实施例2和7中，通过它们与已知表达cd20和cd37的细胞的结合来评估抗cd20和抗cd37与它们的靶标的结合。鉴于测试抗体的cdr源自已知结合cd20或cd37的抗体，有可能检测到的结合是由于与cd20或cd37的结合。然而，由于这种类型的结合测定没有明确地证明特异性，因此在实施例13中提供的数据中进一步阐明了如本文所意指的结合特异性，其中结合特异性通过抗hcd20抗体与用hcd20转染的cho细胞的特异性结合和抗hcd37抗体与用hcd37转染的cho细胞的特异性结合来证明。因此，与抗原的“特异性结合”可以通过实施例13中所述的结合测定来确定。[0337]“化学治疗剂”靶向分裂细胞并且干扰与细胞分裂相关的过程(例如，dna复制、rna合成，蛋白质合成，有丝分裂纺锤体的组装、拆卸或功能，和/或在这些过程中发挥作用的分子(诸如核苷酸或氨基酸)的合成或稳定性)。因此，化学治疗剂可以杀伤癌细胞和其他分裂细胞两者。化学治疗剂是本领域熟知的。它们包括例如以下药剂：烷化剂(例如，白消安、替莫唑胺、环磷酰胺、洛莫司汀(ccnu)、链脲佐菌素、甲基罗氮芥、顺二氯化二氨亚铂、噻替派和氮丙啶基苯并醌)；无机离子(例如，顺铂和卡铂)；氮芥(例如，盐酸美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺和盐酸氮芥)；亚硝基脲(例如，卡莫司汀(bcnu))；抗肿瘤抗生素(例如，阿霉素(多柔比星)、道诺霉素、光神霉素、柔红霉素、伊达比星、丝裂霉素c和博来霉素)；植物衍生物(例如，长春新碱、长春地辛、长春碱、长春瑞滨、紫杉醇、多西紫杉醇、vp-16和vm-26)；抗代谢药(例如，甲氨蝶呤加或不加醛氢叶酸、5-氟尿嘧啶加或不加醛氢叶酸、5-氟脱氧尿苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、吉西他滨、阿糖胞苷、5-氮胞苷、羟基脲、脱氧肋间型霉素和氟达拉滨)；鬼臼毒素(例如，依托泊苷、伊立替康和拓泊替康)；以及放线菌素d、达卡巴嗪(dtic)、mamsa、丙卡巴肼、六甲嘧胺、五甲嘧胺、l-天冬酰胺酶和米托蒽醌。参见例如，cancer:principlesandpracticeofoncology，第4补充版本,devita等人编辑,j.b.lippincottco.,philadelphia,pa.(1993)，所述文献的相关部分通过引用并入本文。[0338]其他化学治疗剂包括通过与上文所列出的那些化学治疗剂相同的一般机制起作用的那些。例如，通过烷化dna起作用的药剂(例如烷化剂和氮芥就是如此)被认为是化学治疗剂。干扰核苷酸合成的药剂(例如甲氨蝶呤、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶和吉西他滨)被认为是化学治疗剂。有丝分裂纺锤体毒物被认为是化学治疗剂，例如紫杉醇和长春碱。干扰dna复制的拓扑异构酶抑制剂(例如，鬼臼毒素)被认为是化学治疗剂。通过各种机制干扰dna合成的抗生素被认为是化学治疗剂，其实例包括多柔比星、博来霉素和丝裂霉素。将氨基酸氨基甲酰化的药剂(例如，洛莫司汀、卡莫司汀)或耗尽天冬酰胺池的药剂(例如，天冬酰胺酶)也被认为是化学治疗剂。merckmanualofdiagnosisandtherapy，第17补充版本，第11章,hematologyandoncology,144.principlesofcancertherapy，表144-2(1999)。化学治疗剂中特别包括直接影响受上文列出的化学治疗剂影响的相同细胞过程的那些化学治疗剂。[0339]如本文所意指，在抗体混合物的上下文中，“同源”hc是已知特定lc与之配对以形成特定抗原的结合位点的hc。例如，如果已知的全长igg抗体x与抗原x结合，则抗体xhc是抗体xlc的同源hc，并且反之亦然。此外，如果混合物还包含与抗原y结合的抗体y，则抗体yhc相对于抗体xlc是“非同源的”且反之亦然，并且抗体ylc相对于抗体xhc是“非同源的”且反之亦然。[0340]“互补决定区”(cdr)是vh或vl内的高变区。每个vh和vl含有三个cdr，称为cdr1、cdr2和cdr3。cdr在抗体表面上形成环，并且主要负责确定抗体的结合特异性。cdr如下散布在四个更保守的框架区(称为fr1、fr2、fr3和fr4)之间：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。在例如图1的小图a(对于vh)和图1的小图b(对于vl)中指示了cdr的位置。kabat等人将vhcdr定位如下：cdr1位于位置31-35(可能的插入编号为35a和35b)；cdr2位于位置50-65(可能的插入编号为52a-52c)；并且cdr3位于位置95-102(可能的插入编号为100a-100k)。kabat等人，同上，在xvii。在本文中使用了vhcdr2和cdr3的这些位置。在本文中，我们将vhcdr1定义为包括残基26-35(可能的插入编号为35a和35b)，这不同于kabat等人定义，因为除了氨基酸31-35之外其还包括氨基酸26-30。kabat等人将vlcdr定位如下：cdr1位于位置24-34(可能的插入编号为27a-27f)；cdr2位于位置50-56；并且cdr3位于位置89-97(可能的插入编号为95a-95f)。kabat等人，同上，在xvii，其通过引用并入本文。本文中使用了vlcdr的这些定义。[0341]如果两种治疗/药物在相同的小时间范围内(例如在同一天)或在相同的更延长的时间范围内施用，则治疗或药物被认为是与另一种治疗或药物“同时”施用的。这种更延长的时间范围可以包括例如一种治疗/药物每周施用一次而另一种治疗/药物每4天施用一次的情况。尽管这两种治疗/药物可能从未或很少在同一天施用，但这两种治疗/药物在数周、数月或更长时间的共同时期内持续施用。类似地，如果一种药物每年施用一次，而另一种药物每周施用一次，则如果在每年施用一次的药物施用之前和/或之后的一年期间施用每周施用一次的药物，则认为它们是“同时”施用的。因此，如本文所意指，两种治疗/药物的“同时”施用包括用在共同时间段内进行的两种不同的治疗/药物进行的持续治疗。[0342]如本文所意指，“保守”氨基酸取代是氨基酸被具有相似特性(诸如相似极性、疏水性或体积)的不同氨基酸取代。保守取代包括氨基酸被同一组内的另一种氨基酸置换，其中氨基酸的组包括以下：(1)疏水性氨基酸，包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(2)不带电荷的极性氨基酸，包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(3)碱性氨基酸，包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；和(4)酸性氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸。保守取代还包括(1)a被v、l或i取代，(2)r被k、q或n取代，(3)n被q、h、k、r取代，(4)d被e取代，(5)c被s或a取代，(6)q被n取代，(7)e被d取代，(8)、g被p或a取代，(9)h被n、q、k或r取代，(10)i被l、v、m、a或f取代，(11)l被i、v、m、a或f取代，(12)k被r、q或n取代，(13)m被l、f或i取代，(14)f被l、v、i、a或y取代，(15)p被a取代，(16)s被t、a或g取代，(17)t被s取代，(18)w被y或f取代，(19)y被w、f、t或s取代，和(20)v被i、m、l、f或a取代。[0343]如本文所意指，“半胱氨酸取代”是半胱氨酸置换另一种氨基酸的一种氨基酸取代。[0344]如本文所意指，通过在一个或多个指定浓度下的抗体在多种细胞类型中的任何细胞类型中的“直接细胞杀伤”基本上如实施例2中所述和例如在图2(小图b)中所示进行评估。包括使用的细胞类型、所使用的抗体浓度、添加抗体后孵育测定的时间长度、待使用的微量滴定板的类型(96或48孔微量滴定板)以及交联抗体的使用或不使用(如下面实施例2中所定义)在内的详细参数可以改变，并且此类改变可以影响结果。然而，除非另有说明，否则“直接细胞杀伤”是指一种测定，其中(1)在添加抗体后所述测定在37℃下孵育24小时并且(2)使用96孔微量滴定板来运行测定。实施例2中描述了进行该测定的细节，包括“交联抗体”的含义。在所述测定中被杀伤的细胞的百分比如下进行评估。首先，可以通过在没有添加测试抗体的平行样品中检测到的细胞数来评估细胞培养物中的细胞总数。因此，如果含有抗体的样品包含少于或等于在不含抗体的平行样品中存在的母细胞数量的90％，则抗体“直接杀伤了”细胞培养物中至少10％的细胞。类似地，如果含有抗体的样品包含少于或等于在不含抗体的平行样品中存在的母细胞数量的50％，则抗体“直接杀伤了”培养物中至少50％的细胞。可以用于测试用于直接细胞杀伤的抗cd20或抗cd37抗体的细胞类型包括例如raji细胞、ramos细胞或wsu-dlcl2细胞等。[0345]当在不同的样品中使用不同浓度的抗体时，可以通过使用graphpadprism软件(例如，版本6.0；graphpad软件，sandiego,california)分析给定实验中生成的数据来确定给出最大响应的50％的浓度(“ec50”)，其中使用非线性回归曲线拟合来计算ec50。此外，可以针对上文所述的直接细胞杀伤测定以及其中使用不同量的试剂来创建剂量/响应曲线的许多其他测定(例如，实施例13中所述的结合测定或实施例5中所述的adcc或cdc测定)来确定ec50。[0346]如本文所意指，当给定已知的遗传密码，氨基酸序列理论上可以由核苷酸序列编码时，氨基酸序列“由核苷酸序列编码”。如本文所意指，这样的多肽链实际上不需要由这样的核酸制成以由核苷酸序列“编码”，并且所述核苷酸序列不需要包含转录和/或翻译停止和开始所必需的所有辅助序列以“编码”氨基酸序列。如本领域已知的，给定的氨基酸序列由于遗传密码的简并性由确定的核酸序列集合“编码”。此外，如上文所述，由核苷酸序列“编码”的氨基酸序列，如果由于翻译后修饰以致于改变其氨基酸序列，则仍被认为是由核酸序列(如本文所意指)“编码”。因此，例如，如果除了序列中的一个氨基酸被改变或缺失之外，氨基酸序列由核苷酸序列“编码”，那么如果所述改变或缺失是由于翻译后修饰引起，则其在本文中被认为是由核苷酸序列“编码”的。例如，在中国仓鼠卵巢(cho)细胞中产生的重组人源化igg抗体通常会缺少hc的羧基末端(c末端)赖氨酸，即使编码这样的抗体的核苷酸序列可能编码c末端赖氨酸。这种赖氨酸通常在翻译后被去除。这样的hc在本文中被认为是由编码具有c末端赖氨酸的hc的核苷酸序列“编码”的。[0347]如本文所意指，igg抗体的“fc片段”、“fc区”或“fc部分”基本上由来自hc的铰链结构域(铰链)、第二重链恒定结构域(ch2)和ch3，尽管其在一些同种型诸如iga或igm中还可以包含ch3下游的区域。[0348]如本文所意指，“重链(hc)”包含至少一个vh、ch1、铰链、ch2和ch3。包含所有这些结构域的hc也可以被称为“全长hc”或“igghc”。一些同种型(诸如iga或igm)可以含有另外的序列，例如igmch4结构域。kabat等人，同上的编号系统用于vh(参见图1(小图a)和图8(小图a))，并且eu系统(edelman等人(1969),proc.natl.acad.sci.usa63:78-85，其整体并入本文)用于ch1、铰链、ch2和ch3。使用这些熟知的编号系统可以导致本文所公开的序列中的实际氨基酸位置与使用kabat或edelman编号系统分配给所述位置的编号之间的差异。然而，本领域技术人员可以使用在kabat等人，同上和edelman等人，同上中所包含的信息和/或参考显示如何参考可以位于所公开的序列中的抗体序列保守特征来分配kabat或edelman编号的本文下面所公开的表格将kabat或edelman编号分配给所公开的抗体序列中的任何特定位置。下面的表1-4说明了对广义hc序列的这种编号。[0349]表1：人vh的共有序列[0350][0351]表1：此表显示在kabat等人(同上)中基于人vh氨基酸序列(亚组i-iii)的“不变”(根据kabat等人，同上)氨基酸。编号根据kabat等人，同上。cdr内的位点编号以粗体斜体字书写。它们后面带字母的位置数字(例如，100a(除82a-82c之外))由于cdr的长度不同可能会或可能不会被氨基酸填充。位于框架区中的位置82a-82c几乎总是由人vh亚组i-iii中的氨基酸填充。在特定位置的单个粗体字氨基酸表示人vh的所有三个亚组i-iii中的“不变”氨基酸，如kabat等人(同上)所描述的。未指定氨基酸的位置不符合此标准。[0352]表1显示，有许多具有保守的间距的保守氨基酸，这将允许对具有间距的保守氨基酸的任何vh序列的比对，如上文目测所示。可替代地，可以使用比对软件将新的序列与已知的vh序列进行比对，所述比对软件例如在国际免疫遗传学(imgt)上可获得的比对软件(例如imgt/domaingapalign，其可在http://www.imgt.org上获得)或clustalomega(sievers等人,fast,scalablegenerationofhighqualityproteinmultiplesequencealignmentsusingclastalomega,2011,molecularsystemsbiology7(1):539)。[0353]下面表2显示了ch1的共有氨基酸序列。[0354]表2：ch1共有[0355][0356]表2：编号根据edelman等人(同上)。数字下面以粗体字所示的单个氨基酸是来自多种物种的ch1的比对的根据kabat等人(同上)的“不变”残基。本文中或美国申请公开号2019/0248899中所描述的选择用于改变的位点(131、133、147、168、170、173、176、181和183)以下划线粗体字显示。在这些位点处，kabat等人(同上)中报道的63个灵长类动物ch1序列中最常见的一个或两个氨基酸以纯文本显示。没有指定氨基酸的位置不是“不变的”，并且也没有被选择用于改变。[0357]物种和/或同种型中的ch1在序列上比表2中明显更紧密地相关。下面表3显示了igg1、igg2、igg3和igg4同种型的人ch1的比对。这种比对突出了在这些密切相关的ch1之间非常强的序列保守。[0358]表3：人igg1、igg2、igg3和igg4ch1的比对[0359][0360]表3：人igg1、igg2、igg3和igg4抗体的代表性ch1的氨基酸序列分别从imgt网页的humanizationbystructure-basedcomputationalproteindesign,2015,mabs7(6):1045-1057及其中所引用的参考文献。然而，为了改善抗体的一种或多种特性而努力做出的改变的结果是不完全可预测的，这主要是由于cdr3环的高度灵活性。参见例如，dossantos等人,advancesandchallengesintherapeuticmonoclonalantibodiesdrugdevelopment,2018,braz.j.pharm.sci.54(special):e01007。[0367]如本文所意指，“igg抗体”包含(1)两条hc，每条hc包含vh、ch1、铰链结构域、ch2和ch3，以及(2)两条轻链(lc)，每条lc包含vl和lc恒定结构域(cl)。igg抗体的重链恒定结构域具有igg同种型，例如igg的igg1、igg2、igg3或igg4亚类。这些结构域描述于例如kabat等人，同上，第xv-xix页和第647-699页，所述页面通过引用并入本文。kabat等人，同上的编号系统被用于vh和vl(参见本文的图1和图8以及表1和表5)。eu系统(edelman等人(1969),proc.natl.acad.sci.usa63:78-85，其整体并入本文)被用于cl、ch1、铰链、ch2和ch3。参见表2-4和表6。在一些实施方案中，igg抗体的恒定结构域的一些部分可以属于一个亚类，例如igg4，并且同一抗体的另一部分可以属于另一个亚类，例如igg1。如本文所意指，此类抗体仍然是igg抗体。具有此类混合亚类氨基酸序列的ch1至ch3抗体片段的氨基酸序列的实例包括seqidno:33、36、39和42。此外，如本文所意指的igg抗体的恒定结构域的氨基酸序列可以在有限的程度上与天然存在的序列偏差，而不会将所述抗体改变为除如本文所意指的igg抗体之外的某种物质。例如，igg抗体可以包含相对于天然存在的igg氨基酸序列含有不超过24个、20个、16个、14个、12个、十个、九个、八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个氨基酸取代、缺失或插入的ch1至ch3片段。然而，igg抗体的igg亚类可能会或可能不会随着ch1至ch3片段的长度而变化，使得例如出于确定抗体是否是如本文所意指的igg抗体的目的，该片段的一部分氨基酸序列可以与例如igg1抗体序列进行比较，并且所述氨基酸序列的另一部分可以与例如igg4抗体序列进行比较。[0368]如本文所意指的“轻链(lc)”包含vl和cl，其可以是κ(vlκ和clκ)或λ(vlλ和clλ)的。这些结构域(包括其示例性氨基酸序列)描述于例如kabat等人，同上，第xiii-lix页、第103-309页和第647-660页，其通过引用并入本文。本文中用于vl的编号系统是在kabat等人，同上在所描述的编号系统，并且用于cl的eu编号系统是在edelman等人，同上中所描述的编号系统。下面的表5和表6说明了这些系统在各种轻链序列中的应用。本领域技术人员可以使用这样的信息来将kabat或edelman编号分配给本文所公开的序列中的特定位置。[0369]表5：人vlκ的共有序列[0370][0371]表5：编号根据kabat等人(同上)。以粗体斜体字表示的数字指示cdr的位置。它们后面带字母的位置数字(例如，27a)由于cdr的长度不同可能会或可能不会被氨基酸填充。在kabat等人(同上)中的所有人κvl(第i-iv组)的“不变”残基显示为粗体字母，指出在该位置出现的氨基酸。在位置73，两个保守变化的氨基酸(亮氨酸或缬氨酸)中的任一个在该位置是“不变的”。此外，在κ或λvl的一些亚组内，许多其他氨基酸是不变的或高度保守的，其可以帮助将特定的氨基酸序列归类为vl。没有指定氨基酸的位置不是不变的。[0372]表6：cl的共有序列和编号[0373][0374]表6：编号根据edelman等人(同上)，这与kabat等人(同上)对于cl的编号相同。数字下面以粗体所示的氨基酸根据kabat等人(同上)基于来自多种物种的κ或λcl的比对是“不变的”残基。如在选定的位点(131、160、162、174、176和178)所指示，kabat等人(同上)中报道的十个人κ链(顶部)或28个人λ链(下部)中的高度保守的氨基酸以纯文本显示。如果在这些位点之一出现两个不同的氨基酸中的任一个，则较常见的氨基酸显示在较不常见的氨基酸之前，例如，a/m。此外，许多其他氨基酸在clκ或者clλ结构域的一些亚组中是不变的或高度保守的，这可以帮助将特定的氨基酸序列归类为cl。没有指定氨基酸的位置不是不变的。[0375]如本文所用的“mabpair”或“mabpair混合物”是指在已向其中引入编码抗体的dna的单个宿主细胞系的培养物中产生的一对(即，两种)抗体。宿主细胞仅产生两个主要种类的抗体。关于mabpair是如何产生的进一步描述，参考美国申请公开号2019/0248899(实施例1、2、3、4、5、6和7以及其中所述的附图，所有这些都通过引用并入本文)中的描述。[0376]在如本文所意指的抗体混合物的情况下抗体“主要种类”是构成混合物内抗体总量的至少10％的特定抗体。为了确定抗体混合物中有多少主要种类，可以进行如在美国申请公开号2019/0248899的实施例5中所述和图14(美国申请公开号2019/0248899的这些部分通过引用并入本文)中所示的低ph阳离子交换(cex)色谱法。chen等人,theuseofnativecation-exchangechromatographytostudyaggregationandphaseseparationofmonoclonalantibodies,2010,proteinscience,19:1191-1204(其整体并入本文)描述了这种方法。简而言之，其采用了前面有一个50mm保护柱(propactmwcx-10g)的thermopropactmwcx-10weakcex柱(4x250mm)，使用watersalliance2695高效液相色谱(hplc)系统。色谱可以在30分钟内以从100％缓冲液a(20mm乙酸钠ph5.2)到100％缓冲液b(20mm乙酸钠和250mm氯化钠ph5.2)的线性梯度运行。可以用高盐(1m氯化钠)洗涤柱，并且重新平衡至缓冲液a的起始条件。