大麻提取物的应用及包括大麻提取物的药物

本发明涉及癌症及炎症治疗
技术领域：
，尤其涉及一种大麻提取物的应用及其包括大麻提取物的药物。
背景技术：
：几个世纪以来，大麻提取物在世界范围内被用于许多症状，如疼痛、神经系统紊乱等。大麻被认为是具有精神活性和欣快作用的化合物。研究人员最初将其应用于制药。然而，随着时间的推移，它的医疗用途已经实现了很大程度的增长。不同的报告显示了大麻在慢性疼痛、抑郁、神经病变、关节炎、多发性硬化症、帕金森病、镰状细胞贫血、克罗恩病等方面的多重应用。大麻提取物也可称为大麻素，大麻素一词用于描述近100种萜酚类化合物，主要分为三类，即植物大麻素类、内源性大麻素类和合成大麻素。内源性大麻素是内源性产生的，如aea、2-ag等。植物大麻素类可以进一步划分为亚类。δ9-四氢大麻酚(δ9-thc，delta-9-tetrahydrocannabivarin)是植物的主要精神活性成分。其他大麻素包括大麻二酚(cbd)、δ8-thc、大麻色胺(cannabichromene)和大麻酚(cannabinols)。在过去的几十年中，从大麻植物中分离出了两种活性大麻素(thc和cbd)，并阐明了它们对内源性大麻素系统的潜在作用。有的化合物与thc具有协同作用，有的具有拮抗作用或加抗作用。已经确定了特异性的大麻素受体，即cb1和cb2受体。大麻可以通过作用于cb2受体而作用于中枢神经系统(cns)和周围神经系统。植物及其成分(δ9-thc和cbd)抑制细胞因子和炎症的产生。大麻植物的另一药理作用是其抗氧化性和对促炎生物标志物的抑制作用。大麻可以降低脂质过氧化产物水平，上调谷胱甘肽和过氧化氢酶的活性。cbd、thc和其他大麻素被认为是强效抗氧化剂，cbd被证明可以减少神经元培养中的氢过氧化物毒性。对癌细胞的体内实验表明，大麻素能阻断癌细胞的转移和侵袭，抑制肿瘤血管生成。癌症引起的神经性疼痛也可以通过使用基于大麻的药物来治疗，除了其抗癌功能。大麻素还可调节参与癌细胞发育、增殖、迁移或凋亡的信号转导通路。研究表明，大麻靶向至少四种不同的致癌机制，通过抑制有丝分裂信号、诱导凋亡、抑制肿瘤血管生成和转移直接抑制转化细胞的生长。然而，目前通常采用单独大麻提取物应用于癌症的治疗，特异性低且治疗效果不佳。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一种大麻提取物在制备抗肿瘤药物或者抗炎药物中的应用，以解决现有技术中采用大麻提取物进行治疗时特异性低、治疗效果不佳的技术问题。本发明的目的之二在于提供一种大麻提取物在制备抗肿瘤药物或者抗炎药物中的应用。本发明的目的之三在于提供一种用于治疗肝癌和/或肾癌的药物。本发明的目的之四在于提供一种用于治疗炎症的药物。本发明的目的之一采用如下技术方案实现：大麻提取物在制备抗肿瘤药物或者抗炎药物中的应用，所述大麻提取物包括水提取物、乙醇提取物和正己烷提取物中的至少两种，所述水提取物是以水作为提取剂从大麻植物中提取获得，所述乙醇提取物是以乙醇作为提取剂从所述大麻植物中提取获得，所述正己烷提取物是以正己烷作为提取剂从所述大麻植物中提取获得。作为一种实施方式，所述大麻提取物包括所述水提取物、所述乙醇提取物和所述正己烷提取物。作为一种实施方式，所述大麻提取物从所述大麻植物的花朵和/或种子中提取获得。作为一种实施方式，所述肿瘤为肝癌和/或肾癌。作为一种实施方式，所述抗肿瘤药物或者所述抗炎药物的剂型包括散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、微囊剂、丸剂、滴丸、软胶囊、口服液、糖浆剂、分散片、喷雾剂或气雾剂、静脉注射剂、肌肉注射剂、吸入剂、贴剂或凝胶剂。本发明的目的之二采用如下技术方案实现：大麻提取物在制备抗肿瘤药物或者抗炎药物中的应用，所述大麻提取物包括水提取物和有机提取物，所述水提取物是以水作为提取剂从大麻植物中提取获得，所述有机提取物是以有机溶剂作为提取剂从所述大麻植物中提取获得。