利用酶亚单位制备的药剂和检测方法

专利名称：利用酶亚单位制备的药剂和检测方法
技术领域：
本发明涉及在预定的条件下，例如在预定的位点或在预定的物质存在的条件下释放一种药剂的方法，特别是涉及用于治疗，诊断或调查目的释放一种药剂的方法。本发明进一步涉及引入到所述方法中的药物组合物，用于所述方法中的物质和试剂盒。
通常在生物科学领域内期望能够在预定的条件下例如在生物体内的特定位点储存或释放一种特定的药剂，或在检测过程中显示存在或缺乏一种分析物。目前通过使用直接缀合到活性成份的抗体可以达到所述的特异性。例如已经使用肿瘤相关性单克隆抗体(MABS)来选择性地将化疗药物携带至肿瘤细胞。临床研究已经调查了在患者的直肠癌中甲氨喋呤的释放(Ballantyne等人，1988，Int.J.Cancer，42103-108)并且也使用了阿霉素(参见“癌症生物治疗原理”Ed.Oldham，R.K.，Raven Press，New York，1987)。类似地，也可以将缀合到毒素，例如蓖麻毒蛋白，红豆毒素，假单胞菌毒素，白喉毒素和其它毒素上的MABS用作为抗癌剂。体内和体外研究已经表明所述缀合物对肿瘤细胞有强烈毒性(Roffler等人，1991。Cancer Res.514001-4007Embleton等人，1991Bir.J.Cancer 63670-674)。
对于转移性的疾病或辅助性的或原始的背景使用MABS可以选择性地避免与传统的癌症的化疗治疗相关的毒副作用问题。但是，由于许多药剂需要在杀死靶细胞之前内在化，因此出现了大问题。另外由于与非靶细胞的作用，在传递到位点时免疫毒素通常引起不可接受的毒性。
对于选定的药剂可替代的递送系统是基于合成脂质体的使用。脂质体最初描述于1974(Bangham等人，Methods Membr.Biol.11-68)。脂质体由一种或多种磷脂双层组成，它们排列于另一个含水空间的同轴环。已经将许多化合物(它们都是脂和水溶性的)包括癌症化疗剂，抗菌剂，酶，激素和核酸掺入到脂质体的水或脂相。在动物和人个体中含药的脂质体的行为已经形成了几种研究课题(Gregoriadis 1990，Immunil.Today 1189-97)。
因此，脂质体作为各种各样的应用目的包括生化和免疫测定，诊断的递送药剂的泡囊以及肠的和非肠道的应用的药物递送系统具有相当大的保障。不幸的是，由于在特定的时间或位点选择性地释放其内含物带来的困难而削弱了其应用的基础。
现在本发明提供了用于在特定的疾病位点或特定的时间或位点释放选定的药剂的方法，以及引入到所述方法的药物组合物，用于该方法的试剂盒和材料，所有这些为了探究上面提出的一些，优选的是所有问题。
根据本发明的第一个方面，提供了在预定的条件下释放一种药剂的方法，该方法包括下列步骤保护该药剂在脂质结构内，导致所构成的脂酶活性对预定的条件应答，将该脂质结构与构成的脂酶活性接触以便递送该药剂。
脂酶是指水解脂的一种酶，包括但不限于水解复合脂例如磷脂和糖脂的酶。
本文中使用的术语“构成的”是指定位的，制备的或显著地增加，即当满足预定的条件时脂酶活性开始显著地提高或增加。
已知有大量的天然存在的脂酶。例如许多革兰氏阳性和阴性细菌产生具有磷脂酶C(PLC)活性的酶。这些酶以不同的效率水解磷脂并且具有各种各样溶血的和致死的特性，通常这些特性使之不适合用于给活的个体给药。
一种代表性的酶是产气荚膜梭菌α-毒素(CPAT)。CPAT促进哺乳动物细胞的直接裂解，并且是至今描述的最毒的PLC(参见McDonel，J.L.(1986)pp 617-655“细胞毒素的药理学”Eds.Dorner&Drews，Pub.Pergamon Press，Oxford)。CPAT是含有370个氨基酸的肽。