可以通过在214nm处的吸光度在柱流出中检测到抗体。可以使用empowertm软件(waterscorp.,milford,ma,usa)来确定检测到的峰的相对量。低phcex可以区分不同的全长抗体种类，并且可以用于定量混合物中特定抗体种类的相对量。[0377]如本文所意指的抗体混合物中的抗体“次要种类”占混合物中抗体总量的少于10％。这可以通过低phcex色谱法确定，如“主要种类”的定义中所描述。[0378]术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，就像“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”一样。[0379]如本文所意指的“配偶体指导的改变(partnerdirectingalteration)”是在vh、ch1、vl或cl氨基酸序列内的hc/lc界面处的单个氨基酸的取代、插入或缺失，任选地将带电荷的氨基酸或半胱氨酸取代为天然存在的氨基酸，这导致hc和lc(任选地人和/或灵长类动物hc和lc)更强烈地缔合。更具体地，“hc配偶体指导的改变”是有时只有在vh或ch1中的“接触”残基处存在“lc配偶体指导的改变”的情况下可能导致hc和lc更强烈地缔合的在vl或cl中的改变。类似地，“lc配偶体指导的改变”是有时只有在vl或cl中的“接触”残基处存在“hc配偶体指导的改变”的情况下可能导致hc和lc更强烈地缔合的在vh或ch1中的改变。在一些实施方案中，hc和lc配偶体指导的改变的接触对可以是具有相反电荷的带电荷氨基酸的取代。在其他实施方案中，带电荷的氨基酸已经存在于hc或lc的接触位点之一处，因此仅需要改变一条链才能在同源hc/lc对的接触位点处产生一对带相反电荷的残基(即，电荷对)。在其他实施方案中，可以在接触位点引入半胱氨酸残基，使得同源hc/lc对中的二硫键可以形成。在另外的实施方案中，如美国专利号8,679,785(其相关部分通过引用并入本文)中所述，在接触残基处产生杵臼结构(knobandahole)(或突出和腔)的氨基酸可以由配偶体指导的改变产生。hc可以是igg、iga、igd、igm或ige同种型的，任选地igg1、igg2、igg3或igg4。hc和lc配偶体指导的改变发生在形成hc/lc界面一部分的接触氨基酸位置。cl和ch1中的界面残基包括内的那些，如在美国专利号8,592,562的表4和表5以及第10列和第11列中的所附文本(所有这些都通过引用并入本文)中所解释的。人ch1和cl中的这些位置编目于下表7中。[0380]表7：ch1和cl之间的接触残基[0381][0382][0383]在接触vh和vl之间的界面上的残基的特定情况下，适合用于改变的残基对(一个在vh中，还有一个在vl中)可以使用以下标准进行选择：(1)残基被掩埋或部分掩埋，即，在全长抗体的三级结构中不可及；(2)残基在空间上接近，即其中两个氨基酸的cα(cα是氨基酸的中心碳，氨基、羧基和侧链附着在其上)在约内，或者其中根据已知的结构模型，一个氨基酸的侧链重原子(除氢以外的任何原子)和另一个氨基酸的任何重原子之间最多有(3)残基是高度保守的，尽管它们不需要完全不变；和(4)残基不在cdr内或与cdr相互作用。此类接触残基的实例包括但不限于以下内容：位置44(vh)和位置100(vl)；位置39(vh)和位置38(vl)；以及位置105(vh)和位置43(vl)。[0384]近似地，由于hc和/或lc配偶体指导的改变导致的hc/lc缔合强度的变化可以通过“链脱落(chaindropout)”实验来测量，如美国申请公开号2019/0276542的实施例11和其中提到的附图以及美国申请公开号2019/0248899的实施例3和其中提到的附图(所有这些都通过引用并入本文)中所描述。[0385]为了确认或在一些情况下阐明链脱落实验的结果，在含有编码一级抗体(mab1)的hc和lc以及二级抗体(mab2)的hc和lc的dna的转染子中产生的fab片段的大小可以通过质谱来确定，如本文中在thompson等人,complexmixturesofantibodiesgeneratedfromasingleproductionqualitativelyandquantitativelyevaluatedbynativeorbitrapmassspectrometry,2014,mabs6:1:197-203(其整体并入本文)的实施例12和图24中以及美国申请公开号2019/0248899的图15和实施例5(其通过引用并入本文)中所描述。在大多数情况下，同源和非同源对可以使用此类技术通过质量来区分。如果非同源对是用编码未改变的mab1hc和lc以及未改变的mab2hc和lc的dna转染的细胞中的主要种类，并且不是用编码mab1hc和lc以及mab2hc和lc的dna转染的细胞中的主要种类，其中这些抗体中的至少一种包含配偶体指导的改变，那么本文认为所述改变中的至少一个是有利的配偶体指导的改变。[0386]配偶体指导的改变的实例包括部分或全部地产生以下改变对中的任何改变对：44d/e(vh)和100r/k(vl)；44r/k(vh)和100d/e(vl)；105r/k(vh)和43d/e(vl)；105d/e(vh)和43r/k(vl)；147d/e(ch1)和131r/k(cl)；147r/k(ch1)和131d/e(cl)；168d/e(ch1)和174r/k(cl)；168r/k(ch1)和174d/e(cl)；181r/k(ch1)和178e/d(cl)；和181e/d(ch1)和178r/k(cl)。此外，配偶体指导的改变包括取代，其中半胱氨酸被取代为另一种氨基酸，使得在抗体的hc和lc中存在半胱氨酸的接触对，例如以下对中的任何对：126c(ch1)和121c(cl)；126c(ch1)和124c(cl)；127c(ch1)和121c(cl)；128c(ch1)和118c(cl)；133c(ch1)和117c(cl)；133c(ch1)和209c(cl)；123c(ch1)和116c(cl)；141c(ch1)和116c(cl)；168c(ch1)和174c(cl)；170c(ch1)和162c(cl)；183c(ch1)和176c(cl)；173c(ch1)和160c(cl)；170c(ch1)和176c(cl)；和173c(ch1)和162c(cl)。[0387]“灵长类动物”核苷酸或氨基酸序列或蛋白质是在灵长类动物中出现的核酸或蛋白质中天然存在的一种核苷酸或氨基酸序列或蛋白质、或者除了如下文所解释的少量的改变之外与这样的序列或蛋白质相同的一种序列或蛋白质。灵长类动物包括来自许多家族的动物，包括但不限于原猴(包括狐猴)、新世界猴、黑猩猩、人、大猩猩、猩猩、长臂猿和旧世界猴。具体的灵长类动物物种包括但不限于智人(homosapiens)、普通猕猴(macacamulata)(恒河猴)、食蟹猕猴(macacafascicularis)(食蟹猴)和黑猩猩(pantroglodytes)(黑猩猩)等。许多灵长类动物核苷酸和氨基酸序列是本领域已知的，例如，在例如kabat等人，同上中报道的那些。通常，如本文所意指的“灵长类动物”氨基酸序列可以相对于天然存在的灵长类动物序列含有一个或多个插入、缺失或取代，条件是“灵长类动物”氨基酸序列每100个氨基酸中不包含超过10个的单个氨基酸插入、缺失和/或取代。类似地，相对于天然存在的灵长类动物序列，灵长类动物核苷酸序列每300个核苷酸中不包含超过30个的单个核苷酸插入、缺失和/或取代。在vh或vl序列的特定情况下，cdr预计是非常可变的，并且出于确定特定的vh或vl氨基酸序列(或编码它的核苷酸序列)是否是“灵长类动物”序列的目的，cdr(或编码它们的核苷酸)不被视为序列的一部分。[0388]如本文所意指，对于特定疾病或疾患的“治疗”是指一种行动过程，其可以包括施用在人类患者、被认为反映疾病或疾患的动物模型系统、或被认为反映疾病或疾患的基于细胞的体外测定中导致疾病或疾患的一种或多种症状的减轻或预期进展的减少或中断的一种或多种抗体或编码一种或多种抗体的一种或多种多核苷酸。这可以通过客观测量人或动物的症状的客观测量或通过测量基于细胞的测定中的各种参数(例如，一种或多种细胞因子(例如，ifnγ)的产生、细胞增殖或细胞死亡等)来确定。例如，对于癌症“治疗”，所述治疗可以导致肿瘤体积的减少、在人类或动物模型系统中没有预期的肿瘤转移、存活时间的增加、或患有癌症的人或动物的无进展或无疾病存活时间的增加。癌症治疗还可以导致指示基于细胞的测定中免疫系统的激活的指数增加，例如，介导免疫应答的t细胞或其他细胞的增殖和/或介导免疫应答的t细胞或其他细胞的细胞因子产生增加。[0389]如本文所意指的“ts”是在氨基酸序列上与嵌合抗cd20抗体托西莫单抗几乎相同的嵌合抗cd20抗体。ts具有托西莫单抗的可变结构域加上人恒定结构域。托西莫单抗的hc和lc的氨基酸序列分别在seqidno:100和101中提供。ts的hc的氨基酸序列与托西莫单抗的氨基酸序列有如下不同：(1)其具有插入在seqidno:100的位置121和122之间的序列astk；和(2)在seqidno:100中的位置215处的丙氨酸被改变为在tshc中对应位置处(在tshc中的位置219处，因为其在该位置的上游插入了四个另外的氨基酸)的缬氨酸。ts的lc的氨基酸序列与seqidno:101的氨基酸序列不同是因为其具有另外的三个氨基酸，即，gec，附加于seqidno:101的氨基酸序列的羧基末端。[0390]抗cd20抗体[0391]本文描述了许多抗人cd20(抗hcd20)抗体。这些抗体可以是人或人源化抗体，任选地igg抗体诸如igg1、igg2、igg3或igg4抗体。这些抗体可以包含含有vh的hc以及含有vl的lc。在一些实施方案中，抗hcd20抗体的vh可以包含相对于seqidno:12含有不超过12个、11个、十个、九个、八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个改变的氨基酸序列，并且抗hcd20抗体的vl可以包含相对于seqidno:8含有不超过七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个改变的氨基酸序列。此类抗体可以与hcd20和任选地食蟹猴cd20(cynocd20)特异性地结合，并且在没有交联抗体的情况下使用10μg/ml的测试抗体浓度进行的直接细胞杀伤测定中可以直接杀伤至少20％、30％、40％或50％的wsu-dlcl2细胞。在另一个方面，此类抗体可以在没有交联抗体的情况下以不超过10、8、6、4、3、2、1.5、1、0.8、0.6、0.5或0.4nm的ec50进行的直接细胞杀伤测定中直接杀伤wsu-dlcl2细胞。[0392]在一些实施方案中，vh可以包含(1)seqidno:12的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:12的核苷酸序列编码的氨基酸序列和/或(3)由seqidno:11编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl可以包含(1)seqidno:8的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列和/或(3)由seqidno:7编码的氨基酸序列。在另一个方面，抗hcd20抗体可以包含分别含有seqidno:1、2、3、4、5和6的氨基酸序列的vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。此外，vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3还可以包含由分别编码seqidno:1、2、3、4、5和6的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，vh可以由seqidno:11编码，并且vl可以由seqidno:7编码。此类抗体可以与hcd20和任选地cynocd20特异性地结合，并且可以在没有交联抗体的情况下使用10μg/ml的测试抗体浓度进行的直接细胞杀伤测定中直接杀伤至少20％、30％、40％或50％的wsu-dlcl2细胞。在另一个方面，此类抗体可以在没有交联抗体的情况下以不超过10、8、6、4、3、2、1.5、1、0.8、0.6、0.5或0.4nm的ec50进行的直接细胞杀伤测定中直接杀伤wsu-dlcl2细胞。[0393]这些抗hcd20抗体可以是igg抗体，在一些实施方案中为人或人源化igg抗体。此类igg抗体可以是igg1、igg2、igg3或igg4亚类。在其他实施方案中，此类igg抗体可以包含来自多于一个igg亚类的氨基酸序列。例如，否则为igg1抗体的抗体可以具有igg4铰链或仅igg4铰链的一部分以取代igg1铰链或其一部分，并且其仍将被视为如本文所意指的igg抗体。在其他实例中，所述ch1结构域或其一部分可以具有igg1、igg2、igg3或igg4ch1结构域的氨基酸序列，所述铰链或其一部分可以具有igg1、igg2、igg3或igg4铰链的氨基酸序列，并且所述ch2结构域或其一部分可以具有igg1、igg2、igg3或igg4ch2结构域的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述ch1结构域具有igg3或igg4ch1结构域的氨基酸序列，所述铰链具有部分地为igg4序列和部分地为igg1序列的氨基酸序列，并且ch2和ch3结构域具有igg1氨基酸序列。可替代地或另外，恒定结构域的序列可能与天然存在的igg抗体的序列有些偏差，特别是在铰链结构域中。食蟹猴cd20(cynocd20)。在一些实施方案中，抗hcd20抗体的hc可以包含(1)seqidno:24的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:24的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在另外的实施方案中，抗hcd20抗体的hc可以包含相对于seqidno:18含有不超过八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个改变的氨基酸序列。此外，抗hcd20抗体的hc可以包含(1)seqidno:18的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:18的核苷酸序列编码的氨基酸序列。此类抗体可以与hcd20和任选地cynocd20特异性地结合，并且可以在没有交联抗体的情况下使用10μg/ml的抗体浓度进行的直接细胞杀伤测定中直接杀伤至少20％、30％、40％或50％的wsu-dlcl2细胞。在另一个方面，此类抗体可以在没有交联抗体的情况下以不超过5、4、3、2、1.5、1、0.8、0.6、0.5或0.4nm的ec50直接杀伤wsu-dlcl2细胞。[0394]在另外的实施方案中，抗hcd20抗体的hc可以包含相对于seqidno:23含有不超过12个、11个、十个、九个、八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个改变的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hcd20抗体的hc可以包含(1)seqidno:23的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:23的核苷酸序列编码的氨基酸序列和/或(3)由seqidno:22的核苷酸序列编码的氨基酸序列。此类抗体可以与hcd20和任选地cynocd20特异性地结合，并且可以在没有交联抗体的情况下使用10μg/ml的测试抗体浓度进行的直接细胞杀伤测定中直接杀伤至少20％、30％、40％或50％的wsu-dlcl2细胞。在另一个方面，此类抗体可以在没有交联抗体的情况下以不超过10、8、6、4、3、2、1.5、1、0.8、0.6、0.5或0.4nm的ec50进行的直接细胞杀伤测定中直接杀伤wsu-dlcl2细胞。[0395]在一些实施方案中，抗hcd20抗体的hc可以包含239d和298a。在另外的方面，抗hcd20抗体的hc可以包含相对于seqidno:35含有不超过七个、六个、五个、四个、三个、两antigenreceptortcells:safetystrategiestoovercometoxicity,2019,molecularcancer18:125(https://doi.org/10.1186/s12943-019-1057-4)；以及lemal和tournilhac,state-of-the-artforcart-celltherapyforchroniclymphocyticleukemiain2019,2019),j.immunother.cancer7:202(https://doi.org/10.1186/s40425-019-0686-x)。这些参考文献均通过引用整体并入本文。[0399]本文上文和下文所述的抗hcd20抗体可以具有有利的特性。例如，当hcd20显示在细胞表面上时，这些抗hcd20抗体可以结合hcd20，当cynocd20显示在细胞表面上时，可以结合cynocd20，和/或在有或没有交联抗体的情况下可以直接杀伤表达cd20的细胞。此类抗体可以与hcd20和任选地cynocd20特异性地结合，并且可以在没有交联抗体的情况下使用10μg/ml的测试抗体浓度进行的直接细胞杀伤测定中直接杀伤至少20％、30％、40％或50％的wsu-dlcl2细胞。在另一个方面，此类抗体可以在没有交联抗体的情况下以不超过10、8、6、4、3、2、1.5、1、0.8、0.6、0.5或0.4nm的ec50进行的直接细胞杀伤测定中直接杀伤wsu-dlcl2细胞。本文所述的抗hcd20抗体可以在体外介导抗体依赖性细胞溶解(adcc)，并且在实施例5中所述的其中wsu-dlcl2细胞被用作靶细胞的测定中可以具有小于2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.03或0.02nm的ec50(图7小图a中所示的数据)。这里所述的抗hcd20抗体可以在体外介导补体依赖性细胞溶解(cdc)，并且可以在实施例5中所述的其中wsu-dlcl2细胞被用作靶细胞的cdc测定中具有小于20、15.10、9、8、7、6或5nm的ec50(图7小图b中所示的数据)。[0400]抗cd37抗体[0401]本文描述了许多抗人cd37(抗hcd37)抗体。这些抗体可以是人或人源化抗体，任选地igg抗体诸如igg1、igg2、igg3或igg4抗体。这些抗体可以包含含有vh的hc以及含有vl的lc。在一些实施方案中，抗hcd37抗体的vh可以包含相对于seqidno:57含有不超过八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个改变的氨基酸序列，并且抗hcd37抗体的vl可以包含相对于seqidno:53含有不超过八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个改变的氨基酸序列。抗hcd37抗体的vh可以包含(1)seqidno:57的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:57的核苷酸序列编码的氨基酸序列和/或(3)由seqidno:56编码的氨基酸序列。在另一个方面，抗hcd37抗体的vl可以包含(1)seqidno:53的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:53的核苷酸序列编码的氨基酸序列和/或(3)由seqidno:52编码的氨基酸序列。抗hcd37抗体可以包含分别含有seqidno:46、47、48、49、50和51的氨基酸序列或包含由分别编码seqidno:46、47、48、49、50和51的核苷酸序列编码的氨基酸序列的vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。此类抗hcd37抗体在没有交联抗体的情况下使用10μg/ml浓度的抗hcd37抗体进行的直接细胞杀伤测定中可以直接杀伤至少20％、30％、40％、50％或60％的ramos细胞。在另一个方面，此类抗hcd37抗体可以在没有交联抗体的情况下以不超过10、7、5、4、3、2、1、0.8、0.7、0.6或0.5nm的ec50直接杀伤ramos细胞。[0402]本文所述的抗hcd37抗体可以包含(1)相对于seqidno:59的氨基酸序列含有不超过十个、九个、八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个改变的hc和(2)相对于seqidno:55含有不超过八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个改变的lc。