专利名称：通过鼻内接种il－12加强免疫性的制作方法
相关申请本申请是于1998年3月5日递交的美国申请No.09/035,188的部分继续，前一申请通过在此引述而全文引入本文。
背景技术：
粘膜表面是细菌和病毒入侵的主要门户，因此该表面构成了宿主的防御体系的第一界限。这样，加强粘膜免疫性的免疫接种策略对于阻止感染性疾病具有实际的意义。但是大多数非肠道给药的疫苗在诱导最佳粘膜免疫性时仅仅部分有效。因此，需要能够加强粘膜免疫性和以安全，非入侵的方式释放的佐剂。
发明概述如本文所述，鼻内白细胞介素(IL-12)治疗可以有效地加强抗原特异性的免疫应答并且加强粘膜疫苗的免疫接种策略。因此，本发明涉及加强和/或诱导宿主(例如哺乳动物，包括人)对病原体的免疫应答(例如全身的，粘膜的)，它包括以有效量的IL-12和病原体的抗原(例如蛋白质，碳水化合物，脂类，重组DNA，整个生物体，毒素，有机分子)给宿主鼻内给药。如本文所述，免疫应答是抗原特异性的。另外，免疫应答导致Th1型的细胞因子应答(例如干扰素-γ)和/或体液应答(例如IgG2a,IgG2b,IgG3)的加强表达。
在一个实施方案中，本发明涉及加强宿主对病原体的免疫应答的方法，包括以有效量的IL-12和病原体的抗原给宿主鼻内给药。在另一个实施方案中，本发明涉及诱导宿主对病原体的免疫应答的方法，包括以有效量的IL-12和病原体的抗原给宿主鼻内给药。
在一个特定的实施方案中，本发明涉及诱导宿主对粘膜病原体的免疫应答的方法，它包括以有效量的IL-12和病原体的抗原给宿主鼻内给药。
本发明还包括诱导宿主对病原体的Th1类似的免疫应答的方法，包括它包括以有效量的IL-12和病原体的抗原给宿主鼻内给药。
本发明还涉及加强宿主对病原体的粘膜免疫应答的方法，包括它包括以有效量的IL-12和病原体的抗原给宿主鼻内给药。
如本文所述的以IL-12鼻内给药有效地加强粘膜和全身腔室中抗原特异性的应答的结果，证明以IL-12鼻内给药可用于获得对抗病原体的免疫接种策略有效的潜在的疫苗佐剂，例如粘膜病原体。
附图简述附
图1A-1C是显示以IL-12鼻内给药对呼吸道粘膜免疫应答的作用的条块图；数据以每组4个小鼠的平均光密度(O.D.)+/-SEM表示；以对应于滴定曲线的线性部分的稀释度测试支气管肺泡的灌洗(对于IgG1和IgA1∶64，对于IgG2a为1∶8)。
附图2A-2E是血清稀释的倒数的O.D.405nm的图，显示鼻内IL-12给药对全身抗体应答的作用；实心标记代表用DNP-OVA+IL-12注射的动物，空心标记代表用DNP-OVA+磷酸缓冲的盐水(PBS)的动物；各个线代表抗体与单个小鼠的结合。
附图3A-3B是显示鼻内IL-12给药对总Ig水平的作用的条块图；该数据以每组4个小鼠的平均光密度(O.D.)+/-SEM表示；以对应于滴定曲线的线性部分的稀释度测试血清(对于IgG1为1∶6400，对于IgG2a为1∶200)。
附图4A-4F是显示IL-12非肠道和鼻内给药对粪便粘膜应答的作用的条块图；所显示的数据代表第21天时对IgA的抗体应答和第28天时对IgG异型的应答，各个反应性应答的峰，该数据以每组4个小鼠的平均光密度(O.D.)+/-SEM表示。