优选的是，本发明使用的脂质结构包括限定一个核的磷脂膜。更优选的是脂质结构是脂质体。待释放的药剂根据本发明所述的精确的应用来选择，但是药剂的特性必须是可被脂结构保护的。
优选的是用于本发明的脂酶活性包括PLC活性，更优选的是源自于CPAT。以前未曾证明CPAT活性可针对脂质体；但是本发明的发明人已经证实CPAT具有显著的针对脂质体的活性。
优选的是本发明中应用的脂酶是通过将两种或三种成份结合构成的，因此由这些成份形成的产物的脂酶活性大于单个成份的活性的总和，或另一种可选的情况，凭借脂酶的定位在通常具有较低或没有脂酶活性的特定的位点构成了脂酶活性，脂酶以全酶或两种或多种成份的结合的形式存在，对于任一种情况，都与靶分子结合。
更优选的是，这些成份对应于或源自于一种活性脂酶全酶以便它们结合可恢复全酶脂酶的整个或部分活性，优选的是在特定的位点。这些成份可以都是蛋白质，但是该发明包括所有的系统，其中由于两种或多种成份的结合而加强，定位，或恢复脂酶活性，包括非蛋白质成份例如辅助因子。
最优选的是该成份来自于或包括CPAT。
CPAT的N-末端的三分之二与来自蜡质芽孢杆菌的磷脂酰胆碱-PLC共有序列同源性。已经证实N-末端重组的截短的CPAT(aa 1-249)保留了磷脂酰胆碱的水解活性，但是已经降低了鞘磷脂酶活性，并且既非溶血也非致死的。(Titball等人，1991.Infect.Immun.591872-1874)。含有CPAT的C-末端的三分之一(aa 247-370)的重组蛋白质没有鞘磷脂酶和溶血活性，并且对于鼠淋巴细胞是无毒的(Titball等人，1993，FEMS MicrobiologyLetter 11045-50)。已经证实当N-末端和C-末端重组蛋白加到一起时(“重新构建的CPAT”)能够恢复溶血活性(由体外鼠红细胞裂解检测估测)。
本发明的发明人已经证明重新构建的CPAT具有显著的针对脂质体活性。
本发明预定的条件要求该药剂仅在肿瘤或病原体的附近，或在分析物或DNA序列存在下或在其它合适的可检测的条件下被释放。
优选的是预定的条件的获得从原因上是指通过将至少一种脂酶成份或全酶缀合到靶分子而在特定位点获得脂酶活性，所述靶分子能够在预定的条件下与预定的靶特异性结合。合适的靶分子包括抗体，抗原，受体，配体和核酸探针或引物。
因此，所述条件的获得便利的是指(借助于特定的抗原-抗体结合，或核苷酸探针与特定的序列的退火或通过其它一些特定的物理方法)在预定的靶存在下脂酶活性的构成。之后将合适的脂结构例如脂质体加入到该系统有效地导致靶诱导的脂质体裂解。
因此，用于在预定的靶位点释放一种药剂的一个优选的实施方案中，靶分子是产生用于结合到靶位点的抗原上的一种抗体。该抗体缀合到第一脂酶成份以便该成份结合到该位点。将第二脂酶成份加入到该系统，并且结合到第一脂酶成份，以便在该系统中没有全部活性脂酶循环的情况下在该位点获得脂酶活性。向该系统中加入含有合适药剂的脂质体，以便使它们与构成的脂酶接触而裂解从而在该位点定位释放药剂。
应该注意到可将第二脂酶成份独立地加入，结合地，或作为脂质体的整合部分加入。
用于在预定的靶位点释放一种药剂的另一个优选的实施方案中，靶分子是产生用于结合到靶位点的抗原上的一种抗体。该抗体缀合到脂酶全酶以便该全酶结合到该位点。向该系统中加入含有合适药剂的脂质体，以便使它们与构成的脂酶接触而裂解从而在该位点定位释放药剂。