在一些实施方案中，此类抗hcd37抗体的hc可以包含(1)seqidno:59的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:59的核苷酸序列编码的氨基酸序列和/或(3)由seqidno:58编码的氨基酸序列。此外，本文所述的抗hcd37抗体可以包含lc，其包含(1)seqidno:55的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:55的核苷酸序列编码的氨基酸序列和/或(3)由seqidno:54编码的氨基酸序列。此类抗hcd37抗体在没有交联抗体的情况下使用10μg/ml浓度的抗hcd37抗体进行的直接细胞杀伤测定中可以直接杀伤至少20％、30％、40％、50％或60％的ramos细胞。在另一个方面，此类抗hcd37抗体可以在没有交联抗体的情况下以不超过10、7、5、4、3、2、1、0.8、0.7、0.6或0.5nm的ec50直接杀伤ramos细胞。[0403]在一些实施方案中，此类抗hcd37抗体的hc和/或lc可以在特定位点处包含一个或多个特定氨基酸，其可以由改变引起。例如，在一个方面，抗cd37可以在特定位点包含以下氨基酸组中的一个：(a)34v(hc)和31n(lc)；(b)99l(hc)和54i(lc)；(c)64q(hc)和94d(lcl)；(d)34l(hc)、64q(hc)、53s(lc),和93e(lc)；(e)34l(hc)、64q(hc)、99l(hc)、31n(lc)、53s(lc)和92g(lc)。在另外的方面，抗hcd37抗体的hc可以包含以下氨基酸中的一种或多种：147d、170c、173c、220g和399r。lc可以包含以下氨基酸中的一种或多种：131k、160c、162c和214s。此类抗hcd37抗体在没有交联抗体的情况下使用10μg/ml浓度的抗hcd37抗体进行的直接细胞杀伤测定中可以直接杀伤至少20％、30％、40％、50％或60％的ramos细胞。在另一个方面，此类抗hcd37抗体可以在没有交联抗体的情况下以不超过10、7、5、4、3、2、1、0.8、0.7、0.6或0.5nm的ec50直接杀伤ramos细胞。[0404]在一些实施方案中，抗hcd37抗体的vh可以包含相对于seqidno:65含有不超过十个、九个、八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个改变的氨基酸序列，并且vl可以包含相对于seqidno:61含有不超过十个、九个、八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个改变的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗hcd37抗体的vh可以包含(1)seqidno:65的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:65的核苷酸序列编码的氨基酸序列和/或(3)由seqidno:64编码的氨基酸序列。在另一个方面，抗hcd37抗体的vl可以包含(1)seqidno:61的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:61的核苷酸序列编码的氨基酸序列和/或(3)由seqidno:60编码的氨基酸序列。此类抗hcd37抗体在没有交联抗体的情况下使用10μg/ml浓度的抗hcd37抗体进行的直接细胞杀伤测定中可以直接杀伤至少20％、30％、40％、50％或60％的ramos细胞。在另一个方面，此类抗hcd37抗体可以在没有交联抗体的情况下以不超过10、7、5、4、3、2、1、0.8、0.7、0.6或0.5nm的ec50直接杀伤ramos细胞。[0405]在另一个方面，抗hcd37抗体的hc可以包含相对于seqidno:67含有不超过18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、十个、九个、八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个改变的氨基酸序列，并且lc可以包含相对于seqidno:63含有不超过18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、十个、九个、八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个改变的氨基酸序列。在一些实施方案中，hc可以包含(1)seqidno:67的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:67的核苷酸序列编码的氨基酸序列和/或(3)由seqidno:66编码的氨基酸序列。在另一个方面，lc可以包含(1)seqidno:63的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:63的核苷酸序列编码的氨基酸序列和/或(3)由seqidno:62编码的氨基酸序列。此类抗hcd37抗体在没有交联抗体的情况下使用10μg/ml浓度的抗hcd37抗体进行的直接细胞杀伤测定中可以直接杀伤至少20％、30％、40％、50％或60％的ramos细胞。在另一个方面，此类抗hcd37抗体可以在没有交联抗体的情况下以不超过10、7、5、4、3、2、1、0.8、0.7、0.6或0.5nm的ec50直接杀伤ramos细胞。[0406]在其他实施方案中，抗hcd37抗体的hc可以包含相对于seqidno:71含有不超过18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、十个、九个、八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个改变的氨基酸序列，并且lc可以包含相对于seqidno:69含有不超过18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、十个、九个、八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个改变的氨基酸序列。在一些实施方案中，hc可以包含(1)seqidno:71的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:71的核苷酸序列编码的氨基酸序列和/或(3)由seqidno:70编码的氨基酸序列。在另一个方面，lc可以包含(1)seqidno:69的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:69的核苷酸序列编码的氨基酸序列和/或(3)由seqidno:68编码的氨基酸序列。此类抗hcd37抗体在没有交联抗体的情况下使用10μg/ml浓度的抗hcd37抗体进行的直接细胞杀伤测定中可以直接杀伤至少20％、30％、40％、50％或60％的ramos细胞。在另一个方面，此类抗hcd37抗体可以在没有交联抗体的情况下以不超过10、7、5、4、3、2、1、0.8、0.7、0.6或0.5nm的ec50直接杀伤ramos细胞。[0407]在另外的实施方案中，抗hcd37抗体的hc可以包含相对于seqidno:79或83含有不超过18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、十个、九个、八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个改变的氨基酸序列，并且lc可以包含相对于seqidno:75或81含有不超过18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、十个、九个、八个、七个、六个、五个、四个、三个、两个或一个改变的氨基酸序列。在一些实施方案中，hc可以包含(1)seqidno:79或83的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:79或83的核苷酸序列编码的氨基酸序列和/或(3)由seqidno:78或82编码的氨基酸序列。在另一个方面，lc可以包含(1)seqidno:75或81的氨基酸序列和/或(2)由编码seqidno:75或81的核苷酸序列编码的氨基酸序列和/或(3)由seqidno:74或80编码的氨基酸序列。此类抗hcd37抗体在没有交联抗体的情况下使用10μg/ml浓度的抗hcd37抗体进行的直接细胞杀伤测定中可以直接杀伤至少20％、30％、40％、50％或60％的ramos细胞。在另一个方面，此类抗hcd37抗体可以在没有交联抗体的情况下以不超过10、7、5、4、3、2、1、0.8、0.7、0.6或0.5nm的ec50直接杀伤ramos细胞。[0408]在一些实施方案中，抗hcd37抗体(包括本文所述的抗hcd37vh和vl)可以是嵌合抗原受体(car)的一部分，其还可以包括t细胞受体的部分并且可以用于car-t细胞疗法。在例如yu等人，同上；以及lemal和tournilhac，同上中有对car-t细胞疗法的解释。[0409]本文上文和下文所述的抗hcd37抗体可以具有各种有利的特性。例如，抗hcd37抗体可以结合当显示在细胞表面上时的hcd37，可以结合当显示在细胞表面上时的食蟹猴cd37(cynocd37)，和/或在有或没有交联抗体的情况下可以直接杀伤表达cd37的细胞。此类抗hcd37抗体在没有交联抗体的情况下使用10μg/ml浓度的抗hcd37抗体进行的直接细胞杀伤测定中可以直接杀伤至少20％、30％、40％、50％或60％的ramos细胞。在另一个方面，此类抗hcd37抗体可以在没有交联抗体的情况下以不超过10、7、5、4、3、2、1、0.8、0.7、0.6或0.5nm的ec50直接杀伤ramos细胞。在一些实施方案中，当使用如实施例5中所述的测定(除了靶细胞是raji细胞而不是wsu-dlcl2细胞)时，本文所述的抗hcd37抗体可以用于以小于30、20、10、9、8、7、6、5、1、0.1或0.01nm的ec50启动针对raji细胞的nk细胞介导的adcc。图16小图b和下文实施例10的最后一段。[0410]抗hcd20和抗hcd37抗体的混合物[0411]本文提供了包含本文所述的抗hcd20和抗hcd37抗体的抗体混合物。在一些实施方案中，抗体的这种混合物是在已经向其中引入了编码两种抗体的一种或多种dna的单个宿主细胞系中制备的。从单个细胞系制备抗体对的这种方法在美国申请公开号2019/0248899中以及美国申请公开号2019/0248899中描述这种方法的部分(即，第34-52页实施例1-12，加上其中提到的附图)(通过引用并入本文)有详细描述。使用这些方法制备的两种抗体的混合物在本文中被称为mabpair。抗hcd20和抗hcd37抗体的混合物也可以通过其他方法(例如，将在单独的细胞系中产生的两种抗体组合)制备。[0412]更详细地，这些混合物可以包含本文上文所述的抗hcd20抗体中的任何一种，其可以如并入本文的美国申请公开号2019/0248899的部分(即，第34-52页实施例1-12，加上其中提到的附图)中所描述的被改变。在一些实施方案中，抗hcd20或抗hcd37抗体在其hc中包含d399r和k409e。具有这些改变的hc的氨基酸序列的实例可以在seqidno:44(抗hcd20ab.1.2.2.1hc)中或在由seqidno:43的核酸序列编码的氨基酸序列中找到。混合物还可以包含本文所述的抗hcd37抗体中的任何一种。这些抗hcd37抗体中的任何一种或者可替代地抗hcd20抗体可以包含例如在它们的hc中的147d、170c、173c、220g和409r以及在lc中的131k、160c、162c和214s。具有这些变化的hc氨基酸序列的实例是seqidno:71(抗hcd37ab1.a1.1hc)和seqidno:83(抗hcd37ab1.n12.1hc)，并且包含这些变化的lc氨基酸序列的实例包括seqidno:69(抗hcd37ab1.a1.1lc)和seqidno:81(抗hcd37ab1.n12.1lc)。包含相对于本文所述的hc和lc序列具有其他改变(如wo2017/205014中所述)的抗hcd20和抗hcd37抗体的其他mabpair也包括在本文提供的抗体混合物中。此外，在一些实施方案中，抗hcd20抗体可以包含在其hc中的147d、170c、173c、220g和409r以及在其lc中的131k、160c、162c和214s，并且抗hcd37抗体可以包含在其hc中的399r和409e。在一些实施方案中，抗hcd37抗体可以包含在其hc中d147d、170c、173c、220g和409r以及在其lc中的131k、160c、162c和214s，并且抗hcd20抗体可以包含在其hc中的399r和409e。在一些实施方案中，抗hcd20抗体可以包含在其hc中d147d、170c、173c、220g、d399r和k409e以及在其lc中的131k、160c、162c和214s，并且抗hcd37抗体可以包含在其hc中的409r。在一些实施方案中，抗hcd37抗体可以包含在其hc中d147d、170c、173c、220g、d399r和k409e以及在其lc中的131k、160c、162c和214s，并且抗hcd20抗体可以包含在其hc中的409r。[0413]下面表8中列出了示例性的配偶体指导的改变，所述配偶体指导的改变中的一个或多个可以包括在抗体混合物中的抗hcd20和/或抗hcd37抗体中。[0414]表8：示例性的配偶体指导的改变[0415][0416]*抗体1和2是不同的抗体。就本表而言，它们是可互换的。[0417]#如表中所列出，单个一级抗体的重链和轻链(例如，hc1和lc1)的单一行中列出的改变可以一起发生。然而，混合物中的二级抗体可能包含或可能不包含在抗体2的同一行中列出的改变。在一些实施方案中，抗体可以包含在两行或更多行中列出的改变，例如，重链中的105r/k和147r/k以及轻链中的43e/d和131e/d。[0418]@并非所有改变都适用于所有igg亚型。[0419]假设两种抗体都是igg抗体，当它们是抗体混合物的一部分时，可以在抗hcd20和/或抗hcd37抗体中包括不利于异二聚体的改变。在一个实施方案中，一种抗体可以是igg4抗体(其在位置409处具有天然存在的精氨酸)或者已被改变以便在位置409处具有精氨酸的igg1抗体(即具有改变k409r)，而另一种抗体具有氨基酸399k/r和409d/e。[0420]在一些实施方案中，抗hcd20抗体和抗hcd37抗体(包括本文所述的抗hcd20vh和vl和抗hcd37vh和vl)可以是嵌合抗原受体(car)的一部分，其还可以包括t细胞受体的部分并且可以用于car-t细胞疗法。在例如yu等人，同上；以及lemal和tournilhac，同上中有对car-t细胞疗法的解释。[0421]多核苷酸、载体和宿主细胞[0422]提供了编码本文所述的抗体和/或抗体混合物的多核苷酸，例如dna或其他核酸。使用本文所提供的指导，本领域技术人员可以组合编码抗体的已知或新的核酸序列，并且通过已知方法对它们进行修饰以产生编码包含本文所述的vh和vl氨基酸序列的本文所述的抗体和抗体混合物的多核苷酸。编码vh、vl、hc或lc或此类序列的部分的核苷酸序列公开于例如seqidno:7、9、11、13、19、22、25、28、31、34、37、40、43、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、110、111和112以及整个本说明书中。在一些实施方案中，多核苷酸可以编码hc和/或lc，所述hc和/或lc包含关于图1和图8中所公开的氨基酸序列的改变，诸如配偶体指导的改变。此类改变可以是氨基酸取代。此外，此类多核苷酸可以编码hc和/或lc，所述hc和/或lc包含在可变结构域之外的一个或多个配偶体指导的改变和/或一个或多个不利于异二聚体的改变。许多编码人、哺乳动物和灵长类动物免疫球蛋白恒定结构域(例如cl、ch1、铰链、ch2和ch3)的核酸序列是本领域已知的。参见例如，kabat等人，同上。任选地，编码本文所述的可变结构域的多核苷酸序列可以与编码此类恒定结构域的多核苷酸序列组合以产生多种形式中的任一种形式的抗体，所述形式例如igg、igm、igd、ige、iga、双特异性形式、scfv、scfv-fc、fabs、bite(scfc-接头-scfv)、fab-scfv、igg-scfv。在一些实施方案中，多核苷酸序列可以编码hc，其中铰链或铰链的一部分可以取自与一个或多个其他恒定结构域不同的同种型或同种型亚类，和/或铰链区可以具有相对于天然存在的铰链结构域改变的氨基酸序列。在一些实施方案中，这些抗体可以包含配偶体指导的改变和/或不利于异二聚体的改变。在另外的实施方案中，多核苷酸序列可以编码已被修饰以便增加效应子功能(诸如补体依赖性细胞毒性(cdc)和抗体依赖性细胞的细胞毒性(adcc))的hc。参见实施例5和表16。在一些实施方案中，这些抗体可以是哺乳动物抗体，任选地是人抗体、人源化抗体或灵长类动物抗体。[0423]修饰多核苷酸的方法是本领域熟知的。用于产生经修饰的多核苷酸的最直接方法也许是合成具有所需序列的多核苷酸。许多公司(例如，dna2.0(menlopark,calif.,usa)、blueheron(bothell,washington)、genewiz(southplainfield,newjersey)、gen9(cambridge,massachusetts)和integrateddnatechnologies(idt；coralville,iowa))提供此服务。也可以采用其他已知的引入突变的方法，例如使用聚合酶链反应(pcr)进行定点诱变。参见例如，zoller,newmolecularbiologymethodsforproteinengineering,1991,curr.opin.biotechnol.2(4):526-531；reikofski和tao,polymerasechainreaction(pcr)techniquesforsite-directedmutagenesis,1992,biotechnol.adv.10(4):535-547。[0424]含有编码本文所述的抗体及其混合物的多核苷酸(任选地dna)的载体可以是适合于在所选择的宿主细胞中表达抗体的任何载体。所述载体可以包括选择性标记，用于选择含有所述载体的宿主细胞和/或用于在所述宿主细胞中维持和/或扩增所述载体。此类标记包括例如(1)向原核宿主细胞赋予对抗生素或其他毒素(例如，氨苄西林、四环素或卡那霉素)的抗性的基因，(2)补充细胞营养缺陷的基因，或(3)其操作提供无法从复杂或限定的培养基中获得的关键营养素的基因。特异性的选择性标记可以是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。zeocin抗性或新霉素抗性基因也可以用于在原核和真核宿主细胞两者中进行选择。如本领域已知的，二氢叶酸还原酶(dhfr)基因和/或无启动子胸苷激酶基因可以用于哺乳动物细胞中。参见例如，kingston等人2002,amplificationusingchocellexpressionvectors,currentprotocolsinmolecularbiology，第16章，第16.23单元,wiley2002。[0425]此外，载体可以含有一种或多种对于维持载体和/或表达编码本文所述的抗体或抗体混合物的插入序列所必需的其他序列元件。此类元件包括例如复制起点、启动子、一种或多种增强子、转录终止子、核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、外源序列的多接头插入位点(诸如编码本文所述的抗体或抗体混合物的dna)以及在两个插入序列之间的间插序列(例如编码hc和lc的dna)。可以选择这些序列元件以在所需的宿主细胞中起作用，从而促进载体的复制和/或扩增以及插入载体中的异源序列的表达。此类序列元件在本领域中是熟知的，并且可在大量可商购获得的载体中获得。[0426]在一些实施方案中，编码抗体或抗体混合物的多核苷酸可以携带在一种或多种病毒载体(任选地溶瘤病毒载体)上。此类病毒载体的实例包括腺病毒、腺相关病毒(aav)、逆转录病毒、痘苗病毒、改良痘苗病毒安卡拉(mva)、疱疹病毒、慢病毒、新城疫病毒、麻疹病毒、柯萨奇病毒、呼肠孤病毒和痘病毒载体。在此类实施方案中，可以将含有编码本文所述的抗体或抗体混合物的多核苷酸的这些病毒载体施用于患者以治疗疾病。