本发明的目的之三采用如下技术方案实现：用于治疗肝癌和/或肾癌的药物，包括大麻提取物；所述大麻提取物包括水提取物、乙醇提取物和正己烷提取物中的至少两种，所述水提取物是以水作为提取剂从大麻植物中提取获得，所述乙醇提取物是以乙醇作为提取剂从所述大麻植物中提取获得，所述正己烷提取物是以正己烷作为提取剂从所述大麻植物中提取获得。作为一种实施方式，所述大麻提取物包括所述水提取物、所述乙醇提取物和所述正己烷提取物。本发明的目的之四采用如下技术方案实现：用于治疗炎症的药物，包括大麻提取物；所述大麻提取物包括水提取物、乙醇提取物和正己烷提取物中的至少两种，所述水提取物是以水作为提取剂从大麻植物中提取获得，所述乙醇提取物是以乙醇作为提取剂从所述大麻植物中提取获得，所述正己烷提取物是以正己烷作为提取剂从所述大麻植物中提取获得。作为一种实施方式，所述大麻提取物包括所述水提取物、所述乙醇提取物和所述正己烷提取物。相比现有技术，本发明的有益效果在于：大麻提取物对hepg2细胞系具有抗增殖作用，并在减轻急性ni暴露大鼠毒性中具有一定的作用，特别是结合多种大麻提取物，能够提供更强的特异性和降低毒性的作用。附图说明图1是肝组织匀浆的组织病理学表现图；图2是肾组织匀浆的组织病理学表现图；图3a是乙醇提取物显示对肝癌细胞(hepg2)的抗癌活性结果图；图3b是乙醇提取物的台盼蓝实验结果图；图3c是乙醇提取物的结晶紫实验结果图；图3d是未使用大麻提取物进行处理时的hepg2细胞增殖结果图；图3e是使用乙醇提取物进行处理时的hepg2细胞增殖结果图；图3f是未使用大麻提取物进行处理时的hepg2细胞凋亡结果图；图3g是使用乙醇提取物进行处理时的hepg2细胞凋亡结果图；图4是大麻提取物的gc-ms分析化合物鉴定结果图；图5是化合物(cbd、cannabinol和δ9-thc)与靶标akt-1和cox-2的对接结果图；图6是化合物(cbd、cannabinol和δ9-thc)与靶标mdm-2和tgf-β的对接结果图。具体实施方式下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。实施例一：采用分子级水为提取剂对大麻的花和/或种子进行提取，获得的提取物为水提取物(下述用we表示)。提取步骤如下：将500mg大麻花冠放入5ml分子级水中，在水浴中加热(约98℃)2小时，然后在室温下冷却，过滤和提取如下：100μl分子级水置于玻璃管中，超声15min，3500g离心5min，上清液约3μl注入uhplc-ms/ms系统。提取方法为现有技术，在此不再进行详细描述。实施例二：采用乙醇为提取剂对大麻的花和/或种子进行提取，获得的提取物为乙醇提取物(下述用ae表示)。提取步骤为：将500mg大麻种子放入5ml乙醇中，在水浴中加热(约98℃)2小时，然后在室温下冷却，过滤和提取如下：100μl乙醇置于玻璃管中，超声15min，3500g离心5min，上清液约3μl注入uhplc-ms/ms系统。提取方法为现有技术，在此不再进行详细描述。本实施例中，提取剂为乙醇。实施例三：采用正己烷为提取剂对大麻的花和/或种子进行提取，获得的提取物为制备正己烷，采用实施例一中描述的提取方法对大麻的花和种子进行干提取，提取得到正己烷提取物(下述用he表示)。提取步骤为：将500mg大麻花冠放入5ml正己烷中，在水浴中加热(约98℃)2小时，然后在室温下冷却，过滤和提取如下：100μl正己烷置于玻璃管中，超声15min，3500g离心5min，上清液约3μl注入uhplc-ms/ms系统。提取方法为现有技术，在此不再进行详细描述。本实施例中，提取剂为正己烷。实施例四：对实施例一至实施例三获得的大麻提取物进行化合物鉴定。具体地，采用气相色谱-质谱联用仪(gaschromatography-massspectrometer，gc-ms)进行分析鉴定，其中gc-ms-pq2010超高端gc-ms(shimadzuco.,japan)采用熔融硅胶柱(30米长×0.25mm内径0.25μm薄膜)，检测器采用hossain等人2014年的方法，在70电子伏特(ev)电离能下开启ei模式。鉴定结果请参阅表1，示出了模板识别(identity)和查询覆盖(querycoverage)率。