因此这些实施方案已经用于通过膜裂解酶活性的靶击递送而体内治疗疾病或确定疾病的位置。未结合的抗体成份缀合物可在加入第二成份之前从系统中清除，以便仅确保局部构成脂酶活性。然后可以通过加入含有调节疾病的化合物的脂质体获得特定的疾病细胞或生物体的切除。因此由于能够在肿瘤释放局部浓度高的化合物本发明在抗肿瘤中的应用提供了改善的致死指数，而且也可能提供有利的旁观者效应，其中在最接近肿瘤的位置携带非抗原的癌细胞也是化疗致死的对象。
合适的化合物包括报道分子，细胞毒性药物，淋巴因子，消炎剂，抗真菌剂，抗疟剂和抗击疾病感染的其它药剂，合成的寡核苷酸，核酸(例如质粒)等等，作为免疫毒素的其它的抗体，用于将非活性转化为活性的药物化合物的酶等等。根据待解决的问题，这些所使用的精确的化合物对本领域内技术人员而言是显而易见的。
在本发明的用于检测一个系统中抗原存在的第二个实施方案中，靶分子是缀合到第一脂酶成份上的一种抗原。将该抗原第一成份缀合物与抗真正的抗原的抗体混合，以便该抗体与缀合的抗原结合。结合的抗体的存在在空间上阻止了在第二脂酶成份存在下脂酶活性的构成。当在真正的抗原存在下形成抗体/抗原成份复合物时，抗体被真正的抗原隔离开并且与之结合。这意味着在第二脂酶成份存在下构成了脂酶活性。通过将含有合适的标记例如染料的脂质体加入到该系统可检测到脂酶活性(因此存在真正的抗原)。
因此该实施方案在体外具有作为用于检测生物学或其它分析物的同源性检测系统的用途。通过重组或生物学技术可将该抗原缀合到脂酶构成成份之一。
在本发明的用于检测一个系统中抗原存在的另一个实施方案中，靶分子是结合到第一脂酶成份或全酶上的一种抗体。将该抗体-脂酶缀合物结合到特定的抗原上，所述抗原已经通过直接结合到固相或通过借助于一种抗体或其它中间体分子与固相结合。在缀合物结合，并且在洗涤或洗脱过量的缀合物之后，通过加入含有合适的标记例如染料的脂质体检测抗原的存在。
另一种可用于检测一个系统中抗原存在的方法，也可以直接通过吸附或化学键合或借助于另一种抗体或结合剂间接地吸附到一种固相而将抗原吸附到该固相。然后加入含有整个脂酶或一种脂酶成份的抗体脂酶缀合物，如果需要随后加入第二脂酶成份，再加入含有合适的化合物的脂质体。
在可用于检测一个系统中特定的核苷酸序列存在或确定其位置的第三个实施方案中，将合适的互补探针吸附到一种或两种脂酶成份上，以便将一种或几种探针退火到该序列，引起在该位点形成脂酶活性。通过将含有合适的标记例如染料的脂质体加入到该系统可检测到脂酶活性(因此存在该序列)。
在可用于检测一个系统中特定的核苷酸序列的另一种方案中，可以直接通过吸附或化学键合或借助于互补的核苷酸序列或另一种抗体或结合剂间接地吸附到一种固相而将该核苷酸序列吸附到该固相。然后加入含有整个脂酶或一种脂酶成份的探针-脂酶缀合物，如果需要，随后加入第二脂酶成份，再加入含有合适的化合物的脂质体。
本发明也包括用于上述方法的材料。
在本发明的第二个方面，提供了能够与第二脂酶成份结合的第一脂酶成份，以便由所述成份形成的产物的脂酶活性大于单个成份的活性的总和。所述第一脂酶成份缀合到能够与预定的靶特异性结合的靶分子。
本发明也包括含有缀合到脂酶全酶或脂酶成份的靶分子，以及含有药物学活性化合物或能够转化为药物学活性分子的脂质体药物制剂。
本发明也包括用于上述方法的试剂盒。
因此在本发明的第三个方面，提供了用于上述方法的试剂盒，它包括能够与第二脂酶成份结合的第一脂酶成份，从而由该成份形成的产物的脂酶活性大于单个成份的活性的总和，所述的第一脂酶成份缀合到能够与预定的靶特异性结合的靶分子上，并且该试剂盒进一步包括第二脂酶成份。