在癌症患者中，例如，可以将含有编码抗体或抗体混合物的多核苷酸的此类病毒载体例如通过注射、吸入(例如，对于肺癌)、局部施用(例如，对于皮肤癌)和/或施用到粘膜(核酸可以通过其被吸收)及许多可能方式直接施用于患者体内的肿瘤或癌细胞主要部位。可替代地，此类病毒载体可以全身施用，例如通过口服、局部、经由粘膜施用，或通过皮下、静脉内、动脉内、肌内或腹膜注射施用，如本文所述。类似地，可以向患有疾病的患者施用编码如本文所述的抗体混合物的多核苷酸(其可以被包装在脂质体中)。[0427]例如出于产生一种或多种抗体的目的，可以将本文所述的多核苷酸和/或载体引入宿主细胞中。含有编码一种或多种抗体的一种或多种多核苷酸和/或载体的宿主细胞可以是适合于表达重组蛋白的多种细胞中的任一种。这些包括例如革兰氏阴性或革兰氏阳性原核生物，例如，细菌诸如大肠埃希氏菌(escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)或鼠伤寒沙门菌(salmonellatyphimurium)。在其他实施方案中，宿主细胞可以是真核细胞，包括物种诸如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe),或属克鲁维酵母属(kluyveromyces)、念珠菌属(candida)、spodotera的真核生物，或任何能够表达异源多肽的细胞。在另外的实施方案中，所述宿主细胞可以是哺乳动物细胞。适合于表达异源多肽的许多哺乳动物细胞系是本领域已知的，并且可以从各种供应商(包括例如美国典型培养物保藏中心(atcc))获得。合适的哺乳动物宿主细胞系包括例如cos-7系(atcccrl1651)(gluzman等人,1981,cell23:175)；l细胞；c127细胞；3t3细胞(atccccl163)；中国仓鼠卵巢(cho)细胞或它们的衍生物(诸如在无血清培养基中生长的veggiecho及相关的细胞系)(rasmussen等人,isolation,characterizationandrecombinantproteinexpressioninveggie-cho:aserum-freechohostcellline,1998,cytotechnology28:31-42)；缺乏二氢叶酸还原酶(dhfr)活性的cho-k1和chopro-3细胞系及它们的衍生物(诸如dukx-x11和dg44细胞系)；hela细胞；小仓鼠肾(bhk)细胞(例如，atcccrl10)；如由mcmahan等人,anovelil-1receptor,clonedfrombcellsbymammalianexpression,isexpressedinmanycelltypes,1991,emboj.10:2821-2832所描述的源自非洲绿猴肾细胞系cvi的cvi/ebna细胞系(atccccl70)；人胚胎肾(hek)细胞，诸如293、293ebna或msr293；人表皮a431细胞；人colo205细胞；hl-60细胞；u937细胞；hak细胞；jurkat细胞；hepg2/3b细胞；kb细胞；nih3t3细胞；s49细胞；和小鼠骨髓瘤细胞，包括ns0和sp2/0细胞。也可以使用其他能够表达异源多肽的原核、真核或哺乳动物细胞类型。[0428]制备抗体或抗体混合物的方法[0429]本文所述的抗体和抗体混合物可以通过本领域已知的方法制备。例如，可以使用任何适当的方法将编码一种或多种抗体的dna引入如上文所述的宿主细胞中，所述方法包括例如转染、转导、脂转染、转化、用微粒轰击、显微注射或电穿孔。在一些实施方案中，可以将编码两个全长抗体的dna引入宿主细胞中。此类方法是本领域已知的，并且描述于例如kaestner等人,conceptualandtechnicalaspectsoftransfectionandgenedelivery,2015,bioorg.med.chem.lett.25:1171-1176中，其通过引用并入本文。[0430]可以培养已经引入编码一种或多种抗体的dna的宿主细胞，并且可以从细胞培养上清液或细胞团中回收所述一种或多种抗体。一种或多种抗体可以进行进一步的纯化步骤，例如在许多可能的纯化步骤中的各种离心沉降、沉淀、透析和/或柱色谱(包括亲和层析(诸如蛋白a层析)、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、反相色谱、疏水相互作用色谱和尺寸排阻色谱法)。[0431]治疗方法[0432]任选地在一种或多种载体(例如，表达载体或溶瘤病毒载体)内包含的抗hcd20抗体、抗hcd37抗体、它们的混合物和/或编码本文所述的此类抗体或混合物的多核苷酸可以用于治疗各种癌症，例如非霍奇金淋巴瘤(nhl)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、b细胞cll(b-cll)、套细胞淋巴瘤、b细胞nhl(b-nhl)、小淋巴细胞性白血病(sll)、滤泡性淋巴瘤(fl)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、黑素瘤和伯基特淋巴瘤等等。在一些实施方案中，任选地在一种或多种载体中包含的抗hcd20抗体、抗hcd37抗体、它们的混合物和/或编码本文所述的此类抗体或混合物的多核苷酸可以用于治疗至少部分由b细胞介导的各种疾病，例如多发性硬化症、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等等。参见例如，hampe,bcellsinautoimmunediseases,2012,scientifica，文章id215308(http://dx.doi.org/10.6064/2012/215308)。在一些实施方案中，抗hcd20和/或抗hcd37可变结构域可以用作任选地包含一种或两种不同scfv的嵌合抗原受体(car)的一部分，以治疗上述疾病中的一种疾病。[0433]抗hcd20抗体、抗hcd37抗体、它们的混合物和/或编码此类抗体或混合物的多核苷酸可以与另外的疗法一起施用，所述疗法可以在所述抗体、抗体混合物或多核苷酸之前、之后和/或同时施用。另外的疗法可以选自由以下组成的组：放射、化学治疗剂或嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)疗法。在例如yu等人，同上中有对car-t细胞疗法的解释。取决于正在治疗的疾患，其他另外的疗法也是可能的。[0434]如果另外的疗法是化学治疗剂，则其可以是例如白消安、替莫唑胺、环磷酰胺、洛莫司汀(ccnu)、链脲佐菌素、甲基罗氮芥、顺二氯化二氨亚铂、噻替派、氮丙啶基苯并醌、顺铂、卡铂、盐酸美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、盐酸氮芥、卡莫司汀(bcnu))、阿霉素(多柔比星)、道诺霉素、光神霉素、柔红霉素、伊达比星、丝裂霉素c、博来霉素、长春新碱、长春地辛、长春碱、长春瑞滨、紫杉醇、多西紫杉醇、vp-16、vm-26、甲氨蝶呤加或不加醛氢叶酸、5-氟尿嘧啶加或不加醛氢叶酸、5-氟脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、吉西他滨、阿糖胞苷、5-氮胞苷、羟基脲、脱氧肋间型霉素、氟达拉滨、依托泊苷、伊立替康、拓泊替康、放线菌素d、达卡巴嗪(dtic)、mamsa、丙卡巴肼、六甲嘧胺、五甲嘧胺、l-天冬酰胺酶、米托蒽醌。参见例如，cancer:principlesandpracticeofoncology，第4补充版本,devita等人，编辑,j.b.lippincottco.,philadelphia,pa.(1993)，其相关部分通过引用并入本文。[0435]如果另外的疗法是放射，则放射治疗可以包括例如使用例如光子、质子或电子束的外部束放射和/或内部放射。有许多种外部放射，包括例如3-d构象放射疗法、强度调节放射疗法(imrt)、图像引导放射疗法(igrt)、断层放射疗法立体定向放射外科手术和立体定向身体放射疗法。内部放射方法包括例如近距离放射疗法或放射性物质的全身施用，例如放射性碘。[0436]关于抗体或其混合物，它们可以以适当的间隔以治疗有效剂量施用于患者。例如，单一抗体或抗体混合物的单次剂量可以为约0.01毫克/千克体重(mg/kg)至约50mg/kg、约0.05mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约7mg/kg。单次剂量可以为约0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5、mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg的剂量。类似地，抗体或抗体混合物的单次剂量可以为约0.37毫克/平方米的皮肤表面积(mg/m2)至约1850mg/m2、约0.5mg/m2至约370mg/m2、约3.7mg/m2至约370mg/m2或约18.5mg/m2至约259mg/m2。单次剂量为约10mg/m2、20mg/m2、37mg/m2、74mg/m2、111mg/m2、148mg/m2、185mg/m2、222mg/m2、259mg/m2、296mg/m2、333、mg/m2或370mg/m2、407mg/m2或440mg/m2。类似地，可以将抗体或抗体混合物的单次剂量以约0.62mg至约3100mg、约1mg至约620mg、约6.2mg至约620mg或约10mg至约434mg的剂量施用。单次剂量可以为约0.51、3、6、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100mg。[0437]在编码本文所述的抗体或抗体混合物的一种或多种多核苷酸的情况下，剂量可以例如为约5x109个拷贝的多核苷酸/千克体重(拷贝/kg)至约1015个拷贝/kg、约1010个拷贝/kg至约1014个拷贝/kg、或约5x1010个拷贝/kg至约5x1013个拷贝/kg。可替代地，剂量可以为约1010、1011、1012、1013、5x1013、1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014或1015个拷贝的多核苷酸。给药频率可以根据需要进行调整，并且可以为如上文所述的，或者例如，每天一次、每隔一天一次、每周两次、每周一次、每十天一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、或者每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、每七个月一次、每八个月一次、每九个月一次、每十个月一次、每十一个月一次或每十二个月一次。[0438]抗体、抗体混合物或编码它们的多核苷酸的剂量可以在一段时间内施用一次或两次或以一定时间间隔施用。例如，剂量可以按以下方式施用：每天一次、每隔一天一次、每周两次、每周一次、每十天一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、或者每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、每七个月一次、每八个月一次、每九个月一次、每十个月一次、每十一个月一次或每十二个月一次。给药可以继续例如持续约一周至四周，持续约一个月至六个月、持续约六个月至一年、持续约一年至两年、或者持续至多五年。在一些情况下，可以停止并重新开始给药。在一些实施方案中，可以施用包含抗hcd20和抗hcd37抗体的混合物，使得可以同时施用两种抗体。在一个或多个剂量的混合物之后，可以施用单独的抗体之一。在一些实施方案中，用此抗体抗体给药可以持续一段时间。在一些实施方案中，用抗体或抗体混合物给药可以被停止并重新开始一次或多次。[0439]上文已经概括地描述了本发明，提供下面的具体实施例以举例说明本发明，而不是限制其范围。应当理解的是，可以对本发明进行各种变化和修改，所述变化和修改符合本文所述的本发明的精神并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。此类变化和修改在本文所述的本发明的范围内，包括在所附的权利要求中。实施例[0440]实施例1：抗cd20ii型igg1抗体的人源化和产生[0441]下文所描述的是嵌合抗hcd20抗体托西莫单抗的人源化和进一步优化。在第一步骤中，将现有的鼠vh和vl序列分别与最相似的人种系vh和vl序列进行比对。[0442]抗cd20克隆b1的氨基酸序列通过搜索关键词“tositumomab(托西莫单抗)”从drugbank网站https://www.drugbank.ca/biotech_drugs上提取。检索到的氨基酸序列如下文所示，根据kabat等人对可变结构域进行编号。参见kabat等人，同上。kabat等人中所定义的cdr以粗体字型显示，例外是除了如kabat(同上)所定义的氨基酸31-35以外我们在vhcdr1中还包括氨基酸26-30，因为目前有一些建议认为这些氨基酸也参与抗原结合。这些是通过经由抗原受体编号和分类程序(antigenreceptornumberingandclassificationprogram，anarci)运行这些序列以注释抗体氨基酸序列来定义的cdr。参见dunbar和deane,anarci,antigenreceptornumberingandreceptorclassification,2016,bioinformatics32(2):298-300。[0443]表9：托西莫单抗的hc的氨基酸序列*[0444][0445]*cdr以粗体字型显示。结束于位置112的vh的编号根据kabat等人，同上。序列的其余部分根据edelman等人，同上进行编号。因此，由于编号系统之间的差异，在位置112和120之间的编号系统之间的接合区不具有填充每个位置的氨基酸。此外，在位置123和140之间的区域也不与edelman编号很好地一致。为了一致性，我们在hc内使用了从位置140向前的edelman编号。此外，用“#”标记的位置没有分配给它们的新位置编号，因为这些位置并不总是被氨基酸填充。[0446]表10：托西莫单抗的lc的氨基酸序列*[0447][0448]*cdr以粗体字型显示。结束于位置109的vl的编号根据kabat等人，同上进行。序列的其余部分根据edelman等人，同上进行编号。[0449]托西莫单抗的vh和vl氨基酸序列被回译成dna序列，其用于在imgt网站http://www.imgt.org/上搜索以寻找高度同源的人vh和vl种系序列。将人种系序列ighv1-46*01和ighd1-1*01和ighj3*01组装为igvh-d-j_germline，并与抗cd20托西莫单抗vh序列进行比对。图1小图a。类似地，将人种系序列igkv6-21*02和igkj2*01组装为igvl-j_germline，并与托西莫单抗vl序列进行比对。图1小图b。[0450]在人源化过程的第二步骤中，将托西莫单抗的cdr(其为鼠序列)单独接枝到如图1所示的组装的同源人vh和vl种系序列中。此步骤通常被称为“cdr接枝”，并且在图1的小图a和b两者的第三行中显示了这些cdr接枝序列(标记为“cdr-接枝物”)。[0451]简单地将鼠抗体的cdr环接枝到人类种系框架中通常会导致对抗原的结合亲和力降低或在一些情况下完全丧失。可能需要进一步优化以改善人源化抗体的结合和其他功能特性，以便使这些特性接近原始鼠抗体的特性。优化cdr接枝的抗体的一种方式涉及预测cdr接枝抗体的三级结构，并且鉴定可能干扰三级结构折叠或整体稳定性的结构方面。基于此分析，如果必要，则可以改变抗体的氨基酸序列，使得其正确地折叠并形成稳定的三级结构。kurella和gali,structureguidedhomologymodelbaseddesignandengineeringofmouseantibodiesforhumanization,2014,bioinformation10(4):180-186中描述了此方法，所述文献通过引用并入本文。抗体三级结构的这种稳定化可以导致表达和结合特性的改善，尽管这不是完全可预测的结果。[0452]为了改善上文所述的cdr-接枝抗体的特性，已将cdr-接枝的vh和vl的氨基酸序列提交到包括每个人的rosetta在线服务器(rosettaonlineserverthatincludeseveryone，rosie)抗体建模服务器。参见sivasubramanian等人,towardhigh-resolutionhomologymodelingofantibodyfvregionsandapplicationtoantibody-antigendocking,2009,proteins74(2):497-514.doi:10.1002/prot.22309；marze等人,improvedpredictionofantibodyvl-vhorientation,2016,proteineng.des.&sel.29(10):409-418；weitzner和gray,accuratestructurepredictionofcdrh3loopsenabledbyanovelstructure-basedc-terminalconstraint,2017,j.immunology198(1):505-515；weitzner等人,modelinganddockingantibodystructureswithrosetta,2017,natureprotocols12(2):401-416；lyskov等人，serverificationofmolecularmodelingapplications:therosettaonlineserverthatincludeseveryone(rosie),2013plosone8(5):e63906.doi:10.1371/journal.pone.0063906。[0453]基于能量最小化评分在十大评分抗体模型中选择一级抗体三级结构模型。使用具有内置的组合扩展(ce)模块比对工具来衡量有效性和模型预测属性的pymol(由提供；一种可以产生详细的立体图像的分子建模程序，其可在https://pymol.org/或https://www.schrodinger.com/pymol下载获得)来计算均方根偏差(rmsd)评分。此外，将使用procheck(一种通过经由残基几何形状和整体结构几何形状分析残基来分析三维蛋白质结构的立体化学质量的软件)和verify3d(一种创建蛋白质结构的三维轮廓(3d轮廓)的软件，其表示来自三级蛋白质结构的原子坐标是否定义了与蛋白质的氨基酸序列相容的结构)程序进行的pdbsum(来自蛋白质数据库(proteindatabase)的三维结构的图形数据库)结构分析用于验证基于同源性的三级结构模型。[0454]基于这些分析，我们检查了vh/vl、vh/ch1和vl/cl界面处的空间位阻的结构。在cdr-接枝的vh氨基酸序列中鉴定了七个可能有问题的残基，并且在cdr-接枝的的vl氨基酸序列中鉴定了四个。结果，对cdr-接枝的vh氨基酸序列进行了以下改变：m69l、r71v、t73k、t75s、v78a、y91f和q105t。在cdr-接枝的vl氨基酸序列中进行了以下改变：l46p、k49y、f71y和q100a。这些改变将鼠框架区中存在的残基引入人框架区中，并且在图1的小图a和小图b的第二行(标记为“acd20ab1”)中以粗体字和加下划线指示。如下文所述对改变的抗体氨基酸序列进行另外的计算分析，以试图找到改善其特性的另外方法。[0455]swiss-pdbviewer(deepview)软件已下载并在本地运行，以实现能量最小化(模拟退火)。对具有上述段落中提到的在vh和vl氨基酸序列中的改变的cdr-接枝的hc和lc氨基酸序列进行了能量最小化的格罗宁根分子模拟(groningenmolecularsimulation，gromos)力场分析。使用了默认设置，并且对输出模型进一步检查具有各种预测力场误差的残基，所述残基显示在能量最小化模型(即，预测对于输入氨基酸序列最稳定的三级结构模型)中。这些残基通过pymol单独进行检查。然后引入改变来校正通过这种模拟退火(即，抗体的模拟折叠)预测的任何空间位阻。对包含此类一种或多种改变的vh和vl氨基酸序列进行力场模拟退火，以确定所选择的一种或多种改变是否使三级结构稳定。通过这种能量最小化过程，发现在vh中的a16s取代防止在接触vl的界面处预测的空间位阻。然后使用pymol对包含这种进一步改变的vh和vl氨基酸序列进行进一步检查，以评估单个氨基酸的表面可及性。此分析表明，在vh(在cdr2中)的位置64处的赖氨酸可能会突出。已知残基从蛋白质表面的突出与免疫原性相关。