表1目标蛋白模板识别查询覆盖率pdb识别号akt-197.30％92％4ejnbcl-286％86％2xa0cox-296％100％1pxxil-684.86％87％2l3ymdm-285.33％30％5swkp5389.06％67％5xzctnf-alpha95％89％2tnftgf-beta88.92％92％5ffovegf-a83.62％53％3v2aosteopontin91.67％3％3cxd实施例五：对不同器官的组织进行病理学研究。1)标本准备及生化检测：将100只大鼠分为10组(每组10只)，分别为a组、b组、c组、d组、e组、f组、g组、h组、i组、j组，其中a组为对照组；b～j组大鼠均采取镍(ni)中毒(中毒方式：1ppm/kgb.wt进行六个月)诱发癌症；c～i组大鼠经正己烷提取物、乙醇提取物和分子级水提取物单独使用、联合使用六个月，其中，正己烷提取物he使用方式为100mg/kgb.wt./天，乙醇提取物ae使用方式为100mg/kgb.wt./天，水提取物we使用方式为200mg/kgb.wt./天；j组大鼠接受紫杉醇单独使用(使用方式：500mg/kgb.wt/天)(紫杉醇是现有治疗效果比较好的抗癌药，相当于抗癌药物中的金标准，通过与紫杉醇的治疗效果进行对比，以此进一步说明大麻提取物的治疗效果)。详见表2。表2本实施例在ni处理的大鼠模型上建立了一个明确的大麻提取物模型，以ni处理的大鼠模型为研究对象进行生化检测，请参阅表3-6，分别示出水、乙醇和正己烷提取物对ni诱导大鼠模型的生化反应。表3表4表5表6表中，mean±sd表示平均值±标准差，n＝10表示每组有10只大鼠，lsd表示最小显著差异。抗增殖活性的检测：对于经ni诱导处理的各组大鼠模型，经大麻提取物处理后，各组间差异显著。akt(ng/ml)、vegf-α(pg/ml)、p38(μmol/l)和tgf-β(μmol/l)的血清循环浓度，在ni处理后(akt：16.54±2.78，vegf-α：513.18±17.34，p38：102.60±10.24，tgf-β：22.56±1.99)都有所增加(请参考b组数据)，经大麻提取物治疗后所有组显著降低，但最大减少在i组(akt：6.69±0.98，vegf-α：45.37±13.26，p38：54.49±8.78，tgf-β：12.69±5.25)，在该组中，正己烷提取物he、乙醇提取物ae和水提取物we联合使用。氧化应激的标记：ni处理后氧化应激标志物4-hne(ng/l)、8-ohdg(pg/ml)、isop-2α(pg/ml)、mda(nmol/ml)、cox-2(ng/ml)、no(μmol/l)、aopps(um)、ages(pg/ml)和inos(iu/ml)水平明显提升，请参考b组数据，其中，4-hne：12.84±3.54，8-ohdg：21.45±3.84，isop-2α：121.54±5.55，mda：8.66±3.54，cox-2：4.54±1.54，no：14.85±3.59，aopps：1.64±0.86，ages：1.68±0.61，inos：50.66±6.34。而在正己烷提取物he、乙醇提取物ae和水提取物we联合使用后，氧化应激标志物又显著降低(p<0.05)，尤其是在4-hne，8-ohdg，isop-2α、mda、no、ages和inos这些方面降低幅度最大，请参考i组数据，(4-hne：6.31±2.84，8-ohdg：13.94±1.99，isop-2α：21.60±7.98，mda：2.96±0.99，no：10.78±4.09，ages：0.97±0.89，inos：16.70±3.51)。炎症标记物：ni处理组血清中高水平的炎症标志物tnf-α、il-6、mmp-9和caspase-8在i组中显著降低，请参阅i组数据，tnf-α：20.80±4.64，il-6：14.61±4.56，mmp-9：14.99±5.69。并且与ni组处理大鼠(b组中mdm2为4.84±2.02)相比，d组、f组、h组和i组的mdm2水平也分别升高(d组：5.60±2.45；f组：5.89±2.86，h组：6.56±1.89，i组：5.75±2.09)。