附图5A-5B是血清稀释的倒数的O.D.405nm的图，显示鼻内IL-12给药对全身抗体应答的作用；在0天以纯化的来自于流感病毒的血凝素和神经氨酸酶(HANA)免疫接种小鼠和以IL-12(闭合的三角)或磷酸缓冲盐水(PBS)载体(开口的环)在0,1,2和3天鼻内治疗的小鼠；采用HANA-包被的微滴板异型-特异性的ELISA测定第14天时血清抗-HANA抗体的水平；各条线代表来自于单个小鼠的抗体的结合。
附图6A-6B是血清稀释的倒数的O.D.405nm的图，显示鼻内IL-12给药对全身抗体应答的作用；在0天以HANA免疫接种小鼠和以IL-12(闭合的三角)或PBS载体(开口的环)在0,1,2和3天鼻内治疗的小鼠；在14天时加强接种；采用HANA-包被的微滴板异型-特异性的ELISA测定第28天时血清抗-HANA抗体的水平；各条线代表来自于单个小鼠的抗体的结合。
附图7A-7B是血清稀释的倒数的O.D.405nm的图，显示鼻内IL-12给药对全身抗体应答的作用；在0天以HANA免疫接种小鼠和以IL-12(闭合的三角)或PBS载体(开口的环)在0,1,2和3天鼻内治疗的小鼠；在14和28天时加强接种；在第28天时小鼠还接收IL-12或载体；在第35天时杀死小鼠；采用HANA-包被的微滴板通过ELISA分析BAL体液的抗-HANA水平；各条线代表来自于单个小鼠的抗体的结合。
附图8A-8B是显示鼻内IL-12给药对亚单位流感疫苗的早期全身抗体应答在影响。在0天时以H1N1亚单位流感疫苗免疫接种小鼠，以IL-12(闭合的三角)或PBS载体(开口的环)在0,1,2和3天鼻内治疗的小鼠。采用H1N1-包被的微滴板通过异型-特异性的ELISA测定第14天时血清抗-H1N1抗体的水平；各条线代表来自于单个小鼠的抗体的结合(每组4个小鼠)。以疫苗和IL-12免疫接种的小鼠和以疫苗和PBS载体免疫接种的小鼠之间的结合的差异是显著的，对于IgG2a是p＜0.05。
附图9A-9E是显示鼻内给药的IL-12给对亚单位流感疫苗的晚期全身抗体应答造成的影响。在0天以H1N1亚单位流感疫苗免疫接种小鼠，以IL-12(闭合的三角)或PBS载体(开口的环)在0,1,2和3天鼻内治疗的小鼠；在14和28天时加强接种；在第28天时小鼠还接收IL-12或载体；在第35天时采用H1N1-包被的微滴板通过异型特异性-ELISA测定血清抗-H1N1抗体水平；各条线代表来自于单个小鼠的抗体的结合(每组4个小鼠)。以疫苗和IL-12免疫接种的小鼠和以疫苗和PBS载体免疫接种的小鼠之间的结合的差异是显著的，对于IgG2a，总Ab和总Ig是p＜0.05。
附图10A-10D是显示鼻内IL-12给药对呼吸道粘膜应答的影响的图。在0天以H1N1亚单位流感疫苗免疫接种小鼠，以IL-12或PBS载体在0,1,2和3天鼻内治疗的小鼠；在14和28天时加强接种；在第28天时小鼠还接收IL-12或载体；在第35天时杀死小鼠；采用H1N1-包被的微滴板通过ELISA分析BAL体液的抗-H1N1抗体水平；各条线代表来自于单个小鼠的抗体的结合(每组4个小鼠)。以疫苗和IL-12免疫接种的小鼠和以疫苗和PBS载体免疫接种的小鼠之间的结合的差异是显著的，对于IgG2a，总Ab和IgA是p＜0.05。
附图11A-11D是显示流感亚单位疫苗+IL-12共给药保护小鼠免受亚序列流感病毒感染的图。以H1N1亚单位疫苗免疫+IL-12(闭合的三角)，疫苗+PBS载体(开口的环)，单独的IL-12(开口的菱形)或单独的PBS载体(开口的方块)免疫接种小鼠。然后在4-5星期后所有的小鼠(每组8个)用103pfu(A)或2×103pfu(B)的A/PR/8/34流感病毒攻击所有小鼠(每组8个)。每天监控小鼠的死亡率和重量的损失。以疫苗和IL-12免疫接种的小鼠和以疫苗和PBS载体免疫接种的小鼠之间的成活性差异是显著的，p＜0.05。