参见例如，novotny(1986),proc.natl.acad.sci.83:226-230。因此，此残基被更改为谷氨酰胺(k64q)，我们认为其将减少此氨基酸的突出并有望降低免疫原性。最终的人源化抗体(包括cdr-接枝的形式的修饰以稳定其三级结构，促进折叠并消除潜在的免疫原性残基)被命名为抗hcd20ab1。图1中显示了抗hcd20ab1的vh和vl的序列(小图a和b中的第二行)与抗hcd20抗体托西莫单抗的鼠vh和vl(小图a和b中的第一行)、组装的同源人类种系序列的vh和vl(小图a和b中的底行)、以及cdr-接枝的序列的vh和vl(小图a和b中的第三行)的比对。[0456]通过选择灰仓鼠(cricetulusgriseus)(仓鼠)作为表达生物体，通过在idt网站(https://www.idtdna.com/codonopt)上运行密码子优化程序，将抗hcd20ab1的vh和vl氨基酸序列回译成dna序列。为了产生编码抗hcd20ab1的lc的质粒，编码跟着抗hcd20ab1vl的信号肽(sp)的dna片段由integrateddnatechnologies(idt)公司(iowa,usa)合成作为所谓的其是已知序列的通常长度为约300个至一千个碱基对(尽管稍短或稍长的长度也有可能的)的双链dna片段。编码抗hcd20ab1vl的dna序列和抗hcd20ab1vl的氨基酸序列分别如seqidno:7和8所示。此dna通过吉布森反应(gibsonreaction)(参见例如，gibsonmastermixinstructionmanual,newenglandbiolabsinc.(neb)，版本3.3,neb目录号e2611s/l,nebinc.ipswich,ma,usa)与在瞬时表达载体psb01中编码人κ恒定区的下游dna片段融合。将反应混合物通过电穿孔转化到感受态大肠埃希氏菌(e.coli)xl1blue中并且在含有抗生素羧苄西林的lb-琼脂平板上常规板出。挑取并培养所得的菌落。由genewiz公司通过dna测序确认质粒插入序列。抗hcd20ab1的lc的氨基序列和编码它的dna序列分别如seqidno:10和9所示。[0457]为了产生编码抗hcd20ab1的hc的质粒，编码跟着抗hcd20ab1vh的信号肽(sp)的dna片段由integrateddnatechnologies(idt)公司合成。抗hcd20ab1的vh的氨基酸序列和编码它的dna分别如seqidno:12和11所示。此dna通过吉布森反应与在瞬时表达载体psb01中的编码人igg1抗体的ch1、铰链、ch2和ch3区域的下游dna片段融合。将反应混合物通过电穿孔转化到感受态大肠埃希氏菌(e.coli)xl1blue中并且在含有抗生素羧苄西林的lb-琼脂平板上常规板出。挑取并培养所得的菌落，并且通过dna测序确认菌落中的质粒插入序列。抗hcd20ab1的hc的氨基酸序列和编码它的dna分别如seqidno:14和13所示。此hc是igg1hc。[0458]编码抗hcd20ab1抗体的lc和hc的质粒dna从含有它们的培养细菌中提取出来，并且使用midi-prep试剂盒(qiagenn.v.,thenetherlands)进行纯化。在125ml摇瓶中使用lipofectam2000(thermofisherscientific,waltham,ma,usa)用质粒dna转染在30毫升(ml)体积中的哺乳动物expi293tm细胞。将细胞在37℃下以150转/分钟(rpm)连续摇动5天。通过在4℃下以1500rpm旋转细胞20分钟来收获上清液，并且使用标准蛋白a柱纯化上清液中的抗体。[0459]实施例2：通过基于细胞的体外测定对人源化抗hcd20ab.1抗体进行表征[0460]进行以下实验以确定与其他对照抗cd20抗体相比抗hcd20ab1能够与在细胞表面上表达的人cd20结合的程度。[0461]已知raji细胞(atcc，目录号ccl-86；伯基特b细胞淋巴瘤细胞系)表达人cd20(hcd20)。参见例如，li等人,characterizationofarituximabvariantwithpotentanti-tumoractivityagainstrituximab-resistantb-celllymphoma,2009,blood114(24):5007-5015。使raji细胞在rpmi培养基1640(lifetechnologies，目录号21870)中在存在10％胎牛血清(fbs)、2mml-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100微克/毫升(μg/ml)链霉素(lifetechnologies，目录号15140-122)的情况下生长。将每个5ml管中的一百万个细胞用3mlfacs缓冲液(1x磷酸盐缓冲盐水(pbs，其为1.37mnacl、27mmkcl、100mmna2hpo4和18mmkh2po4)ph7.4、2％fbs、0.02％nan3)洗涤一次，并且在室温(rt)下以1500转/分钟(rpm)旋转三分钟，然后重悬于100μlfacs阻断缓冲液(facs缓冲液+10％正常山羊血清(ngs)+2％正常兔血清(nrabs))中。将管在室温下伴随摇动孵育1小时，用3mlfacs缓冲液洗涤一次，并且重悬于含有5μg/ml各种待测试抗cd20抗体的100μlfacs阻断缓冲液中。将细胞与抗体一起在室温下孵育30分钟。将细胞用facs缓冲液洗涤两次，并且重悬于含有5μg/ml二级抗体(fitc缀合的小鼠抗人igg，fc特异性的，jacksonimmunoresearch，目录号209-095-098)的facs阻断缓冲液中。将管在室温下以200rpm摇动30分钟，然后在facs缓冲液中洗涤两次。然后将细胞在含有2％胎牛血清(fbs)的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的2％甲醛中固定，并且在facscaliburtm台式分析仪(bdbiosciences)中进行facs分析。[0462]如图2小图a中所示，含有igg1抗hcd20抗体利妥昔单抗的样品具有310的几何平均荧光强度(geomfi)(用实线勾勒出并填充有深灰色的最右侧峰)，含有igg1抗hcd20抗体奥比妥珠单抗的样品具有220的几何mfi(用虚线勾勒出的峰)，并且含有人源化抗hcd20ab1igg1的样品具有240的几何mfi(以浅灰色填充的峰)。在图2小图a中的用实线勾勒出并填充有深灰色的最左侧峰代表含有人igg1同种型对照的样品。这些结果表明，抗hcd20ab1以与两种基准抗体(即，利妥昔单抗和奥比妥珠单抗)的水平相当的水平与raji细胞上表达的hcd20结合。尽管这些数据并未明确证明抗hcd20ab1的结合特异性，但是它们确实强烈表明抗hcd20ab1经由cd20与raji细胞结合，因为此抗体除了单个氨基酸取代之外具有与已知抗cd20抗体(托西莫单抗)相同的cdr。参见图1。[0463]一些抗cd20抗体可以通过例如补体依赖性细胞毒性(cdc)或抗体指导的细胞的细胞毒性(adcc)直接杀伤细胞，而不需要细胞杀伤所需要的另外组分。进行以下测定以评估抗hcd20ab1在直接细胞杀伤测定中的活性。测定如下进行。[0464]将raji肿瘤细胞以1x105个细胞/孔的细胞密度以200μl/孔的体积接种到平底96孔微量滴定板中的含有10％fbs的rpmi1640培养基中。将每种抗cd20抗体在测定培养基(含有10％fbs的rpmi1640)中稀释至30μg/ml。尽管这些测试抗体在本实验中没有“交联”，但是当“交联”在上文和下文结合直接细胞杀伤实验提到时，这意味着将多克隆山羊抗人igg(jacksonimmunoresearchlaboratories(westgrove,pa)，目录号109-005-098；在本文中称为“交联抗体”)的制剂以60μg/ml的浓度与稀释的测试抗体混合，并且在室温下孵育30分钟之后将抗体添加到肿瘤细胞。然后以100μl/孔(对于每个孔中300μl的总体积)添加抗体(在这种情况下其为抗cd20抗体而没有“交联抗体”)至10μg/ml的测试抗体终浓度。当包括“交联抗体”时，山羊抗人igg(即，交联抗体)的终浓度将为20μg/ml。然后将微孔板在5％co2下于37℃孵育24小时。孵育后，伴随温和混合添加10μl/孔的37％甲醛。同样的测定也在平底48孔板中运行，所有物质的体积都加倍。在配有自动进样器的facscaliburtm流式细胞仪上分析样品。样品体积设定为60μl/孔。用软件分析流式数据以确定母细胞(被认为是健康的活细胞)的数量，所述母细胞很容易通过大小与死细胞区分开并且可以在门控细胞群中计数。在y轴上将数据绘制为“母细胞数”。如图2小图b中所示，在96孔板中，与同种型对照抗体相比，利妥昔单抗和抗hcd20ab1显示出弱的杀伤活性(20-25％杀伤)。相比之下，奥比妥珠单抗显示出强的杀伤活性，超过50％的细胞杀伤。来自48孔板的结果与96孔板的结果中观察到的趋势一致。这些数据表明，抗hcd20ab1对raji肿瘤细胞具有弱的直接杀伤活性。[0465]实施例3：人源化抗hcd20ab1抗体的工程化[0466]由于在直接细胞杀伤中强的活性是期望的特性，所以对抗hcd20ab1进行工程化以增加这种活性。如实施例2中所示，与抗hcd20ab1和利妥昔单抗相比，抗hcd20抗体奥比妥珠单抗在直接细胞杀伤测定中表现出强的活性。奥比妥珠单抗和抗hcd20ab1被发现在它们的vh氨基酸序列中共享非常高的同源性，然而它们的vl序列差异更大。参见下面表11和表12。[0467]表11：抗hcd20ab1和奥比妥珠单抗的vh的比对#[0468][0469]ss抗hcd20ab1vh(seqidno:12)[0470]ss奥比妥珠单抗_vh(seqidno:16)[0471]**[0472]#如所指示，序列的上排是抗hcd20ab1的vh的氨基酸序列，并且序列的下排是奥比妥珠单抗的vh的氨基酸序列。cdr加下划线。在两条序列中不同并被选择用于改变的氨基酸以粗体字型指示。“‑”指示未被氨基酸填充的位置。在两个比对序列下的符号行中，“*”指示在此位置的相同氨基酸。“:”指示保守取代。“.”也指示保守取代，但在两种氨基酸之间存在较小相似性的情况。在不使用符号的情况下，存在非保守取代或一条序列在这个位点处具有氨基酸而另一条序列没有的情形。[0473]表12：抗hcd20ab1和奥比妥珠单抗的vl的比对#[0474][0475]#如所指示，序列的上排是抗hcd20ab1的vl的氨基酸序列，并且序列的下排是奥比妥珠单抗的vl的氨基酸序列。符号表示如表11所示。[0476]由于vhcdr对抗原结合通常比vlcdr更重要，所以我们试图通过用在奥比妥珠单抗中的这些位点处存在的氨基酸或其他氨基酸置换与在抗hcd20ab1的vhcdr中的与奥比妥珠单抗的氨基酸不同的一些氨基酸残基(在表11中以粗体字型指示)来提高抗hcd20ab1的杀伤活性。[0477]下面表13所示的23种不同的改变和改变的组合是通过使用quikchangeii定点诱变试剂盒(agilent，目录号200524)定点诱变编码抗hcd20ab1vh的dna在抗hcd20ab1vh的氨基酸序列中进行的。在24孔微量滴定板中将编码如表13中所述改变的抗hcd20ab1lc和抗hcd20ab1hc之一的质粒dna瞬时共转染到expi293tm细胞中。转染后五天收获上清液，并且将其直接用于实施例2中所述的结合和杀伤测定。[0478]表13：在抗hcd20ab1vh中进行的改变[0479][0480][0481]运行实施例2中所述的facs分析以评估这23种变体与raji细胞的结合。变体#3、#7、#8表现出显著结合，然而其他变体不与raji细胞上的cd20结合。数据未显示。直接细胞杀伤测定(如实施例2中所述的进行)表明，当存在交联抗体(即，山羊抗人fc多克隆抗体)时，变体#3、#7、#8可以杀伤raji细胞。数据未显示。[0482]由于此测定中所使用的粗制细胞上清液含有不确定的抗体浓度和许多污染物，因此用编码变体#3、#7、#8的dna进行了较大规模(30ml)的瞬时转染。在五天后收获来自所得转染子的细胞上清液，并且通过标准蛋白a亲和柱纯化每个上清液中的抗体。纯化的变体抗体#3、#7、#8分别被命名为抗hcd20-ab1-t6、抗hcd20-ab1-t7、抗hcd20-ab1-t8。此外，抗hcd20ab1vh的具有改变n33q的另一种变体同时并且以相同的方式制备。该纯化的抗体被命名为抗hcd20-ab1-t5。这一选择是基于这样一个事实，即vh的n33参与许多抗体的抗原结合。因此，我们猜测n33可能对于抗hcd20ab1的功能很重要。我们假设在此位点切换到类似但稍大的氨基酸可能会改善抗原结合和/或与抗原结合相关的特性(诸如细胞杀伤)。此外，还以相同的方式制备含有选自a50r、n54e和s58d的两个或三个改变的变体抗hcd20ab1抗体。下面表14列出了所有这些变体及其中的改变的名称。[0483]表14：另外的抗hcd20ab1变体vh[0484][0485][0486]表14中列出的抗hcd20ab1变体的蛋白质浓度由在280nm下的光密度(od280)计算。在如实施例2中所述进行的结合测定中，测试这些变体连同阳性和阴性对照抗体，除了测试与三种不同细胞类型(raji、ramos和wsu-dlcl2细胞)的结合，而不仅仅是与raji细胞的结合。raji细胞表达非常高水平的cd20。ramos细胞表达较低但仍相对较高水平的cd20。wsu-dlcl2细胞表达非常低水平的cd20。结果如图3中所示。[0487]阳性对照抗体抗hcd20托西莫单抗和奥比妥珠单抗与这些肿瘤细胞结合，然而同种型对照抗体huigg1未显示任何结合。图3，小图a-d。在所测试的八种抗hcd20ab1变体中，只有抗hcd20-ab1-t7显示出与wsu-dlcl2细胞和raji细胞的结合跟奥比妥珠单抗与它们的结合相当，尽管这种结合水平低于对于另一种阳性对照抗体托西莫单抗所观察到的结合水平。分别为图3小图a和b。托西莫单抗也显示出比抗hcd20-ab1-t7更高的与ramos细胞的结合水平，并且奥比妥珠单抗未在ramos细胞中进行测试。图3小图c。在ramos细胞中以两种不同的浓度(即10μg/ml(与其他实验中一样)和1μg/ml)测试对照抗体。在两种不同浓度下观察到的差异很小。图3小图d。对于含有奥比妥珠单抗的样品，在较高浓度下观察到的结合水平稍低可能是由于此抗体在较高浓度下的细胞杀伤，因为此抗体在细胞杀伤方面非常有效。参见图4。[0488]如实施例2中所述在wsu-dlcl2、raji和ramos细胞中进行直接细胞杀伤测定，其中将山羊抗人igg多克隆抗体(即，交联抗体)添加到一些样品中以交联所结合的抗体。结果如图4中所示。阳性对照抗hcd20抗体奥比妥珠单抗在具有或不具有交联抗体的情况下在wsu-dlcl2、raji和ramos细胞中引起非常有效的杀伤，然而同种型对照huigg1几乎没有表现出(如果存在)超过在不存在测试抗体的情况下观察到的杀伤的任何直接细胞杀伤。嵌合igg1抗hcd20抗体ts(其包含托西莫单抗的可变结构域)在含有wsu-dlcl2细胞的样品中显示出强的杀伤，但在含有raji或ramos细胞的样品中则没有。比较图4小图a到图4小图b和c。在所测试的八个抗hcd20ab1变体中，在存在交联抗体的情况下在含有wsu-dlcl2细胞的样品中只有抗hcd20-ab1-t7显示出与对于托西莫单抗观察到的杀伤水平相似的杀伤水平。图4小图a。在不存在交联抗体的情况下，八个测试的抗hcd20ab1变体中没有一个在wsu-cldl2、ramos或raji细胞中显示出令人信服的直接细胞杀伤。[0489]总之，结果表明，与亲代嵌合igg1抗hcd20抗体ts相比，用在抗hcd20抗体奥比妥珠单抗中的一个或多个相同位点处存在的一个或多个氨基酸(或用其他氨基酸)置换抗hcd20ab1的vh中的一个或多个氨基酸基本上不会改善结合和/或细胞杀伤。因此，寻求一种不同的方法来增加人源化抗hcd20ab1igg1抗体的直接杀伤活性。[0490]实施例4：改变恒定结构域以增加抗原结合和直接细胞杀伤[0491]i型和ii型抗cd20抗体结合至cd20内相同的三个氨基酸基序。然而，ii型抗体主要与基序的c末端侧结合，并且i型抗体与基序的氨基末端侧结合得更多。marks.cragg,cd20antibodies:doingthetimewarp,2011,blood,118(2):219-220。cd20分子在细胞表面上形成四聚体。参见例如，niederfellner等人,epitopecharacterizationandcrystalstructureofga101provideinsightsintothemolecularbasisfortypei/iidistinctionofcd20antibodies,2011,blood118(2):358-367。这种微妙的差异与不同的功能特性相关。假设i型抗hcd20抗体利妥昔单抗(rituxumab)与处于不同四聚体中的两个cd20分子结合，并且ii型抗hcd20抗体奥比妥珠单抗与同一四聚体中的两个cd20分子结合。此假设与如下观察结果一致，即i型抗hcd20抗体(诸如利妥昔单抗)导致在细胞表面上形成cd20四聚体的筏，然而ii型抗hcd20抗体则不会。i型和ii型抗hcd20抗体的三级结构揭示cd20以相对于抗体的不同取向与i型和ii型抗hcd20抗体结合。此外，ii型抗hcd20抗体比i型抗hcd20抗体具有更宽的“肘角”，这基本上意味着ii型抗体的臂可以比i型抗体的臂扩展得更宽。参见例如，cragg，同上；niederfellner等人，同上。因此，我们假定铰链和相邻区域中的变化(其可能影响臂的柔性)也可能影响直接细胞杀伤，因为ii型抗cd20抗体奥比妥珠单抗显示出比i型抗cd20抗体利妥昔单抗更稳健的细胞杀伤。参见图4。[0492]人igg1抗体的fab臂比人igg4抗体的fab臂更具柔性(或具有更宽的“肘角”)。参见例如，vidarsson等人,iggsubclassesandallotypes:fromstructuretoeffectorfunctions,2014,frontimmunol第5卷，文章520。kai等人报告，交换在igg1、igg3和igg4抗体之间的ch1和上铰链区可以在体内和在体外增强对血小板生成素受体有特异性的两种激动剂抗体的活性。kai等人,switchingconstantdomainsenhancesagonistactivitiesofantibodiestoathrombopoietinreceptor,2008,naturebiotechnology26(2):209–211。因此，我们试图通过在这些区域中进行改变来改变抗hcd20ab1(人源化igg1抗体)的活性。具体地，(1)整个ch1结构域被置换，使得其类似于igg4ch1的结构域并且(2)改变了铰链使得其至少部分类似于人igg2、igg3或igg4抗体的铰链。[0493]将四种新的抗hcd20ab1变体hc的氨基酸序列(参见下表15)回译成dna序列。通过整合dna技术合成dna片段，并且将其通过如本文实施例1中所述的吉布森反应亚克隆到瞬时哺乳动物表达载体psb01中。将编码变体hc的质粒dna引入大肠埃希氏菌，并且来自选定菌落的质粒dna由genewiz公司测序。测序后，分别制备质粒dna，并且与编码抗hcd20ab1lc的载体组合用于共转染到expichotm细胞中以产生新的重组人igg抗体变体。[0494]表15：变体的铰链区和相邻氨基酸[0495][0496]通过蛋白a亲和柱纯化含有上文所述的四种抗hcd20ab1变体的这些收获的细胞heterologousbeta1,4-n-acetylglucosaminyltransferaseiiiandgolgialpha-mannosidaseii,2006,biotechnol.bioeng.93(5):851-861。在另一种策略中，fut8基因在表达抗体的细胞系中被有效灭活或消除。fut8是唯一的α1,6-岩藻糖基转移酶，其经由α1,6键将岩藻糖转移到n-聚糖上最内部的glcnac上进行核心岩藻糖基化。fut8无效细胞系表达完全无岩藻糖基化的重组igg1，其与岩藻糖基化的igg1相比可能具有显著增加的adcc活性。参见例如，yuan等人,bioprocessdevelopmentofastablefut8-/-‑chocelllinetoproducedefucosylatedanti-her2antibody,2019,bioprocessbiosyst.eng.42(8):1263-1271(doi:10.1007/s00449-019-02124-7)。在另一种策略中，可以用含有fut8化学抑制剂(诸如2-氟呋喃糖)的培养基在cho细胞中产生抗体，导致产生在其核心聚糖中具有低岩藻糖或没有岩藻糖的igg抗体。