抗氧化剂的浓度：大麻提取物处理后sod、gsh等抗氧化剂浓度显著升高。然而，如表3-6所示，cat、gpx和grx水平降低。2)切片制作及组织病理学检查：切片制作：先将封闭部分(标本+蜡)放入冷水中，再放入热水中固定在玻片上。为了更好地固定载玻片，在载玻片上涂布卵清蛋白和甘油混合物膜。玻片置于50℃烤箱中烘烤10-15分钟，然后放入二甲苯瓶中去蜡。切片染色时，先将切片浸泡在无水乙醇瓶中2分钟，用水冲洗后放入苏木精染色液中2分钟，再将切片冲洗后放入酸乙醇中20-30秒，用水冲洗后用伊红染色液处理2分钟。经苏木精和伊红染色后的切片，可显微镜下观察各器官组织的组织学病理变化。将不同的大鼠切片分离保存在10％福尔马林溶液中。各组取肝、肾切片，用浓缩福尔马林浸泡2小时。“自动组织处理器”包含12个广口瓶，标本都在自动组织处理器中处理。两瓶福尔马林石蜡，四瓶丙酮，四瓶二甲苯。标本在每个广口瓶里放置大约两个小时，整个过程可以在24小时内完成。来自组织处理器的标本被填充了蜡的立方体盒子“包埋”。为了更好地在切片机(5μm)中切割，封闭盒保存在冰箱中。肝脏组织病理学检查：本发明实施例显示单用ni以及he、ae、we单独处理和不同组合处理对标本肝脏组织学的作用。对照组肝组织结构正常，器官细胞显示正常的窦样结构，正常的六边形或五边形小叶，有中央静脉，周围肝三联或四联嵌在结缔组织中，呈规则状，并包含一个大的球状核，形态正常。经ni(处理方式：1ppm/kgb.wt./天，持续一个月)治疗的肝大鼠肝细胞检查显示受损，正常肝细胞典型的索状排列丧失，中央静脉和门静脉充血，大量肝细胞受损，失去了其特有的外观，而另一些细胞则表现出明显的细胞质空泡化，这种空泡化在某些细胞中非常广泛，只剩下少量的胞质团细胞，经常形成狭窄的外周边缘。并且出现细胞核固缩，肝细胞间中央静脉和肝窦扩张，局部可见缺血性坏死伴脂肪改变，肝脏结节形成，上层有肝硬化。少数区域有明显的改变，如肝结节，有明显的脂肪改变，肝硬化改变，少数细胞呈多形性。注射ni可显示炎症、增生、中央静脉和门静脉充血。上述的改变导致肝损伤，由于膜的通透性导致酶的损失，进而导致肝细胞中alt、ast和alp水平下降，因而它们在血清中的浓度升高。采用he、ae、we单独处理和不同组合处理后，上述ni处理出现的变化都显著减弱，而he、ae、we三种提取物的联合治疗效果最显著。he、ae、we的联合治疗有助于通过增加酶抗氧化剂(sod，过氧化氢酶)和非酶抗氧化剂(gsh)，以及通过降低血清中tbars水平来恢复上述细胞的变化。因此，he、ae、we的联合治疗可以改善或清除ros，以克服使用ni造成的氧化损伤，如图1所示。肾组织病理学检查：ni治疗肾的显微照片显示肾小管明显敏感。肾组织病理切片显示对照组肾小体，切片显示完整的鲍曼包膜，近端和远端邻近小管坏死和小管上皮细胞脱落。ni处理后，显示肾小管变性、间质出血、扩张、肾小球萎缩和毛细血管充血，管状结构可见明显的空泡化和囊性扩张。采用he、ae、we单独处理和不同组合处理后，显示肾脏结构和上皮内膜的修复，并且he、ae、we的不同联合治疗处理可以观察到最大程度的改善。结果请参阅图2。实施例六：对人肝癌细胞系(hepg2)的研究。1)细胞培养技术：细胞系集合人肝癌细胞系(hepg2)细胞冷冻瓶取自拉合尔大学分子生物学与生物技术研究所细胞培养实验室。这些细胞系保存于液氮(-196℃)中。细胞培养hepg2细胞系在现有的dulbecco'smodifiedeaglemedium(dmem)培养基中繁殖。hepg2还加入10％的胎牛血清(热灭活)。将细胞置于37℃的培养箱中，在5％co2的湿润气氛下保存。每周传代两次。2)ic-50计算(mtt法)：hepg2细胞在96孔板上培养，进行ic-50计算。hepg2细胞系分为两组，一组未经处理，一组用五种大麻乙醇提取物处理过，五种大麻乙醇提取物为：c-eth-0.05mg/ml、c-eth-0.5mg/ml、c-eth-1mg/ml、c-eth-2mg/ml和c-eth-4mg/ml。