优选的是该试剂盒进一步包括含有用于上述方法的合适的药剂的脂质体。
优选的是，该脂酶成份是上文中描述的CPAT全酶或N-末端重组CPAT和C-末端重组CPAT。
其它各种脂酶替代物可适用于本发明。这些替代物包括来自于牛和猪胰，蜜蜂毒液，Crotalus毒液的脂酶，以及包括来自于紫红链霉菌的磷脂酶B和来自于弧菌属和蜡质芽孢杆菌的磷脂酶C。本领域内技术人员也将明白作为本发明的药物制剂中的非人脂酶的替代物，可用人来源的脂酶可由或可选的，通过遗传工程技术改造的或修饰的类似于CPAT的非人的脂酶替代，以便逃脱被人免疫系统识别。
将两种或多种脂酶成份用于本发明的方法，或用于本发明的物质和材料中，可以改善这些脂酶成份的结合强度以便更快或更全面地重新构成酶活性。例如通过遗传工程手段或通过使用其本身相互结合的辅助成份而将脂酶成份连在一起可以达到上述目的。
因此可利用CPAT或重新构成的CPAT活性指导含有生物学活性制剂或可检测分子例如染料的合成脂质体的裂解，从而提供了用于靶击药物体内释放的原理或提供了用于体外同源性和不连续的检测系统的报道系统。
其它各种脂质体替代物可适用于本发明。本发明包括各种类型的脂质体。
现在仅为了说明的目的，参考下面实施例和附图描述本发明的方法。根据这些内容对本领域内技术人员而言其它实施方案也在本发明的范围内。
附图附

图1证实在实施例1描述的试验中纯化的重组CPAT(全酶)可以诱导脂质体的裂解。
附图2证实i)纯化的重组CPAT(全酶)，ii)重组N-CPAT；iii)重组C-CPAT和vi)混合的重组N-和C-CPAT抗脂质体的比较活性。试验是按照实施例2描述进行的。
附图3图解显示说明实施例3中体内抗癌方法。
附图3b图解显示类似于实施例3的体内抗癌方法，其中全酶与抗体缀合。
附图4图解显示在实施例5中描述的体外抗体介导的抗原检测方法。
附图5图解显示在实施例6中描述的体外核酸杂交检测方法。
附图6图解显示抗体脂酶与抗原在固相上的结合，随后脂质体裂解。
附图7图解显示抗体脂酶与核苷酸在固相上的结合，随后脂质体裂解。
实施例实施例1-通过重组CPAT全酶的脂质体的裂解利用含有羧基荧光素物质的脂质体检测纯化的重组CPAT(全酶)诱导脂质体裂解的能力，利用荧光测定方法评估裂解。利用浓度在1pM和1μM之间的CPAT在60分钟内检测羧基荧光素的释放。
结果显示于附图1，清楚地证明CPAT抗原诱导脂质体的裂解。
利用由Senior和Gregoriadis(1983)在脂质体技术上描述的方法制备含有5-(6)-羧基荧光素的鞘磷脂酶脂质体((Gregoriadis ed.)vol pp263-82，CRCPress，BocaRaton，Florida.)。将溶于氯仿中的鞘磷脂酶和β-油酰基-γ-胆固醇的混合物的一薄层(1∶1w/w，总量35.5毫克)在氮气中干燥并且加入羧基荧光素(20毫克)。将该混合物置于40℃水浴超声处理器中，于22℃保留1小时，然后超声处理(10×1分钟处理，循环之间0.5分钟，40℃；Heatsystems XL-200超声处理器，用19毫米的探针)，以便产生小的单层泡囊。利用凝胶过滤层析技术(Sephadex G-25；Pharmacia PD 10柱)，硼酸盐缓冲的盐水(BBS；0.2M偏硼酸钠，7.5g/l NaCl，1.8g/lCaCl2.2H2O，用硼酸盐将pH调节到7.5)作为洗脱缓冲液将游离的羧基荧光素与脂质体分离。收集含有脂质体的组分，并储存与4℃。