参见okeley等人,developmentoforallyactiveinhibitorsofproteinandcellularfucosylation,2013,proc.natl.acad.sci.110(14):5404-5409,doi:10.1073/pnas.1222263110)。[0502]如上文所陈述，第二种策略涉及在igg1抗体中进行氨基酸改变，以增加fcγriiia与抗体结合的亲和力，从而导致adcc活性增强。在执行该策略时，我们通过如实施例3中所述的定点诱变制备了四个抗hcd20ab1.2变体。相对于ab1.2的改变显示在下表16中。[0503]表16：ab1.2的hc变体[0504][0505]进行adcc测定以评估这些抗hcd20ab1.2变体的细胞毒性活性。培养、洗涤wsu-dlcl2细胞，并且将约2x106个细胞重悬于50ml管中的含1％fbs的培养基199(参见例如，thermofisher，目录号11150059)中。添加钙黄绿素-am(calcein-am)(sigmaaldrich，目录号c1359)至25nm的终浓度。将细胞在5％co2下于37℃孵育30分钟，用1xpbs洗涤两次以除去游离的钙黄绿素-am，并以1x105个细胞/ml重悬于含1％fbs的培养基199中。将在培养基199加1％fbs中在1:2稀释系列中的从1μg/ml滴定至0.0156μg/ml的抗cd20抗体或同种型对照igg1抗体以100μl/孔添加到96孔u底板(berkmandickson，目录号353077)中。将wsu-dlcl2细胞添加到孔中(以50μl/孔的5x103个wsu-dlcl2细胞)。将板在37℃下孵育20分钟。将人pbmc添加到孔中，效应细胞/靶细胞比例为50:1，即，每孔添加在50μl中的2.5x105个pbmc。为了在对照孔中测量自发荧光释放，添加50μl含1％fbs的培养基199而不是pbmc。每个孔中的最终体积为200μl。将板在5％co2下于37℃孵育4小时。从孔(150μl/孔)收获上清液，并且通过在envision2013multilabel读取仪中测量485-535nm处的荧光来测定钙黄绿素的释放。通过用20μl/孔的ca-630洗涤剂(sigmaaldrich，目录号56741)裂解四个孔的钙黄绿素标记的靶细胞来确定代表100％裂解的值。特异性裂解百分比定义如下：(样品荧光)-(自发裂解荧光)/(100％裂解-自发裂解荧光)*100。转化特异性裂解百分比值，并且使用graphpadprism5.0软件(graphpadsoftware,sandiego,ca)进行s形剂量响应曲线拟合。[0506]如图7小图a中所示，同种型对照huigg1抗体在最高浓度(10nm)下显示约30％裂解。抗hcd20抗体利妥昔单抗以0.261nm的ec50显示出剂量依赖性响应，其中在10nm的最高剂量下最大特异性裂解为约50％。抗hcd20ab1.2以0.1416nm的ec50显示出剂量依赖性响应。ab1.2.1、ab1.2.2、ab1.2.3和ab1.2.4全部都显示出比ab1.2更高的效力，分别具有0.01526nm、0.01134nm、0.02512nm和0.02418nm的ec50。这些人源化抗cd20抗体显示出》80％的最大特异性裂解。抗hcd20ab1.2.2是最有效力的抗体。[0507]补体依赖性细胞毒性(cdc)是igg1抗cd20抗体的另一种重要的作用机制。例如，据报道利妥昔单抗具有很强的cdc活性。manches等人,invitromechanismsofactionofrituximabonprimarynon-hodgkinlymphomas,2003,blood101:949-954。在体外cdc测定中在存在兔血清(含有高水平的补体)的情况下测试了四个抗hcd20ab1.2变体，以评估其cdc活性。将含有1％fbs的rpmi1640培养基中的wsu-dlcl2肿瘤细胞在50μl中以5x104个细胞/孔接种到u形底96孔微量滴定板中。然后添加兔血清(50μl/孔)和不同浓度的抗cd20或对照抗体(50μl/孔)。兔补体的终浓度为3％。每孔的总体积为150μl。将微量滴定板在5％co2下于37℃孵育24小时。孵育后，将pbs中的碘化丙啶(pi)(50μl/孔)添加至5μg/ml的终浓度，以检测死细胞。使用facscaliburtm流式细胞仪(bdbiosciences)进行facs。用软件分析数据。细胞毒性活性表示为百分比，其为pi阳性细胞的数量除以细胞总数(死亡细胞百分比)。[0508]正如预期的那样，igg1抗hcd20抗体利妥昔单抗显示出很强的cdc活性(ec50＝0.30nm)，然而igg1抗hcd20抗体奥比妥珠单抗的cdc活性要弱得多(ec50＝8.90nm)。图7小图b。在最高浓度(30nm)下单独的热灭活的兔血清仅显示出约10％的死细胞，并且同种型对照huigg1并未引起显著高于此水平的细胞杀伤。抗hcd20ab1.2显示出比奥比妥珠单抗稍强的cdc活性(ec50＝4.85nm)，而ab1.2.2显示出与奥比妥珠单抗相当的cdc活性(ec50＝7.33nm)。然而，其他变体在该测定中具有大大降低的cdc活性(ab1.2.3；ec50＝54.32nm)或基本上没有(ab1.2.1和ab1.2.4)cdc活性。图7小图b。[0509]实施例6：小鼠抗人cd37抗体克隆g28.1的人源化和产生[0510]一种被称为g28.1的小鼠抗人cd37杂交瘤克隆描述于1991年。braslawsky等人,adriamycin(hydrazone)-antibodyconjugatesrequireinternalizationandintracellularacidhydrolysisforantitumoractivity,1991,cancerimmunolimmunother.33(6):367-374。我们将此杂交瘤产生的抗体在下文中称为g28.1。g28.1的工程化嵌合形式(其包括来自g28.1抗体的鼠可变区和工程化的人恒定区)，在存在交联抗体的情况下显示出诱导对慢性淋巴细胞性白血病(cll)细胞的强烈直接杀伤，但在没有交联抗体的情况下则不会。zhao等人,targetingcd37-positivelymphoidmalignancieswithanovelengineeredsmallmodularimmunopharmaceutical,2007,blood.110(7):2569-2577。由于heider等人(heider等人,anovelfc-engineeredmonoclonalantibodytocd37withenhancedadccandhighproapoptoticactivityfortreatmentofb-cellmalignancies,2011,blood118(15):4159–4168)发现包括g28.1可变区的嵌合抗体不结合至来自除智人(homosapiens)以外的任何测试物种的cd37，这些研究人员制备了一种替代抗体(即，与食蟹猴cd37结合的不同抗体)用于毒性研究(其是人类治疗剂开发的重要步骤)。heider等人，同上。下面我们描述了g28.1的人源化形式的构建，所述人源化形式no:59和58所示。[0515]编码人源化抗hcd37ab1igg1抗体的lc和hc的质粒dna从含有它们的培养细菌中提取出来，并且使用midi-prep试剂盒(qiagenn.v.,thenetherlands)进行纯化。在125ml摇瓶中使用2000(thermofisherscientific,waltham,ma,usa)用质粒dna转染哺乳动物expi293tm细胞(30ml体积)。将细胞在37℃下以150rpm连续摇动5天。通过在4℃下以1500rpm旋转细胞20分钟来收获上清液，并且使用标准蛋白a柱纯化上清液中的抗体。测试所纯化的抗体以评估其结合和杀伤活性，如下文所述。[0516]实施例7：用基于细胞的体外测定评估抗hcd37抗体ab1[0517]进行facs分析以测试抗hcd37ab1与表达cd20和cd37两者的细胞结合的程度。在实施例2中描述了实验过程。用于所有样品的抗体浓度为10μg/ml。使用了wsu-dlcl2、raji和ramos细胞，并且这些结果分别显示在图9小图a、b和c中。与同种型对照huigg1抗体相比，抗hcd20抗体奥比妥珠单抗与wsu-dlcl2、raji和ramos细胞牢固结合。与g28.1的嵌合形式相比，对照人源化抗hcd37抗体(命名为h37，其来源于g28.1)显示出稍微降低的结合。抗hcd37ab1在所有三种细胞系中显示出相对于这两种抗hcd37抗体的结合降低。[0518]进行如上文实施例2中所述进行的直接细胞杀伤测定和“直接细胞杀伤”的定义是为了评估在存在或不存在交联抗体的情况下抗hcd37ab1的直接细胞杀伤活性。所有样品中的测试抗体浓度为10μg/ml。使用wsu-dlcl2和raji细胞进行测定，并且这些结果分别显示在图10小图a和b中。与同种型对照huigg1抗体相比，奥比妥珠单抗(igg1抗hcd20抗体)显示出wsu-dlcl2和raji细胞两者的稳健细胞杀伤，而不管交联抗体存在与否。g28.1的嵌合形式(在图10中标记为g28.1)在存在交联抗体的情况下表现出比不存在交联抗体的情况稍多的细胞杀伤。在不存在交联抗体的情况下，h37抗体没有杀死比同种型对照抗体(huigg1)更多的wsu-dlcl2细胞。然而，在存在交联抗体的情况下，h37以与嵌合g28.1抗体相当的水平杀伤wsu-dlcl2细胞。图10小图a。h37抗体在不存在交联抗体的情况下表现出低水平的对raji细胞的细胞杀伤，而在存在交联抗体的情况下表现出稍多的杀伤。然而，这些水平远远低于嵌合g28.1抗体的水平。图10小图b。在不存在或存在交联抗体的情况下，抗hcd37ab1在wsu-dlcl2和raji细胞两者中均显示出与嵌合g28.1抗体所显示的细胞杀伤相当的细胞杀伤。因此，抗hcd37ab1具有与本测定中的嵌合g28.1相当的杀伤活性。[0519]在ramos细胞中进行了类似的实验，除了在有或没有交联的情况下在添加抗体后24小时和72小时均评估细胞杀伤(即母细胞数量)。结果显示在图11中。在24小时，嵌合g28.1抗体和抗hcd37ab1在有或没有交联抗体的情况下显示出强的细胞杀伤，但是交联抗体确实增强了作用。奥比妥珠单抗在没有交联抗体的情况下显示出一些细胞杀伤，而h37抗体在没有交联抗体的情况下显示出基本没有或没有细胞杀伤。交联抗体大大增加了这两种抗体的直接细胞杀伤，但是它们仍然不如嵌合g28.1和抗hcd37ab1有效。图11小图a。[0520]在72小时，一些样品的结果与在24小时观察到的结果相似，而其他样品则没有。含有h37抗体的样品的结果与24小时观察到的结果相似。然而，奥比妥珠单抗、嵌合g28.1和抗hcd37ab1全部都显示出几乎没有(如果存在)依赖交联抗体的存在的非常稳健的细胞杀伤。实际上，在存在交联抗体的情况下测试的含奥比妥珠单抗的样品显示出比在不存在交联抗体的情况下测试的样品更少的细胞杀伤，该结果可能是由于奥比妥珠单抗非常快的杀t53s)；抗hcd37ab1.d1(vh-m34v+vl-l54i)；抗hcd37ab1.f3(vh-m34l+vl-s92t)；抗hcd37ab1.g3(vh-m34l+vl-d93e)；抗hcd37ab1.f7(vh-k64q+vl-s92t)；抗hcd37ab1.g7(vh-k64q+vl-d93e)；抗hcd37ab1.h7(vh-k64q+vl-n94d)；抗hcd37ab1.c11(vh-m99l+vl-t52s)；和抗hcd37ab1.d11(vh-m99l+vl-l54i)。[0528]来自该主要筛选的结果表明，一些取代对细胞杀伤活性几乎没有或没有影响。然而，有可能此类取代可能会影响与食蟹猴cd37的结合，因为它们存在于cdr中。制备这些取代的组合是为了寻找具有细胞杀伤活性以及与食蟹猴cd37结合的能力的其他组合。如实施例3中所解释，通过定点诱变总共制备了22种新变体。这些变体中的改变显示在下表17中。[0529]表18：抗hcd37ab变体中的改变[0530][0531][0532]通过在24孔板中将编码它们的hc和lc质粒dna共转染到expi293tm细胞中，制备了上述22种抗hcd37ab1变体。通过用编码这些抗体的dna转染expi293tm细胞在同一板中制备了嵌合g28.1抗体和同种型对照huigg1。转染后五天收获细胞上清液，在1xpbsph7.4中以1:2或1:6稀释，并且在wsu-dlcl2和ramos细胞中测试杀伤活性。三种变体n12、n18和n19始终显示出对两种细胞类型的强烈直接杀伤。数据未显示。然而，由于上清液中抗体的精确量未知，因此这些数据无法与其他数据直接比较。[0533]为了准确比较与食蟹猴cd37抗原的杀伤活性和跨物种结合，通过以30ml规模共转染expi293tm细胞制备了13种抗hcd37ab1变体，即，抗hcd37ab1.a1、抗hcd37ab1.d1、抗hcd37ab1.f3、抗hcd37ab1.g3、抗hcd37ab1.f7、抗hcd37ab1.g7、抗hcd37ab1.h7、抗hcd37ab1.c11、抗hcd37ab1.d11、抗hcd37ab1.n12、抗hcd37ab1.n18和抗hcd37ab1.n19。通过蛋白a亲和柱纯化抗体，并且定量每种纯化抗体的浓度。将抗体用于结合食蟹猴cd37的facs测定和如下所述的细胞杀伤测定。[0534]将食蟹猴pbmc(批次编号：nhp-pb170621，灵长类动物id编号：g511，购买自allcells(alameda,ca))以100,000个细胞/孔等分到96孔圆底微量滴定板中。此后，将pbmc旋转，用1xpbs洗涤一次，并且在facs阻断缓冲液中阻断(参见上文的实施例2)。然后将pbmc再次旋转并且重悬于每孔50μl的1xpbs中。添加上文所列出的抗hcd37ab1变体(50μl/孔，抗体浓度为在1xpbs中100μg/ml)。将板在4℃下摇动1小时，随后以1500rpm离心15分钟。液体从孔中轻轻弹出。小鼠抗人cd20apc-缀合抗体(克隆2h7，来自bdbiosciences，目录号bdb560900)和小鼠抗人iggfc特异性fitc-缀合抗体(来自jacksonimmunoresearch，目录号209-095-098)两者均以10μg/ml添加到每个孔中的100μl的1xpbs中。将板在室温下伴随摇动孵育30分钟，并且用200μl/孔的1xpbs洗涤一次。通过在1xpbs中添加200μl/孔的2％多聚甲醛，最终将pbmc固定用于facs分析。将cd20+细胞门控出用于仅在pbmc内的此细胞亚群中检查cd37抗原结合。[0535]图12显示了来自抗hcd37ab1和五种变体的数据，其显示了与食蟹猴cd37结合的最大改善。所测试的其他变体显示出几乎没有或没有改善。如图12小图a和b分别所示，食蟹猴pbmc中67％的cd20+细胞被抗hcd37ab1强烈染色，并且91.7％的cd20+细胞被抗hcd37ab1.a1强烈染色。这些数据表明，当与抗hcd37ab1相比时，抗hcd37ab1.a1与食蟹猴cd37的结合有所改善。与抗hcd37ab1相比，其他变体(包括抗hcd37ab1.d11、抗hcd37ab1.h7、抗hcd37ab1.n12和抗hcd37ab1.n19)在与食蟹猴cd37的结合方面显示出较小的改善(尽管在一些情况下仍然十分明显)。[0536]使用zenontmallophycocyanin人igg标记试剂盒(thermofisher，目录号z25451)根据制造商的方案单独用荧光团别藻蓝蛋白(apc)标记上文所鉴定的最好的五种变体(即，抗hcd37ab1.a1、抗hcd37ab1.d11、抗hcd37ab1.h7、抗hcd37ab1.n12和抗hcd37ab1.n19)以及同种型对照igg1。将来自食蟹猴和健康人供体的经分离的pbmc在室温下以1500rpm离心3分钟，并且重悬于facs阻断缓冲液(facs缓冲液+10％ngs+2％nrabs)中。将这些洗涤过的pbmc放入96孔圆底微量滴定板的孔中(1x106个细胞/孔)。将板在室温下以150rpm摇动30分钟，随后用facs缓冲液洗涤。然后将细胞沉淀并用含有10μg/mlfitc缀合的抗cd19抗体和apc缀合的抗cd37igg1变体抗体或同种型huigg1对照抗体的facs阻断缓冲液(100μl/孔)染色。抗体浓度开始为80μg/ml(对于食蟹猴pbmc)或10μg/ml(对于人pbmc)，并且以1:2稀释系列进一步稀释。将板在4℃下以150rpm摇动30分钟并且用facs缓冲液洗涤两次。将pbmc沉淀，重悬于pbs加2％fbs(200μl/孔)中，并且如本文实施例2中所述进行facs。将cd19+b细胞门控出，并且然后分析其cd37结合。[0537]变体抗hcd37ab1.a1抗体在前五种抗hcd37ab1变体中显示出最高的跨物种食蟹猴cd37结合。在图13中仅显示了抗hcd37ab1.a1和同种型对照的数据。抗hcd37ab1.a1与人b细胞上的人cd37以4.05nm的ec50结合，并且与食蟹猴b细胞以254.1nm的ec50结合，其效力比结合人b细胞低62.7倍。同种型huigg1对照抗体未显示出与人或食蟹猴b细胞的任何结合。这些结果表明，与不结合至食蟹猴cd37的原始小鼠g28.1抗体相比，工程化抗hcd37ab1.a1获得了较弱但有所改善的食蟹猴cd37结合。[0538]在不存在交联抗体的情况下测试了抗hcd37变体抗hcd37ab1.a1、抗hcd37ab1.d11、抗hcd37ab1.h7、抗hcd37ab1.n12和抗hcd37ab1.n19以及同种型对照huigg1对wsu-dlcl2细胞(图14小图a)和ramos细胞(图14小图b)的直接细胞杀伤。在实施例2中描述了实验程序。在下表19中列出了每种变体的ec50值。[0539]表19：变体进行细胞杀伤的ec50[0540][0541]在这些变体中，抗hcd37ab1.a1显示出与食蟹猴cd37的最高跨物种结合以及对wsu-dlcl2和ramos细胞的最高杀伤效力。因此，其被选择为用于进一步研究的最佳候选者。变体抗hcd37ab1.n12在跨物种结合和杀伤效力方面是第二好的，并因此被选择为备用分子。抗-cd37ab1.a1vl的氨基酸序列和编码它的核苷酸序列分别如seqidno:61和60所示。抗cd37ab1.a1vh的氨基酸序列和编码它的核苷酸序列分别如seqidno:65和64所示。抗cd37ab1.n12vl的氨基酸序列和编码它的核苷酸序列分别如seqidno:73和72所示。抗cd37ab1.n12vh的氨基酸序列和编码它的核苷酸序列分别如seqidno:77和76所示。[0542]实施例9：测试抗hcd20ab1与食蟹猴cd20的结合[0543]i型抗hcd20抗体利妥昔单抗和ii型抗hcd20抗体ga101(奥比妥珠单抗)结合cd20上的重叠表位，相对于利妥昔单抗表位，ga101表位稍微向c末端移动。niederfellner等人，同上。两个表位都包括人cd20的170-172残基，但是ga101表位比利妥昔单抗表位从这些氨基酸的下游延伸得更远。托西莫单抗结合至与被ga101结合的表位相似的表位。klein等人,epitopeinteractionsofmonoclonalantibodiestargetingcd20andtheirrelationshiptofunctionalproperties,2013,mabs5:22–33。如下面的比对所示(表20)，cd20的环2中的170ala至188ser的序列在人和食蟹猴cd20中是相同的。因此，抗hcd20抗体托西莫单抗及其衍生物可能被假定为与食蟹猴cd20结合。[0544]表20：食蟹猴与人cd20氨基酸序列的比对*[0545][0546]*食蟹猴(食蟹猕猴)cd20氨基酸序列显示在上面，并且智人cd20氨基酸序列显示在其下方。除半胱氨酸残基之外，环i和ii中的氨基酸以加下划线的粗体字显示。在环ii中形成链间二硫键的半胱氨酸残基以下划线斜体字显示。[0547]通过如实施例8中所述的facs分析来自人和食蟹猴的pbmc，以测试抗hcd20ab1.2.2在50μg/ml和10μg/ml下是否可以结合至cd19+b细胞。在50μg/ml下的抗hcd20ab1.2.2显示在18.7％的人cd19+b细胞中具有稳健的结合(mfi＝817；图15小图a中的虚线)和在5.53％的食蟹猴cd19+b细胞中具有稳健的结合(mfi＝1285；图15小图a中的实线)。在10μg/ml下，抗hcd20ab1.2.2显示出在18.9％的人cd19+b细胞中具有稳健的结合(mfi＝768；图15小图b中的虚线)和在3.62％的食蟹猴cd19+b细胞中具有稳健的结合(mfi＝1142；图15小图b)。这些结果可能与以下事实相关：食蟹猴血液中的b细胞丰度比人血液中的小得多。这些结果表明，抗hcd20ab1.2.2可以结合至食蟹猴cd20，尽管不如它结合至人cd20那么强烈。