培养细胞处理72小时后，用96孔板进行mtt。mtt法是一种细胞毒性检测方法，为了计算乙醇提取物对hepg2细胞系的ic-50，对96孔板上培养的细胞进行mtt(invitrogeninc.,usa)试验。首先用磷酸盐缓冲盐水(pbs)(invitrogeninc.,usa)清洗单层细胞，在100μl含25μlmtt溶液(invitrogeninc.,usa)的完全培养基中孵育2小时。四唑在活细胞中转化为紫色不溶于水的甲臜，然后用二甲基亚砜(dmso)(invitrogeninc.,usa)溶解，并在570nm处检测细胞吸光度。通过mtt法观察ic-50，hepg2细胞系显示毒性百分率(％)，经大麻的乙醇提取物(c-eth)处理后的hepg2细胞呈剂量依赖性。图3a示出了细胞毒性值。3)细胞活力试验：hepg2细胞在96孔板上培养，进行细胞活力测定。细胞系分为两组，一组未经处理，一组用四种大麻乙醇提取物处理过。培养细胞处理72小时后，用96孔板进行台盼蓝测定、结晶紫测定。采用台盼蓝测定：用乙醇提取物的ic-50值测定细胞活力，用台盼蓝作为活细胞和死细胞的指示剂测定细胞活力。未处理和处理过的hepg2细胞用pbs洗涤3次，然后用台盼蓝(invitrogeninc.,usa)孵育15分钟。pbs洗涤细胞3次，显微镜下观察。台盼蓝染色的细胞为死亡细胞。乙醇提取物经台盼蓝染色处理hepg2肿瘤细胞。经乙醇提取物处理的hepg2细胞中观察到大量的蓝色细胞，表明与未处理的hepg2细胞相比，死亡细胞更多，结果请参阅图3b。采用结晶紫测定：以乙醇提物的ic-50值测定细胞活力。该方法在96孔板上进行。将两组培养液从板孔中取出，用pbs洗涤。0.1％结晶紫染料洗净后，加入2％乙醇，室温孵育15分钟。丢弃染料，每孔加入100μl的1％sds，使染色液增溶5-10分钟。在微量滴定板上测定595nm处的吸光度。对hepg2细胞进行结晶紫染色，检测细胞活力。当用乙醇提取物处理癌细胞(hepg2)时，活细胞数量比未处理的hepg2细胞少，结果请参阅图3c。4)计数和存活试剂盒hepg2细胞在96孔板上培养，细胞系分为两组，一组未经处理，一组用四种大麻乙醇提取物处理过。培养细胞处理72小时后，用96孔板进行muse分析。hepg2细胞在96孔板中培养，用ic-50值的乙醇提取物经过计数、viabilitykit(cat.nomch100102)以及annexinvanddeadcellkit(catnumber:mch100105)处理，使用“muse”tm(merck-millipore)自动细胞分析仪。细胞经2000rpm离心5min，弃上清，将沉淀溶解于细胞活性试剂、annexin-v和凋亡试剂中，静置5min，计细胞数。图3d和图3e示出了以细胞计数为存活率的结果。与未处理组相比，用乙醇提取物处理的hepg2细胞，杀死的细胞较多，活细胞数较少。在未处理组中89.6％为活细胞，而乙醇提取物处理组中41.2％为活细胞。请参阅图3f和图3g，与未处理组(死亡率为23.55％)相比，乙醇提取物处理组的hepg2细胞死亡率为51.50％。实施例七：计算机模拟研究。1)目标蛋白的结构预测及分析：目标蛋白的结构预测：腺苷酸激酶1(ak-1；q9wus0)、b细胞淋巴瘤2(bcl-2；p49950)、环氧酶-2(cox-2；p35355)、白细胞介素6(il-6；p22273)、鼠双微基因2的同源物(mdm-2；d3zvh5)、磷酸蛋白53(p53；p10361)、肿瘤坏死因子α(tnf-α；p16599)、转化生长因子β(tgf-β；p17246)、血管内皮生长因子a(vegf-α；p16612)和骨桥蛋白(opn；p08721)的氨基酸序列，均是从uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中以fasta格式检索褐家鼠得到的。位置特定迭代基本局部对齐搜索工具(psi.blast)获得了合适的蛋白模型生成模板。三维结构预测使用itasser(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/i-tasser/)。