附图12A-12B是显示IL-12诱导的抗B细胞介导的流感病毒感染的保护作用的图。以H1N1亚单位疫苗免疫+IL-12(闭合的三角)，疫苗+PBS载体(开口的环)，或单独的PBS载体(开口的菱形)免疫接种小鼠μMT。用PBS载体预处理野生型(WT)小鼠(开口的方块)。然后在6-7星期后所有的小鼠(每组8个)用103pfu的A/PR/8/34流感病毒攻击。每天监控小鼠的死亡率和重量的损失。
附图13是显示从以亚单位流感病毒+IL-12免疫接种小鼠被动转移的血清授予的抗病毒攻击的保护作用。从以H1N1亚单位流感疫苗+IL-12(闭合的三角)，疫苗+PBS载体(开口的环)，或单独的PBS载体(开口的方块)免疫接种小鼠收集血清。在无菌的PBS中以1∶10稀释储存的血清并且以0.1毫升/小鼠的剂量鼻内注射。然后在5小时以后将所有的小鼠(每组7-8个)用103pfu的A/PR/8/34流感病毒攻击。以疫苗和IL-12免疫接种的小鼠和以疫苗和PBS载体免疫接种的小鼠之间的成活性差异是显著的，p＜0.05。
附图14A-14B是显示从以亚单位流感病毒+IL-12免疫接种小鼠被动转移的鼻内BLA液体授予的抗病毒攻击的保护作用。从以H1N1亚单位流感疫苗+IL-12(闭合的三角)，疫苗+PBS载体(开口的环)，或单独的PBS载体(开口的方块)免疫接种小鼠收集BLA体液。然后给所有的小鼠(每组8个)用储存的BLA体液和2×103pfu的A/PR/8/34流感病毒接种。以疫苗和IL-12免疫接种的小鼠和以疫苗和PBS载体免疫接种的小鼠之间的成活性差异是显著的，p＜0.05。
发明的详细描述如本文所述，已经检查了以半抗原-载体抗原免疫接种的小鼠的全身性和粘膜细胞因子和抗体生产。结果显示鼻内IL-12给药在治疗的小鼠的脾脏和肺诱导Th1类似的细胞因子和抗体方式。结果证明鼻内IL-12接种是影响粘膜和全身性免疫性的强有力的手段。
因此，本发明涉及加强和/或诱导宿主抗病原体(一个或多个)的免疫性的方法，包括以有效量的IL-12和病原体的抗原(例如粘膜病原体)给宿主鼻内给药。本发明的方法可用于加强哺乳动物宿主的对抗原的免疫应答，例如灵长类动物(例如人)，鼠，猫，犬，牛或猪宿主。
如本文所述，术语“加强”和/或“加强”是指增强对病原体的现有的免疫应答。该术语也是指对病原体的(启动，诱导)免疫应答的开始。
用于本发明方法的抗原(一个或多个)诱导(或抗原从……获得)，但是不限于蛋白质或其片段(例如蛋白水解片段)，肽(例如合成的肽，多肽)，糖蛋白，碳水化合物(例如多糖)，类脂，糖脂，半抗原偶合物，重组DNA，整个生物体(杀死或减毒)或其部分，毒素和类毒素(例如破伤风，百日咳，霍乱)和/或有机体分子。用于本发明的特定的抗原的例子包括从流感病毒获得或衍生的血凝素和神经氨酸酶。