在BBS中洗脱脂质体，向2.5毫升体积的稀释的脂质体中加入25微升的酶。在37℃保温该混合物，利用在485nm处(10nm狭缝宽)发出光并且在520nm处(5nm狭缝宽)检测到发射的Perkin-Eimer L5-5B分光荧光测定计检测荧光。
向6-羧基荧光素包裹的鞘磷脂酶脂质体中加入产气荚膜梭菌α-毒素(磷脂酶C)导致6-羧基荧光素荧光依赖于时间增加。在检测的浓度范围内(参见附图1，10pM-10nm终浓度)荧光增加的速率与酶的浓度相关。在没有Ca2+的情况下，α-毒素(100pM)抗鞘磷脂酶脂质体的活性降低了4倍。
Cpa1-249(N-区域)和Cpa247-370(C-区域)对羧基荧光素递送的影响是单个区域的α-毒素(Cpa1-249和Cpa247-370)单个地保温和与含有6-羧基荧光素的脂质体一起保温。结果显示既不是单个的Cpa1-249也不是单个的Cpa247-370能够诱导鞘磷脂酶脂质体产生6-羧基荧光素荧光。但是，当Cpa1-249和Cpa247-370和鞘磷脂酶脂质体一起保温时，检测到荧光的增加。
实施例2-CPAT全酶和N-和C-片段的比较活性利用荧光测定术检测方法检测纯化的重组CPAT(全酶)，独立的重组N-和C-CPAT，和混合的重组N-和C-CPAT抗脂质体的比较活性。在各种情况下每种蛋白质的浓度是100pM。
显示于附图2的结果清楚地证明由结合的N-和C-CPAT降低脂质体的能力增强到相当于其各种单独的活性的总和。
实施例3-体内递送化疗剂的方法附图3所述提供了体内抗癌症方法。在该方法中将发明用于将化疗剂靶击到癌症细胞。将C-CPAT(较小的CPAT片段)缀合到一种特异于肿瘤(A)的抗体，进行体内给药。将缀合的抗体结合到肿瘤位点(B)，以互补(N-CPAT)片段给药，从而导致在靶细胞表面(C)形成脂酶活性。将含有化疗剂(阿霉素)的脂质体与N-CPAT同时，或在其之后给药。在肿瘤处保留的CPAT活性介导脂质体的裂解，从而获得高局部浓度的化疗剂(E)。
在另一种可选的方法，将脂质体用于将消炎药或生物学应答调节剂递送到提供抗原的细胞，或者含有反应性的渗滤疾病淋巴细胞的损坏的组织。
将会认识的实施例3的通用方法在治疗剂领域内具有广泛的用途。
实施例4-体内遗传修饰细胞的方法下面提供用于修饰细胞的遗传特性的体内方法。该方法类似于实施例3描述的方法，不同的是用脂质体将抗增殖的合成寡核苷酸递送到增殖细胞(内容表皮细胞)。
将会认识到实施例4的方法可用于治疗许多遗传基础上的失调例如，cardiorestinosis，并且对许多依赖于将新遗传信息递送到各种疾病的细胞的治疗或试验方案也是有价值的。
实施例5-体外同系物分析物检测方法附图4提供了显示抗体介导的体外分析物检测方法。
首先将分析物缀合到N-CPAT，将分析物/N-CPAT缀合物与抗结合到其上的分析物的抗体混合。将该复合物与C-CPAT和在怀疑含有分析物的系统中的含有报道分子的脂质体混合。在没有分析物的情况下，抗体从空间上阻止了CPAT活性的构成，脂质体保持完整(A)。在分析物存在的情况下，将抗体与N-CPAT复合物隔离，因此允许构成CPAT活性和脂质体裂解，从而释放报道分子(B)。
将会认识到所述检测系统可广泛地应用于诊断和研究领域。
实施例6-体外核酸杂交检测应用显示于附图5所示的探针，提供了体外核酸序列检测方法。
能够与待检测的序列杂交，以致于它们互相邻接的核酸分子(探针)缀合到N-CPAT和C-CPAT。将该缀合物加入到被怀疑含有所述序列的系统中。在该序列存在下，出现探针的杂交，从而使N-CPAT和C-CPAT趋向于接近并且恢复CPAT活性。脂质体的裂解标志着活性的恢复，并且释放可检测的分子例如染料。