[0548]实施例10：针对抗hcd20ab1.2.2和抗hcd37ab1.a1igg抗体的细胞结合和adcc测定[0549]由于cd20和cd37在b细胞非霍奇金淋巴瘤(b-nhl)和慢性淋巴细胞性白血病(cll)中的大多数恶性b细胞上共表达(参见例如，deckertj.等人,anovelanti-cd37antibody-drugconjugatewithmultipleanti-tumormechanismsforthetreatmentofb-cellmalignancies,2013,blood122:3500-3510)，所以可能希望靶向cd20和cd37两者来治疗患有b-nhl或cll或至少部分由b细胞介导的其他疾病的患者。这种组合疗法可能会提高治疗功效和/或减少耐药性的发展。在单个宿主细胞系中制备两种不同抗体的技术(参见美国申请公开号2019/0248899)可以降低含有两种不同抗体的治疗剂的成本。作为测试抗cd20和抗cd37抗体的组合对疾病细胞的影响的准备，测试了单个抗体与raji细胞的结合以及在各种其他测定中的活性。[0550]具体地，使用实施例2中所述的方法测试上文所述工程化抗hcd20ab1.2.2与奥比妥珠单抗利妥昔单抗和同种型对照huigg1与raji细胞的结合。同种型对照huigg1在最高剂量下未显示出结合，然而利妥昔单抗以ec50＝18.21nm显示出稳健的结合(在最高剂量下geomfi≈250)。奥比妥珠单抗还以ec50＝9.846nm显示出强结合(在最高剂量下geomfi≈150)。工程化抗hcd20ab1.2.2以ec50＝26.27nm显示出强结合(在最高剂量下geomfi≈200)，表明该抗体与细胞表面上的cd20分子结合良好。图16小图a。[0551]在进一步的实验中，如本文实施例5中所述，在raji细胞中进行的adcc测定中测试了抗hcd20ab1.2.2和抗hcd37ab1.a1的活性。如图16小图b中所示，同种型对照huigg1不介导adcc，而抗hcd20ab1.2.2具有强的活性(ec50＝0.008195nm)，可能是因为用于增强adcc的s239d和s298a的取代被掺入该抗体中。抗hcd37ab1.a1中度活性(ec50＝6.045nm)。[0552]实施例11：抗hcd20和抗hcd37mabpair混合物的产生[0553]进行以下实验以确定在已将编码从抗hcd20ab1.2.2和抗hcd37ab1.a1抗体来源的非同源hc/lc对的dna引入其中的转染细胞中容易形成哪些非同源hc/lc对。使用midi-prep试剂盒(qiagenn.v.,thenetherlands)单独纯化编码抗hcd20ab1.2.2和抗hcd37ab1.a1的hc和lc的质粒dna。将所得的dna在水中稀释并在eppendorf中混合。将一组4个管的混合dna瞬时转染到expi293tm细胞中以评估是否会发生非同源hc/lc配对。管1含有编码抗hcd20ab1.2.2抗体hc(hc1)及其同源lc(lc1)的dna。管2含有编码由hc1和抗hcd37ab1.a1lc(lc2)组成的非同源hc/lc对的dna。管3含有编码由lc1和抗hcd37ab1.a1hc(hc2)组成的非同源hc/lc对的dna。管4含有编码hc2和lc2的dna。并行转染含有编码抗her2曲妥珠单抗hc和lc的dna的另外的管5以评估转染效率。[0554]更详细地说，在24孔深孔块中使用2000用编码测试抗体的质粒dna一式两份转染expi293tm细胞。将细胞在37℃下以150rpm连续摇动5天。通过以1500rpm旋转细胞20分钟来收获上清液。对于所有样品(所有样品都没有被还原)，将5微升(μl)上清液和5μl的2xlaemmli样品缓冲液(65.8mmtris-hcl(ph6.8)、2.1％月桂基硫酸钠(sds)、26.3％(w/v)甘油、0.01％溴酚蓝)在70℃下加热10分钟。将处理过的样品加载到4-15％criteriontmtgxstain-freetmprecastsds-page凝胶(bio-radlaboratories公司，hercules,ca，目录号567-8085)的孔中。电泳在200v下运行45分钟。用turbotm转移系统(bio-radlaboratories公司)将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并且用0.05％20(pbst)在1xpbs中的3％脱脂乳中阻断。洗涤硝酸纤维素膜，并且用辣根过氧化物酶缀合(hrp缀合)的多克隆山羊抗人igg(fc特异性)(sigma-aldrichcorporation,st.louis,mo，目录号a0170)检测抗体。用来自bio-radlaboratories公司的chemidoctmxrs+成像仪可视化图像。[0555]结果显示在图17中。标记为1、2、3、4和5的样品是标记为1'、2'、3'、4'和5'的样品的重复。抗hcd20ab1.2.2(泳道1和1')和抗hcd37ab1.a1(泳道4和4')抗体表达良好，尽管表达略低于抗her2抗体曲妥珠单抗(泳道5和5')的表达。由抗hcd20ab1.2.2(泳道1和1')的同源hc1/lc1对产生的抗体以与由hc1(来自抗hcd20ab1.2.2)和lc2(来自抗hcd37ab1.a1)的非同源对产生的抗体大致相同的水平表达。图17，将泳道1和1'与泳道2和2'进行比较。这表明抗hcd20ab1.2.2的hc1可以与其自身的lc1或来自抗hcd37ab1.a1的非同源lc2同样好地表达。有趣的是，lc1(来自抗hcd20ab1.2.2)和来自抗hcd37ab1.a1的hc2的非同源配对以比同源hc2/lc2对低得多的水平表达。图17，将泳道3和3'与泳道4和4'进行比较。这些数据表明，抗hcd37ab1.a1的hc2喜欢表达其自身的lc2胜过非同源lc1。因此，在工程化这些特定抗体以便在同一宿主细胞中表达时仅表达同源hc/lc对中要解决的主要问题是来自抗hcd20ab1.2.2的hc1和来自抗hcd37ab1.a1的lc2的错误配对。[0556]在以下实验中，改变抗体以增强同源hc/lc对，削弱非同源hc/lc对，并且削弱hc/hc异二聚体。如美国申请公开号2019/0248899(其通过引用并入本文)的实施例2和3中所述，如下制备抗hcd20ab1.2.2和抗hcd37ab1.a1(加上抗hcd37ab1.n12作为备用)mabpair抗体的改变形式。通过使用由idt合成的两个将适当的突变引入编码抗hcd20ab1.2.2的hc的dna中，随后进行吉布森反应以将两个gblocks组装成编码全长hc的dna来将取代d399r和k409e引入抗hcd20ab1.2.2的ch3区中。抗hcd20ab1.2.2hc的这种改变形式被称为抗hcd20ab1.2.2.1hc。seqidno:44和43分别显示抗hcd20ab1.2.2.1hc的氨基酸序列和编码它的核酸序列。通过上文所述的用于改变抗hcd20ab1.2.2hc的方法将适当的突变引入编码这些hc的dna中，将取代k147d、f170c、v173c、c220g和k409r引入抗hcd37ab1.a1和抗hcd37ab1.n12的hc中。这些hc被称为抗hcd37ab1.a1.1hc和抗hcd37ab1.n12.1hc。seqidno:71和70分别显示抗hcd37ab1.a1.1hc的氨基酸序列和编码它的核酸序列。seqidno:83和82分别显示抗hcd37ab1.n12.1hc的氨基酸序列和编码它的核酸序列。通过上文所述的方法将取代s131k、q160c、s162c、c214s引入抗hcd37ab1.a1和抗hcd37ab1.n12的lc中。这些变体以抗hcd37ab1.a1.1lc和抗hcd37ab1.n12.1lc命名。seqidno:69和68分别显示抗hcd37ab1.a1.1lc的氨基酸序列和编码它的核酸序列。seqidno:81和80分别显示抗hcd37ab1.n12.1lc的氨基酸序列和编码它的核酸序列。[0557]将编码由一种抗体或两种不同抗体组成的hc和lc的质粒dna放入一系列eppendorf测试管中。管含有编码以下抗体的dna：(1)曲妥珠单抗(用作监测转染效率的对照的一种抗her2抗体)；(2)抗hcd20ab1.2.2.1；(3)抗hcd37ab1.a1.1；(4)抗hcd37ab1.n12.1；(5)抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1；和(6)抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.n12.1。将混合质粒dna用于转染30mlexpichotm细胞。将含有转染的expichotm细胞的烧瓶在10％co2下于37℃摇动12天。从培养上清液中收获抗体，并且将其通过蛋白a亲和色谱法纯化。[0558]实施例12：含有抗hcd20和抗hcd37抗体的mabpair的表征[0559]为了大致确定刚刚上文所述的抗体制剂的大小，将纯化的抗体制剂在sds-page凝胶上进行电泳。在不存在(对于非还原样品)或存在(对于还原样品)100mm二硫苏糖醇(dtt)的情况下含有10μl2xlaemmli样品缓冲液(65.8mmtris-hcl(ph6.8)、2.1％月桂基硫酸钠(sds)、26.3％(w/v)甘油、0.01％溴酚蓝)的20μl总体积中，每个样品含有2μg的每种抗体。将还原的样品在70℃下加热10分钟。然后将样品加载到4-15％criteriontmtgxstain-freetmprecastsds-page凝胶(bio-radlaboratories公司，hercules,ca，目录号567-8085)上。将电泳在200v下运行45分钟。在光激活后，用来自bio-radlaboratories公司的chemidoctmxrs+成像仪可视化图像。[0560]如图18a所示，单克隆抗体曲妥珠单抗(泳道1)、抗hcd20ab1.2.2.1(泳道2)和抗hcd37igg1ab1.a1.1(泳道3)在非还原条件下以大约150kda迁移。当使用编码来自抗hcd20ab1.2.2.1的hc1和lc1以及来自抗hcd37ab1.a1.1的hc2和lc2的质粒dna转染细胞时，在sds-page凝胶上观察到两条大约150kda(泳道4)的条带。下部条带与抗-hcd20ab1.2.2.1在同一位置迁移，并且上部条带与抗hcd37ab1.a1.1在同一位置迁移，表明通过共转染四种不同的质粒dna仅从哺乳动物细胞中产生了两种不同的抗体(即，抗hcd20和抗hcd37抗体(mabpair))。在还原条件下(图18小图b)，对于曲妥珠单抗(泳道1')、抗hcd20ab1.2.2.1(泳道2')和抗hcd37ab1.a1.1(泳道3')，观察到大小为约50kda的hc条带和大小为25kda的lc条带，然而对于抗hcd20和抗hcd37mabpair(泳道4')，观察到两个hc条带和两个lc条带。图18小图b的泳道4'中的下部hc条带和上部lc条带与泳道2'中单独的抗hcd20ab1.2.2.1的那些类似地迁移，并且上部hc条带和下部lc条带(泳道4')与泳道3'中单独的抗hcd37ab1.a1.1的那些类似地迁移。这些结果表明，在含有编码抗hcd37ab1.a1.1和抗hcd20ab1.2.2.1的dna的宿主细胞中产生了含有不同hc和lc的至少两种不同的igg抗体。此外，这些数据表明仅在这些宿主细胞中产生了两种不同的抗体，因为仅观察到两个hc和两个lc条带。对从含有编码抗hcd20igg1ab1.2.2.1和抗hcd37igg1ab1.n12.1的dna的宿主细胞中回收的抗体进行了类似的观察。参见图18小图c和d。[0561]为了更准确地确定这些抗体的大小，对图18中所分析的抗体进行低ph阳离子交换(cex)分析。此技术在美国申请公开号2019/0248899第92页第9-30行和图17中进行了描述，所述申请通过引用并入本文。chen等人,theuseofnativecation-exchangechromatographytostudyaggregationandseparationofmonoclonalantibodies,2010,proteinscience,19:1191-1204(其整体并入本文)也描述了这种方法。简而言之，使用了前面有一个50mm保护柱(propactmwcx-10g)的thermopropactmwcx-10弱cex柱(4x250mm)，使用watersalliance2695高效液相色谱(hplc)系统。色谱在30分钟内以从100％缓冲液a(20mm乙酸钠ph5.2)到100％缓冲液b(20mm乙酸钠和250mm氯化钠ph5.2)的线性梯度运行。用高盐(1m氯化钠)洗涤柱，并且重新平衡至缓冲液a的起始条件。通过在214nm处的吸光度在柱流出中检测到抗体。使用empowertm软件(waterscorp.,milford,ma,usa)来确定检测到的峰的相对量。低phcex可以区分不同的全长抗体种类，并且可以用于定量混合物中特定抗体种类的相对量。如图19小图a和b中所示，由含有编码抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1或抗hcd37ab1.n12.1的dna的宿主细胞所产生的抗体的低phcex分析显示出两个良好解析的主要条带。通过平行运行加载有单个抗体的柱来确定两个峰中每一个峰的抗体身份。数据未显示。通过计算曲线下面积(auc)，确定出含有编码抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1的dna的宿主细胞产生了43％抗hcd20ab1.2.2.1和57％抗hcd37ab1.a1.1，并且含有编码抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.n12.1的dna的宿主细胞产生了49％抗hcd20ab1.2.2.1和51％抗hcd37ab1.n12.1。图19小图a和b。因此，这些实验表明，含有编码抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1或抗hcd37ab1.n12.1的dna的宿主细胞产生了两种不同的主要抗体种类。[0562]进行质谱以确定由含有编码抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1或抗hcd37ab1.n12.1的dna的宿主细胞所产生的抗体是否具有同源hc/lc对和同二聚体hc/hc配对。thompson等人,complexmixturesofantibodiesgeneratedfromasingleproductionqualitativelyandquantitativelyevaluatedbynativeorbitrapmassspectrometry,2014,mabs6(1):197-203(其整体并入本文)以及在美国申请公开号2019/0248899第92页第31行至第94页第10行和第页以及图18中(美国申请公开号2019/0248899的所述部分通过引用并入本文)描述了所使用的质谱方法。在通过质谱进行分析之前，将抗体制剂用肽n-糖苷酶f(png酶f)进行脱糖基化。可能潜在地在含有编码抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1或抗hcd37ab1.n12.1的dna的细胞中形成的所有脱糖基化抗体种类的理论大小显示在下表21中。[0563]表21：脱糖基化抗体的理论大小[0564][0565]图20小图a显示了由含有编码抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1的dna的宿主细胞产生的脱糖基化抗体的数据。如所指示，检测到的主要峰的实际质量为145474.68道尔顿(da)和144421.81da，其分别为抗hcd20ab1.2.2.1的理论质量(145473.36)的仅9个百万分之份数(ppm)以及抗hcd37ab1.a1.1的理论质量(144420.18)的仅11ppm。图20小图b显示了由含有编码抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.n12.1的dna的宿主细胞产生的脱糖基化抗体的数据。检测到的实际质量为145476.18da和144400.26da，其分别为抗hcd20ab1.2.2.1的理论大小(145473.36)的仅19ppm以及抗hcd37ab1.n12.1的理论大小(144394.18)的42ppm。由于来自理论大小的所有大小变化均小于100ppm，因此这些实验确定的质量表明，观察到的主峰仅由具有同源hc/lc对和同二聚体hc/hc配对的抗体产生。因此，在这些制剂中抗体的唯一主要种类是抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1或抗hcd37ab1.n12.1。[0566]在图20的两个小图中的两个主峰之间，在图20小图a的145,075.35da处和在图20小图b的145,058.90da处观察到一个非常小的峰。这些峰非常接近包含lc2/hc1/hc2/lc2的错误配对抗体的预测质量(图20小图a中的145064.00da和图20小图b中的145023.92da)。因此，通过高效液相色谱-质谱法(hplc-ms)进一步分析了上文所述的抗cd20和抗cd37抗体混合物以鉴定该组分。[0567]为了进行此分析，从含有编码抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1或抗hcd37ab1.n12.1的dna的宿主细胞纯化的20μg抗体制剂在20μl的50mmtrisph7.5中与1μlpng酶f内肽酶(newenglandbiolabs)一起在37℃下孵育16小时。在用png酶f脱糖基化之后，通过在含有4m盐酸胍、50mmtrisph8.0和50mmdtt的缓冲液中在55℃下孵育30分钟而将一半的样品还原。使用配备有esi源并与agilent1200hplc耦合的agilent6224精确质量tof质谱仪对还原样品进行hplc-ms分析。以80℃的柱温和0.4μl/min的流速使用agilentpursuitdiphenyl柱(2.0×150mm，3μm)。流动相a由水和0.1％三氟乙酸(tfa)组成，并且流动相b由异丙醇(ipa):乙腈(acn):水(70:30:10)和0.9％tfa组成。流动相b最初保持在10％，然后在5分钟内升高到32％b，然后在35分钟内升高到42％。然后将溶剂改变为90％b并保持4分钟以清洁柱。最后，将溶剂恢复到10％b并保持4分钟以使柱重新平衡。ms仪器参数如下：干燥气体温度、干燥气体流量和雾化器分别被设定为300℃、12l/min和40psig。分别将毛细管、碎裂器(fragmentor)、截取锥1(skimmer1)和octrfvpp设定为4500v、250v、60v和750v。仪器在4ghz高分辨率下在100至3000的m/z范围内进行校准。使用agilentmasshunterqualitativeandbioconfirm软件分析来自hplc-ms的数据。[0568]图21小图a显示了柱的uv色谱图，其显示了四个分离良好的链。通过ms分析在抗cd37hc和lc峰之间的由箭头指示的区域，因为其高于基线。ms分析表明，此区域包含质量为48949.63da、49112.22da、49403.92da和49694.61da的多个种类，它们分别比主要抗cd37hc种类多了202.76da、365.35da、657.05da和947.74da。参见图21小图b和c。这四个峰的质量增加分别与用n-乙酰基-d-己糖胺(hexnac)、添加至n-乙酰基-d-己糖胺的己糖(hexhexnac)、添加至添加己糖的n-乙酰基-d-己糖胺的n-乙酰基神经氨酸(neuachexhexnac)或neuac2hexhexnac对丝氨酸或苏氨酸残基进行修饰的预期质量增加精确匹配。通过neuachexhexnac修饰的抗cd37重链是经修饰的种类中最丰富的。这些修饰是常见的粘蛋白型o-糖基化核心-1聚糖特性。参见例如tran和tenhagen,mucin-typeo-glycosylationduringdevelopment,2013,j.biol.chem.288(10):6921-6929。因此，这些数据表明在图20小图a中的大约145,075.35da处和图20小图b中的145,058.90da的小峰是抗cd37hc的o-糖基化种类。