从各种各样的病原体或有机体，例如细菌(例如芽孢杆菌，B组链球菌，包特菌属，利斯特，炭疽芽孢杆菌，肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，流感嗜血菌)，病毒(例如肝炎，风疹，脊髓灰质炎病毒，人免疫缺陷病毒，流感病毒，副流感病毒，呼吸道合胞体病毒)，分枝杆菌(结核分枝杆菌)，寄生虫(利什曼虫，血吸虫，Tranpanosomes，弓形虫属，肺囊虫属)和真菌(例如念珠菌属，隐球菌属，球孢子菌属，曲霉属)，可以获得或衍生出抗原，在宿主中抗这些抗原的免疫应答是令人满意的。利用本领域内技术人员已知的技术可以获得病原体的抗原。例如，可以直接从病原体分离(纯化，基本上纯化)抗原，利用化学合成抗原衍生或利用重组方法可以获得抗原。另外，可以从商业途径获得抗原。用于本发明的合适的抗原是包括至少一个B和/或T细胞抗原表位(例如T辅助细胞或胞溶性T细胞抗原表位)的一种。用于本发明组合物的其它合适的抗原可以通过本领域内技术人员已知的方法测定。
IL-12是近来鉴定的异源二聚体细胞因子，具有75kDa的分子量并且由二硫桥键的40kDa和35kDa亚单位组成。它是由提供抗原的细胞例如巨噬细胞和树突细胞产生的并且结合到活化的T,B和NK细胞上的受体[Desai,B.B.,等人，免疫学杂志，148:3125-3132(1992)；Vogel,L.A.,等人，国际免疫学，8:1955-1962(1996)]。它具有几个作用，包括1)加强的T序列和NK细胞的增殖，2)提高的T细胞，NK细胞和巨噬细胞的胞溶性活性，3)IFN-γ生产的诱导和以最小的程度诱导TNF-α和GM-CSF和4)Th1细胞的活化[Trinchieri,G.,等人，血液，84:4008-4027(1994)]。已经证明IL-12是在Th1克隆的增殖的重要的共同刺激剂(Kennedy等人，欧洲免疫学杂志24:2271-2278,1994)和导致当鼻内给药时血清中IgG2a抗体的产生增加[Morris,S.C.等人，免疫学杂志152:1047-1056(1994)；Germann,T.M.等人，欧洲免疫学杂志25:823-829(1995)；Sher,A.等人，美国科学院年报795:202-207(1996)；Buchanan,J.M.等人，国际免疫学杂志，7:1519-1528(1995)；metzger,D.W.等人，欧洲免疫学杂志27:1958-1965(1997)]。IL-12鼻内给药也可以临时降低IgG1抗体的产生[Morris,S.C.等人，免疫学杂志152:1047-1056(1994)；McKnight,A.J.免疫学杂志，152:2172-2179(1994)；Buchanan,J.M.等人，国际免疫学杂志，7:1519-1528(1995)]，表明抑制Th2应答。IL-12的纯化和克隆公开于PCT申请公开号92/05256和WO90/05147，欧洲专利公开号322,827(鉴别为“CLMF”)。
如本文所述，“白细胞介素-12”和“IL-12”是指白细胞介素12蛋白质，它的单个的亚单位，它的单个的亚单位的多聚体，IL-12的功能片段，和“白细胞介素-12”和“IL-12”的功能等同物和/或类似物。如本文所述，IL-12的功能片段是当鼻内给药时，调节抗宿主的抗原的免疫应答的片段。还如本文定义的，“白细胞介素-12”和“IL-12”的功能片段或等同物包括修饰的IL-12蛋白质，以便获得的IL-12的生产具有本文所述的IL-12的活性(例如当鼻内给药时加强免疫应答的能力)。“白细胞介素-12”的功能等同物或片段也包括核酸序列(例如DNA,RNA)和其部分，它编码本文所述的具有IL-12功能或活性的蛋白质或多肽(例如当鼻内给药时加强免疫应答的能力)。