将会认识到所述检测系统可用于同源性检测分析(没有固相或分离步骤)和间断检测分析(其中靶序列与固相结合)。
附图7说明体外核酸检测分析。核苷酸序列1直接或间接吸附到固相2。然后将含有脂酶4(是整个脂酶或一个成份)的探针脂酶成份3加入，如果需要随后加入第二脂酶成份。探针脂酶成份3也含有一个短的核苷酸序列5，它与核苷酸序列1的一部分互补。将脂质体6加入到该系统，与探针脂酶成份3接触而裂解，从而释放脂质体的内含物。
含有产气荚膜梭菌α-毒素N-末端区域的脂酶对应于具有磷脂酶活性的区域，通常它可以包括1-260的残基，它依次包括该范围内的一些或所有氨基酸，C-末端提供脂质体裂解活性，通常可以包括240-370的残基，它依次包括该范围内的一些或所有氨基酸。
下面的试验方法说明了利用脂酶缀合的抗体结合脂质体包裹的药物杀死癌症细胞。
将抗-CEA抗体与缀合的产气荚膜梭菌磷脂酶C全酶一起体外靶击到HeLa细胞。在抗体脂酶缀合物结合到细胞之后，去除过量的缀合物，加入药物脂质体。抗体-缀合物磷脂酶C打破脂质体，释放胞毒性药物，导致杀死癌症细胞的功能增强。设置合适的对照以便识别由于药物脂质体的非特异性细胞内吞作用或脂酶活性直接作用于癌症细胞引起的背景细胞死亡。
磷脂酶与抗-CEA抗体的缀合从Scottish抗体生产单位(Carluke，Scotland)获得抗-CEA抗体。按照文献描述生产重组产气荚膜梭菌磷脂酶C。利用Sulfo-MBS(Pieco和Warriner，Chester，England)按照制造商的指示，将抗-CEA抗体缀合到磷脂酶C。采用透析方法去除未缀合的抗体或磷脂酶C。
利用抗-CEA磷脂酶C缀合物与药物脂质体一起给药增强了杀死HeLa细胞的能力将溶于DMEM+10％胎牛血清中的HeLa细胞100毫升置于96孔组织培养平板的各个孔中，使细胞生长到半融合。去除生长培养基，用100毫升的于DMEM+10％FCS中稀释的各种浓度的抗体-酶缀合物替换。在37℃使缀合物与细胞结合3小时。在该保温之后，通过用DMEM+10％FCS洗涤三次去除未结合的抗体-酶缀合物。洗涤之后将于DMEM+10％FCS中稀释的各种浓度的DaunoXomes(Nexstar药物有限公司，英国，剑桥)加入到孔中，在37℃连续保温16-24小时。利用Cellititer 96孔细胞增殖检测方法(Promega，Southampton，英国)估测存活的细胞数。
以1∶100稀释的脂质体，没有磷脂酶C或缀合的抗体时存活的细胞数降低小于50％。加入约10ug/ml缀合物导致存活的细胞数降低了大于50％，而加入磷脂酶C没有影响脂质体诱导的存活细胞数的降低。如果将脂质体与磷脂酶C或缀合的抗体一起加入到细胞，那么没有获得存活细胞数降低，表明溶液中脂质体被破坏。
权利要求
1.在预定的条件下释放一种药剂的方法，包括下列步骤保护该药剂在脂结构内，导致应答预定的条件而构成脂酶活性，将该脂结构暴露于构成的脂酶活性，以便释放该药剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过将两种或多种成分结合构成酯酶活性，从而由这些成分形成的产物的酯酶活性大于单个成分的活性的总和。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中至少酯酶成分之一缀合到能够特异性结合到预定的靶的具靶击力的分子上。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中通过特定的抗原-抗体的结合或核苷酸探针与特定的核苷酸序列退火而检测所述条件的获得。