因此，在来自用编码抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1的dna转染的宿主细胞的抗体制剂中，ms未检测到除抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1以外的任何抗体种类。[0569]这种抗体混合物被还原，然后进行进一步的hplc-ms分析以明确鉴定单个重链和轻链。检测到的第一个峰具有23378.22da的质量，其与抗hcd20ab1.2.2.1lc的理论确定质量(23377.97da)相匹配，误差为11ppm。图22小图a。检测到的第二个峰具有23495.32da的质量，其与抗hcd37ab1.a1.1lc的理论确定质量(23495.15da)相匹配，误差为7ppm。图22小图b。检测到的第三个峰具有48732.94da的质量，其与抗hcd37ab1.a1.1hc的理论确定质量(48732.99da)相匹配，误差为1ppm。图22小图d。检测到的第四个峰具有49374.44da的质量，其与抗hcd20ab1.2.2.1hc的理论确定质量(49374.71da)相匹配，误差为5ppm。图22小图c。这些结果清楚地证明了在该抗体混合物中存在来自抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1的lc和hc。[0570]类似地，从含有编码抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.n12.1的dna的宿主细胞回收的抗体混合物被脱糖基化、还原，并且进行hplc-ms分析以明确地鉴定该混合物中的hc和lc。在该混合物中检测到的峰之一具有23378.24da的质量，其与抗hcd20ab1.2.2.1lc的理论确定质量(23377.97da)相匹配，误差为11ppm。图23小图a。检测到的另一个峰具有49374.47da的质量，其与抗hcd20ab1.2.2.1hc的理论确定质量(49374.71da)相匹配，误差为5ppm。图23小图c。检测到的第三个峰具有23468.34da的质量，其与抗hcd37ab1.n12.1lc的理论确定质量(23468.12da)相匹配，误差为9ppm。图23小图b。检测到的第四个峰具有48746.70da的质量，其与抗hcd37ab1.n12.1hc的理论确定质量(48746.97da)相匹配，误差为5ppm。图23小图d。结果清楚地证明了在该mabpair混合物中存在抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.n12.1抗体的lc和hc。[0571]将来自含有编码抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1的dna的细胞的抗体混合物用酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)igg降解酶(ides蛋白酶；promega，目录号v7511，其在铰链区下方的单个位点处切割igg抗体，产生f(ab’)2片段和包含ch2和ch3结构域的片段)进行处理，随后在存在2-巯基乙基胺(2-mea)和乙二胺四乙酸(edta)的情况下部分还原。用2-mea和edta处理将铰链区二硫键还原，而不会显著影响hc/lc二硫键。因此，预计这种处理将产生fab'片段和包含ch2和ch3结构域的片段，可能伴有少量的fd片段(包含vh和ch1)和lc。[0572]下面的表22显示了由来自包含抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1的抗体混合物的四种可能的fd/lc配对(包括同源和非同源对)产生的fab片段的计算质量。[0573]表22：fab片段的计算质量[0574]fd/lc组合*fab的计算质量(da)fd1/lc148912.71fd2/lc248412.21fd1/lc249029.89fd2/lc148297.03[0575]*fd1和lc1来自抗hcd20ab1.2.2.1抗体，并且fd2和lc2来自抗hcd37ab1.a1.1抗体。[0576]通过ms对ides蛋白酶消化的和2-mea加edta处理的抗体对的分析产生在48,413.25和48,913.90da处的峰，其与计算的fd2/lc2质量和fd1/lc1fab质量匹配，误差分别为22ppm和24ppm。图24小图a。在fab'片段的计算质量(包括具有非同源fd/lc对的fab'片段的计算质量)周围的大小范围内未观察到其他峰。因此，这些数据表明两个观察到的hc/lc对都是同源对。[0577]下面的表23显示了由来自包含抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.n12.1的抗体混合物的四种可能的fd/lc配对(包括同源和非同源对)产生的fab片段的计算质量。[0578]表23：fab片段的计算质量[0579]fd/lc组合*fab的计算质量(da)fd1/lc148912.71fd2/lc248399.17fd1/lc249002.86fd2/lc148311.02[0580]*fd1和lc1来自抗hcd20ab1.2.2.1抗体，并且fd2和lc2来自抗hcd37ab1.n12.1抗体。[0581]通过ms对ides蛋白酶消化的和2-mea加edta处理的抗体对的分析产生在48,400.11和48,913.84da处的峰，其与计算的fd2/lc2fab质量和fd1/lc1fab质量匹配，误差分别为19ppm和23ppm。图24小图b。在fab片段的计算质量(包括具有非同源fd/lc对的fab'片段的计算质量)周围的大小范围内未观察到其他主要峰。因此，这些数据表明两个观察到的hc/lc对都是同源对。[0582]总之，来自ms分析的结果表明，来自含有抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1或ab1.n12.1的单个宿主细胞系的抗体混合物的hc和lc具有几乎完全同源的hc/lc配对，并且几乎没有异二聚体hc配对。[0583]实施例13：抗hcd20和抗hcd37抗体的结合特异性[0584]以下描述的实验被设计为确认本文所述的抗hcd20和抗hcd37抗体分别特异性地结合至hcd20和hcd37。[0585]用hcd20并独立地用hcd37转染cho细胞。从这些转染子衍生出两个细胞系，一个稳定地表达hcd20(cd20/cho)，并且另一个稳定地表达hcd37(cd37/cho)。在约0.0002nm至约30nm范围内的各种抗体浓度下，对抗hcd20ab1.2.2.1、抗hcd37ab1.a1.1、包含抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1的mabpair(在表24中称为“mabpair”)、igg1同种型对照抗体(在表24中称为huigg1)测试与这些细胞系中的每个的结合。将基本上如实施例2中所述的基于facs的检测系统用于检测抗体与这些细胞系的结合。所述方法与实施例2中所使用的方法在以下方面不同。如上文所解释，所使用的细胞系是cd20/cho和cd37/cho，而不是raji细胞。将细胞以1500rpm离心5分钟进行洗涤，而不是以1500rpm离心3分钟。洗涤后，将细胞和一级抗体一起在50μl而不是100μl的体积中孵育。以各种浓度添加一级抗体以创建剂量/响应曲线，而不是所有抗体的浓度为5μg/ml。针对每种抗体的每种浓度记录的geomfi值的ec50报告于下表24中。[0586]表24：抗体与用cd20或cd37转染的cho细胞结合的ec50[0587][0588][0589]*nb表示在测试浓度范围内无结合。[0590]表24中的数据显示mabpair和抗hcd20ab1.2.2.1两者均与cd20/cho结合，而抗hcd37ab1.a1.1和huigg1不结合。此外，这些数据显示mabpair和抗hcd37ab1.a1.1与cd37/cho结合，而抗hcd20ab1.2.2.1和huigg1不结合。因此，这些数据显示抗hcd20ab1.2.2.1对hcd20的结合特异性，因为该抗体与表达hcd20的cho细胞结合，但不与用hcd37转染的cho细胞结合。类似地，抗hcd37ab1.a1.1显示对hcd37的特异性，因为它与cd37/cho细胞结合，但不与cd20/cho细胞结合。因此，该测定证明抗hcd20ab1.2.2.1特异性地结合至如本文所意指的hcd20，并且抗hcd37ab1.a1.1特异性地结合至如本文所意指的hcd37。[0591]作为在功能意义上对这种结合特异性的进一步证实，在三个靶细胞系(即，cd20/cho、cd37/cho和raji肿瘤细胞系)中在体外评估了adcc活性。adcc报告子测定基本上如实施例5中所述进行，不同之处在于效应细胞在这种情况下是fcγriii转染的jurkatnfat萤光素酶报告子细胞系。参见例如，hsieh等人,characterizationoffcγriiiaeffectorcellsusedininvitroadccbioassay:comparisonofprimarynkcellswithengineerednk-92andjurkattcells,2017,j.immunol.methods441:56-66。已知raji细胞表达hcd20和hcd37两者。在不存在编码此类蛋白质的转染dna的情况下，cho细胞不表达hcd20或hcd37。在每个细胞系中，测试了以下抗体的adcc活性：人igg1同种型对照抗体(抗二硝基苯基(抗dnp)抗体)；利妥昔单抗(igg1抗hcd20抗体)；抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1。在每个细胞系中测试4:1和8:1的效应物:靶比率。重复样品的结果报告为平均相对发光单位(rlu(n＝2))，而不是图7小图a中的特异性裂解百分比。这些结果显示在下表25中。[0592]表25：抗体在转染的cho细胞和raji细胞中的adcc活性[0593]靶细胞测试抗体效应物:靶比率平均rlucd20/cho抗dnphuigg14:120936cd20/cho利妥昔单抗4:1126026cd20/cho抗hcd20ab1.2.2.14:1112890cd20/cho抗hcd37ab1.a1.14:121308cd20/cho抗dnphuigg18:136014cd20/cho利妥昔单抗8:1154558cd20/cho抗hcd20ab1.2.2.18:1152550cd20/cho抗hcd37ab1.a1.18:137348cd37/cho抗dnphuigg14:120556cd37/cho利妥昔单抗4:120464cd37/cho抗hcd20ab1.2.2.14:119796cd37/cho抗hcd37ab1.a1.14:169738cd37/cho抗dnphuigg18:136166cd37/cho利妥昔单抗8:135888cd37/cho抗hcd20ab1.2.2.18:136432cd37/cho抗hcd37ab1.a1.18:1104940raji抗dnphuigg14:116560raji利妥昔单抗4:194310raji抗hcd20ab1.2.2.14:1116546raji抗hcd37ab1.a1.14:1108692raji抗dnphuigg18:131484raji利妥昔单抗8:1136862raji抗hcd20ab1.2.2.18:1147704raji抗hcd37ab1.a1.18:1140334[0594]由于adcc依赖于测试抗体与靶细胞上表达的抗原的结合，因此这些数据有力地表明抗-hcd20ab1.2.2.1与cd20/cho和raji细胞结合，但不与cd37/cho结合。这些数据进一步有力地表明，抗hcd37ab1.a1.1与cd37/cho和raji细胞结合，但不与cd20/cho结合。因此，这些数据与表24中所示的结合数据完全一致。[0595]实施例14：抗hcd20/抗hcd37抗体混合物在直接细胞杀伤测定中的活性[0596]将不同浓度的抗hcd20和抗hcd37抗体单独或作为混合物进行如上文实施例2中所述和“直接细胞杀伤”的定义中所述的在不存在交联抗体的情况下进行的直接细胞杀伤测定。测试了wsu-dlcl2细胞和ramos细胞，并且这些数据分别显示在图25的小图a和b中。样品包括igg1/κ同种型对照抗体(huigg1)、抗hcd20ab1.2.2.1、抗hcd37ab1.a1.1、抗hcd20ab1.2.2.1加抗hcd37ab1.a1.1、抗hcd37ab1.n12.1、以及抗hcd20ab1.2.2.1加抗hcd37ab1.n12.1。以从5μg/ml(34nm)开始的1:2稀释系列滴定样品。它们在该测定中的活性总结在表26中。[0597]表26：抗体在直接细胞杀伤测定中的效力(ec50)[0598][0599]当用wsu-dlcl2细胞测试时，抗hcd20ab1.2.2.1显示出高效力，但每种抗cd37抗体独立地几乎是无效的。然而，与单个组分相比，抗hcd20ab1.2.2.1和任一抗cd37抗体的混合物在一定程度上提高了效力。当用ramos细胞测试时，抗hcd20ab1.2.2.1igg处理显示出几乎无功效，这与wsu-dlcl2细胞中的结果明显不同。两种抗cd37抗体在ramos细胞中都是有效力的，结果也与在wsu-dlcl2细胞中获得的结果不同。两种抗体混合物明显比混合物的任一单个组分在ramos细胞中具有更高的效力。因此，这些结果表明，在所测试的细胞类型(两种细胞类型都是源自b细胞淋巴瘤的细胞系)中，与任一单个组分相比两种抗cd20/抗cd37抗体混合物均具有增加的直接细胞杀伤活性。因此，这些数据表明，在诸如b细胞介导的癌症的疾病中，这些抗体混合物相对于单独的任一种抗体可能具有增加的功效。[0600]实施例15：在全血中通过抗hcd20/抗hcd37抗体混合物的b细胞耗竭[0601]下文所述的实验通过含有抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1的抗体混合物测试全血中的b细胞耗竭。将230μl来自健康人供体的全血等分试样一式两份地加载到深孔96孔微量滴定板的孔中。将含有在20μl体积中以从50μg/ml(333.3nm)开始的1:10稀释系列滴定的不同浓度的对照抗体或抗体混合物的溶液添加到孔中，并且通过上下移液混合几次。将板在37℃下孵育4小时。分别以1:25和1:125的稀释度添加二级抗体(即，apc缀合的小鼠抗人cd19抗体(bdbiosciences，克隆hib19，目录号555415)和fitc缀合的小鼠抗人cd45抗体(bdbiosciences，克隆hi30，目录号561865))。为了避光将板用铝箔包裹，并且在室温下再孵育45分钟。将裂解溶液(bectondickinson(bd)，目录号349202)添加到深孔96孔微量滴定板的每个孔(1ml/孔)中。将板在室温下孵育10分钟，然后以1500rpm旋转5分钟。吸出上清液而不干扰细胞沉淀。将板通过向每个孔中添加1mlpbs、混合并且将所述板以1500rpm离心5分钟来洗涤。如上所述，再重复一轮裂解、旋转和洗涤，以尽可能多地消除裂解的红细胞(rbc)。将板通过向每个孔中添加500μlfacs缓冲液、混合并且将所述板以1500rpm离心5分钟来洗涤。吸出上清液，将细胞重悬于200μl/孔的facs缓冲液中，并且添加碘化丙啶溶液(promokine，目录号pk-ca707-40017)至终浓度5μg/ml。使用becton-dickinson荧光激活细胞分选仪(lsrii)进行流式细胞术分析。通过抗cd19二级抗体(其对b细胞具有特异性)追踪b细胞的损失，然而可以通过抗cd45二级抗体(其鉴定白细胞)追踪样品中的白细胞总数。所述测定是用来自3名健康供体的pbmc独立进行的。结果显示在图26中。所测试抗体的ec50总结在表27中。[0602]表27：在b细胞耗竭测定中的抗体的ec50[0603][0604]*n/a表示不可获得，在这种情况下，因为曲线是平坦的。[0605]对于供体1198，奥比妥珠单抗(一种基准抗cd20抗体)迅速(4小时孵育期)以高效力耗竭b细胞，然而利妥昔单抗(另一种基准抗cd20抗体)则较不有效。图26小图a。这些数据可能反映了奥比妥珠单抗和利妥昔单抗可以杀伤细胞的不同作用机制。单独的抗hcd20ab1.2.2.1具有与利妥昔单抗相似的效力，并且抗hcd37ab1.a1.1具有较低的效力。然而，含有抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1的混合物在所有供体中相对于任一种单独的抗体具有增加的效力。图26小图a-c。在含有来自供体1056的血液的样品中，b细胞不能通过用任何单一抗体处理而被有效杀伤。抗体混合物具有最高的效力。图26小图b。在含有来自供体2004的血液的样品中，通过用利妥昔单抗处理不会耗竭b细胞。奥比妥珠单抗和抗hcd20ab1.2.2.1两者均显示相对无效的b细胞耗竭，而抗hcd37ab1.a1.1几乎完全无效。然而，抗体混合物的活性显著高于任一种单个组分。图26小图c。因此，所有这些结果表明，含有抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1的抗体混合物可以比任一种单独的抗体更有效地耗竭全血背景中的b细胞。因此，这些数据表明，抗hcd20和抗hcd37抗体的组合可能比任一种单独的抗体更有效地治疗b细胞介导的疾病。[0606]实施例16：抗cd20和抗cd37抗体对小鼠的肿瘤生长的作用[0607]用利妥昔单抗治疗b-nhl患者可能会复发，而这种复发通常由于发展耐药性而发生。因此，开发新的疗法以避免耐药性的需求尚未得到满足。[0608]在下文所述的实验中，用各种抗体及其组合治疗携带已建立的ramos细胞异种移植物的cb-17/scid小鼠，以测试抗体在体内对已建立的肿瘤的作用。ramos细胞来源于人b细胞淋巴瘤。如图25小图b中所示，抗hcd20ab1.2.2.1在体外直接细胞杀伤ramos细胞方面相对无效。类似地，已表明ramos细胞对利妥昔单抗(其是一种抗hcd20抗体)诱导的细胞凋亡具有相对耐受性。参见例如，konitzer等人(2015),plosone10(12):e0145633(doi:10:1371/journal.pone.0145633)。因此，对于ramos细胞肿瘤可能对抗hcd20抗体不敏感的预期存在某种基础。[0609]在我们的实验中，在携带已建立的ramos细胞异种移植物的cb-17/scid小鼠中测试了包括抗hcd20抗体奥比妥珠单抗抗hcd37ab1.a1.1和抗hcd20ab1.2.2.1/抗hcd37ab1.a1.1mabpair在内的抗体。ramos肿瘤细胞植入后，使肿瘤生长七天，直到它们达到平均100立方毫米(mm3)的尺寸。将荷瘤小鼠放入治疗组，以便使每组十只小鼠拥有相似的中值肿瘤体积。在第七天通过腹膜内注射开始用每种测试抗体进行治疗，并且在图27中记录的剂量水平下继续每周两次，持续三周。每周两次对每只单独的小鼠测量肿瘤体积和体重，并且肿瘤体积结果以mm3表示。图27小图a的结果表明，用抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1的组合治疗有效地抑制了已建立的ramos细胞肿瘤的生长。事实上，几乎在全部的接受这种治疗的荷瘤小鼠中观察到肿瘤消退，并且十只小鼠中有九只在研究结束时没有肿瘤。相反，所有用同种型对照抗体(higg1)治疗的十只小鼠在研究期期间经历了肿瘤生长。图27小图b中的结果表明，用抗hcd37ab1.a1.1治疗也抑制ramos细胞肿瘤生长，但不如含有抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab.a1.1的mabpair有效。在该治疗组中，10只小鼠中有6只在研究结束时没有肿瘤。[0610]这些发现表明，包含抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1的mabpair具有体内抗肿瘤活性优于用单独的抗hcd37ab1.a1.1观察到的抗肿瘤活性，表明该抗hcd20抗体可以具有抗ramos细胞肿瘤活性，尽管在体外显示出有限的(如果有的话)对ramos细胞的直接细胞杀伤。该实验中进一步的数据表明，单独的抗hcd20抗体奥比妥珠单抗具有与包含抗hcd20ab1.2.2.1和抗hcd37ab1.a1.1的mabpair相当的体内抗肿瘤活性。数据未显示。鉴于由图25小图b中的数据证明的抗hcd20ab1.2.2.1在ramos细胞中非常有限的体外细胞杀伤活性以及ramos细胞在体外对利妥昔单抗(另一种抗hcd20抗体)的有限敏感性，这一结果可能有些令人惊讶。然而，由于体内测定与体外测定非常不同，这些结果并不直接矛盾。当前第1页12当前第1页12