除此以外，不同的评估工具errat、verify3d和rampage被用来评估预测模型结构。最后，uscfchimerav1.12使用amber运行力场参数，在最大步长为1000和共轭梯度为1000情况下运行，最小化模型蛋白质结构。蛋白质模型分析：通过计算方法分析生成的蛋白(ak-1、bcl-2、cox-2、il-6、mdm-2、p53、tnf-α、tgf-β、vegf-α和opn)模型。评价工具表明，预测的蛋白质模型具有良好的准确性，大部分残基都位于有利的区域。errat分析了不同原子类型之间的非键相互作用的统计数据，预测的分数证明了模型蛋白的准确性。结果表明，预测模型具有较好的errat值。verify3d和ramachandran预测值描述了目标蛋白的准确性。此外，ramachandran的结果还表明，大部分残基存在于有利的区域。2)配体设计与分子对接：由于cbd、cannabinol、δ9-thc具有良好的药物性质，选定这三种化合物进行计算机模拟研究。所选植物化合物都用chemdrawultra绘制，并以mol格式检索。利用mcule计算药物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性(admet)等药代动力学特性。分子对接研究通过autodockvina进行，采用标准方案。最后一次对接实验前，根据目标蛋白对网格值进行调整，请参阅表7，示出了对接网格值。根据能量值(kcal/mol)和结合相互作用行为来评价对接配合物。图形描述分别使用ucsfchimerav1.12和discoverystudio生成。表7利平斯基五法则(ro5)验证：将选定的植物化学物质用mcule和admetsar进行admet特性预测，结果请参阅表8所示的化合物的药物相似性质分析。植物化学成分经ro5分析验证，分子量应小于500(g/mol)，logp值应小于5，化合物应分别不大于10hba和5hbd。而hba和hbd的超过部分会导致渗透性变差。氢键能力被认为是影响药物通透性的重要参数。我们结果表明，合成的化合物符合<10hba和<5hbd值，与标准值相当。然而，在现有药物中有多个违反ro5的例子。极性表面积(psa)也被认为是描述药物吸收的良好描述，包括肠吸收、生物利用度和血脑屏障穿透。预测结果表明，所有化合物的psa值均小于图4示出了大麻提取物的gc-ms分析化合物鉴定结果。表8admet分析：以不同的参数观察植物化学物质的药代动力学行为。所有的都表现出了跨越血脑屏障(bbb)的积极行为。在人体肠道吸收中，均具有积极的行为，并有在肠道吸收的潜力。此外，三种化合物(cbd、cannabinol、δ9-thc)均表现出较低的cyp抑制电位。对这三种化合物均观察到非ames毒性和非致癌物的行为。总体结果表明，化合物表现出良好的效果，请参阅表9所示的植物化学物质admet分析结果。表9植物化学物质的结合能：所有植物化学物质都能在活性位点上与目标蛋白(ak-1、bcl-2、cox-2、il-6、mdm-2、p53、tnf-α、tgf-β、vegf-α和opn)结合，并具有良好的结合亲和力(kcal/mol)。表10(示出大麻中不同的植物化学物质对大鼠靶向蛋白与选定配体的结合亲和力分析)描述了结合值，与其他化合物相比，cbd和大麻酚具有较好的结合能值。所有不同的化合物在靶蛋白活性区域内以不同的构象结合。选取能量值最佳的对接配合物，根据相互作用谱来检测其结合行为。表10与akt-1、cox-2、mdm-2和tgf-β的结合作用：对接复合物根据氢和疏水相互作用进行分析，请参阅图5和图6。在cbd-akt-1对接复合物中，不同残基位置trp-80和lys-297观察到两个疏水键，键长分别为和(图5)。cannabinol-akt-1对接复合物在配体和蛋白质之间观察到一对相互作用。在leu-295和glu-278上分别观察到一个疏水键和一个氢键，键长分别为和δ9-thc与akt-1对接复合物，在植物化合物和蛋白质之间观察到三种相互作用。