5.用于在一个系统中释放药剂到靶位点的方法，它包括权利要求1-4任一项所述的方法，其中将至少一种酯酶成分缀合到具靶击力的分子，加入到所述系统，以便结合到靶位点，将第二酯酶成分加入到该系统，并且与第一成分结合以便在该位点构成酯酶活性，将含有合适药剂的脂质结构加入到该系统以便它们通过接触构成的酯酶活性而裂解，从而在该位点局部释放药剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在加入第二成分之前从该系统中清除未结合的靶分子-成分缀合物。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中具靶击力的分子是一种抗体。
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其中靶位点是肿瘤，患病细胞或病源生物体。
9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其中药剂含有下列的一种或多种报道分子，化疗细胞毒性药物，淋巴因子，消炎剂，抗真菌剂，抗疟疾药，合成寡核苷酸或质粒
10.包括根据权利要求5-9任一项所述的方法的体内递送化疗剂的方法，其中药剂是化疗剂。
11.包括根据权利要求5-9任一项所述的方法的体内递送消炎剂的方法，其中药剂是消范剂。
12.包括根据权利要求5-9任一项所述的方法的修饰细胞遗传特性的方法，其中药剂是合成寡核苷酸或质粒。
13.包括根据权利要求2-4任一项所述的方法的用于检测一个系统中特定的核苷酸序列存在或确定其位置的方法，其中将与所述序列互补的探针吸附到脂酶成份之一上，向该系统中加入该酯酶成分以便在该序列存在下将一种或几种探针退火到该序列，引起在该位点构成脂酶活性，通过将含有脂质结构的药剂加入到该系统并且裂解可检测到脂酶活性。
14.包括根据权利要求2-4任一项所述的方法的用于检测一个系统中抗原存在的方法，其中将该抗原与至少一种酯酶成分缀合，该缀合物与制备用于抗该抗原的抗体混合，以便结合，向该系统中加入该酯酶成分以便存在真正的抗原时抗体被真正的抗原隔离开，以便构成酯酶活性，通过加入并且裂解含有药剂的脂质结构可检测到构成的脂酶活性。
15.根据权利要求1-14任一项所述的方法，其中脂质结构包括限定一个核的磷脂膜。
16.根据权利要求15所述的方法，其中酯酶结构是脂质体。
17.根据权利要求1-16任一项所述的方法，其中酯酶活性包括磷脂酶C活性。
18.根据权利要求17所述的方法，其中酯酶活性包括上文中描述的CPAT。
19.根据权利要求2-18任一项所述的方法，其中酯酶成分对应于或来自于一种活性酯酶全酶。
20.根据权利要求19所述的方法，其中酯酶成分是上文中描述的N-末端重组CPAT和C-末端重组CPAT。
21.用于权利要求2-20任一项所述的方法中所用的酯酶成分，能够与第二酯酶成分结合，以便由这些成分形成的产物的酯酶活性大于单个成分的活性的总和，将所述的第一酯酶成分缀合到能够特异性结合到预定的靶的具靶击力的分子。
22.用于权利要求2-20任一项所述的方法的试剂盒，含有能够与第二脂酶成份结合的第一脂酶成份，从而由这些成分形成的产物的酯酶活性大于单个成分的活性的总和，所述第一脂酶成份缀合到能够特异性结合到预定的靶的具靶击力的分子，并且进一步含有第二脂酶成份。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，进一步包括含有药剂的脂质结构，