在leu-295、lys-276和glu-278上分别观察到1个疏水键和2个氢键，键长分别为和对接复杂的三维图形。基于氢键对对接复合体进行了分析。在cbd-cox-2对接复合体中，在glu-172处观察到单键长度为cannabinol-cox-2对接复合物，在配体和蛋白质之间观察到一对相互作用。在pro-90和leu-86上分别观察到一个疏水键和一个氢键，键长分别为和δ9-thc与cox-2对接复合物之间存在三种相互作用。在对接复合体中已经看到了一些相互作用。ala-171和his-176分别为1个氢键和1个疏水键，键长分别为和在cbd-mdm-2对接复合物中，在leu-33处观察到单疏水相互作用，键长(图6)。在cannabinol-mdm-2对接复合物中，在leu-107处观察到配体与蛋白质之间的单氢键，键长δ9-thc与mdm-2对接复合体，单个氢在asn-106上分别观察到，键长为在cbd-tgf-β对接复合体中，pro-193和trp-195的两个氢键长度分别为和而在cannabinol-tgf-β对接复合物中，tyr104的单键长度为在δ9-thc-tgf-β对接过程中，ala-221的键长为化合物的结合亲和力见表10。3)统计分析：所有属性的数据的方差分析(oneway-anova)使用costat计算机软件包(cohortsoftware,2003,monterey,california)计算。方法比较采用costat计算机软件包，采用duncan'snewmultiplerange(dmr)检验。在本申请中，通过mtt法、台盼蓝法、结晶紫法和muse法检测大麻提取物对细胞的抑制作用。与阳性对照组相比，ni作为强肝毒素的阴性对照组肝酶活性显著升高。经he、ae和we不同联合使用处理后发现，这些提取物具有协同作用，有使肝酶正常化的趋势。大鼠在经ni诱导后接受的联合治疗，在一段时间内逐渐恢复正常。化学信息学结果表明，大麻的植物化合物(cbd、cannabinol和δ9-thc)与标准值具有良好的可比性。总体计算结果表明，所有配体均遵循ro5规则，这确保了这些植物化学物质的潜在治疗行为。此外，这些植物化合物的admet谱也描述了它们跨越血脑屏障、在肠道吸收和无毒或无致癌的行为。进行分子对接研究，以检测与能量价值最高的化合物(cbd、cannabinol和δ9-thc)靶蛋白(akt-1、cox-2、mdm-2和tgf-β)的结合行为。所选植物化合物表现出良好的能量值。基于能量值和体外结果，进一步分析了四种对接复合物的氢和疏水相互作用。在akt-1三联体(cbd，cannabinol和δ9-thc)对接配合物中，在适当的结合距离(<4和)下，均观察到氢和疏水相互作用。此外，结合残基(trp-80、lys-297、leu-295、glu-278、leu-295、lys-276和glu-278)也很常见，保证了对接结果的意义和有效性。同样，cbd、cannabinol和δ9-thc分别与cox-2对接，并检查它们在靶蛋白活性区域内的结合行为。在所有的对接配合物中，氢和疏水的相互作用都具有合适的结合距离。结合位点上发现了具有不同结合构象位的相互作用残基(glu-172、pro-90、leu-86、ala-171和his-176)。此外，针对mdm-2和tgf-β对接复合物，cbd，cannabinol和δ9-thc与不同的残基如leu-33、leu-107和asn-106结合，结合距离适当。而在tgf-β对接复合物中，与pro-193、trp-195、tyr104和ala-221结合。对接结果表明，这些选定的化合物cbd，cannabinol和δ9-thc与靶蛋白结合具有良好的结合能值，与体外数据有良好的相关性，可以作为植物化学物质治疗癌症。综上所述，大麻提取物对hepg2细胞系具有抗增殖作用，并在减轻急性ni暴露大鼠毒性中具有一定的作用，特别是结合多种大麻提取物，会提供更强的特异性和降低毒性的作用。并且，生物信息学方法支持的体外模型也能证实了上述的作用。上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。当前第1页12