24.CPAT在裂解脂质体中的应用。
25.如上所述N-末端重组CPAT，和C-末端重组CPAT在裂解脂质体中的应用。
26.基本上如上所述以及参照附图3和实施例3所述的体内抗癌症方法。
27.基本上如上所述以及参照附图4和实施例5所述的体外抗体介导的抗原检测方法。
28.基本上如上所述以及参照附图5和实施例6所述的体外核酸杂交检测方法。
29.一种组合物，包括与脂酶全酶或脂酶成份缀合的具靶击力的分子；一种或多种包含于脂质结构中的药剂。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中脂质结构是脂质体。
31.根据权利要求29和30任一项所述的组合物，其中该药剂是一种药物学活性化合物或几种药物学活性化合物。
32.根据权利要求29和30任一项所述的组合物，其中该药剂能够转化为一种或几种药物学活性化合物的化合物。
33.包括权利要求1所述方法的用于在一个系统中的靶位点释放一种药剂的方法，其中将脂酶全酶缀合到具靶击力的分子，加入到所述系统，以便结合到靶位点，将含有合适药剂的脂质结构加入到该系统以便它们通过接触构成的酯酶活性而裂解，从而在该位点局部释放药剂。
34.根据权利要求33所述的方法，其中脂质结构是脂质体，
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中药剂含有下列的一种或多种报道分子，化疗细胞毒性药物，淋巴因子，消炎剂，抗真菌剂，抗疟疾药，合成寡核苷酸或质粒，其它的活性抗体如免疫毒素，用于将转化非活性药物化合物为活性药物化合物的酶。
36.根据权利要求9所述的方法，其中所述药剂还含有下列的一种或多种其它的活性抗体如免疫毒素，用于将转化非活性药物化合物为活性药物化合物的酶。
37.用于权利要求33-35任一项所述的方法中的试剂盒。
38.基本上如上所述以及参照附图6所述的体外抗体介导的检测方法。
39.基本上如上所述以及参照附图7所述的体外核酸检测方法。
40.包括根据权利要求2-4任一项所述的方法的用于检测一个系统中特定的核苷酸序列存在或确定其位置的方法，其中核苷酸序列直接或间接吸附到固相，将与所述序列互补的探针吸附到至少一种脂酶成份上，向该系统中加入该酯酶成分以便在该序列存在下将一种或几种探针退火到该序列，引起在该位点构成脂酶活性，通过加入并且裂解含有药剂的脂质结构检测到构成的脂酶活性。
41.包括根据权利要求2-4任一项所述的方法的用于检测一个系统中抗原存在的方法，其中将该抗原直接或间接吸附到固相，将至少一种脂酶成份缀合到抗体；将该缀合物加入到所述系统，随后加入含有药剂的脂质结构。
全文摘要
在预定的条件下释放一种药剂(例如化疗剂)的方法,包括下列步骤:保护该药剂在脂质结构(例如脂质体)内,通过两种或多种成分(例如重组N－或C－末端产气荚膜梭菌α－毒素片段)的结合导致构成脂酶活性,在预定的条件下将这些成分之一缀合到与靶(例如肿瘤抗原)结合的具靶击力的分子(例如抗体)。将该脂质结构与构成的脂酶活性接触以便释放该药剂。也公开了用于该方法的材料和试剂盒。
文档编号A61K9/127GK1182372SQ9619343
公开日1998年5月20日 申请日期1996年2月21日 优先权日1995年2月22日
发明者R·W·蒂巴尔, F·J·卡尔 申请人:英国国防部