另外，该术语包括通过遗传密码的简并编码相似的肽基因的产物如IL-12的核苷酸序列并且具有本文描述的IL-12的活性。例如，“白细胞介素-12”和“IL-12”的功能等同物包括含有“静止”密码子替代的核苷酸序列(例如编码一个氨基酸的密码子替代编码相同氨基酸的另一个密码子)的核苷酸序列或含有“静止”氨基酸替代的一个氨基酸序列(例如，一个酸性氨基酸替代另一个酸性氨基酸)。
适用于本发明方法的IL-12可以从各种各样的来源获得或利用已知的技术合成。例如，IL-12可以从天然来源(例如哺乳动物，例如人来源)纯化(分离，基本上纯化)，由化学合成生产或通过重组DNA技术产生。另外，与本发明一起使用的IL-12可以从商业途径获得。
在本发明的方法中以有效量的IL-12鼻内给药，该量是诱导和/或加强对宿主的抗原的免疫应答的量。尤其是，“有效量的IL-12”是当以抗原给宿主鼻内给药时，相对于当有效量的IL-12不是鼻内给药宿主时对宿主的免疫应答而言，加强对宿主的抗原的如本文所述的免疫应答的量。就是说，“有效量”的IL-12是当以抗原鼻内给药时，相对于如果IL-12不是以IL-12鼻内给药时产生的对抗原的免疫应答而言加强本文所述的对抗原的免疫应答的量。
IL-12和/或抗原可用于作为预防疫苗或治疗疫苗给药。即在宿主中出现和/或显露病原体的作用之前(抑制)或之后(治疗)以IL-12给药。因此以IL-12和/或抗原给宿主给药，它显示由从其获得或衍生抗原的病原体引起的疾病状态，或没有显示由由从其获得或衍生抗原的病原体引起的疾病状态。因此，在宿主中疾病状态显露之前或之后以IL-12和/或抗原给宿主给药，可以导致由从其获得或衍生抗原的病原体引起的疾病状态的启动的抑制，减轻或去除或延迟。
如本文所述，IL-12和抗原鼻内给宿主给药。可以使用鼻内给药的常规途径。例如，可以使用透过表皮或粘膜衬里(例如将IL-12和/或抗原利用鼻的合剂给药；将IL-12和/或抗原利用滴眼剂给眼睛给药，其中IL-12和/或抗原流到鼻腔)。另外，可以将IL-12和抗原与其它成分或生物学活性试剂例如佐剂(例如胶)，药物学可接受的表面活性剂(例如甘油)，脂质体，赋形剂(例如乳糖)，载体，稀释剂和媒体一起给药。如果需要，也可以加入甜味剂，香味剂和/或增色剂。
此外，在其中抗原是蛋白质(肽)的实施例，IL-12和/或抗原可以以宿主体内表达的多聚核苷酸编码的多肽给药。例如IL-12或抗原可以利用活的载体给药宿主，其中含有IL-12和抗原核苷酸序列的活载体在其中IL-12和/或抗原可以体内表达的条件下鼻内给药。也可以用编码和体内表达抗原的载体与IL-12蛋白质和/或肽或者与编码和体内表达IL-12蛋白质的载体一起鼻内注射到宿主。含有编码抗原和IL-12蛋白质的序列的单个载体也可用于本发明的方法。
几个表达载体系统是商业上可获得的或可以用根据重组DNA和细胞培养技术再生产。例如，载体系统例如酵母或疫苗病毒表达系统，或病毒载体可用于该方法和本发明的组合物(Kaufman,R.J.,A细胞和分子生物学方法杂志2:221-236(1990))。利用裸露的质粒或DNA，和囊包于靶脂质体或红细胞血影的克隆的基因的其它技术可用于将IL-12多聚核苷酸导入到宿主(reidman,T.,科学，244:1275-1281(1991)；Rabinovich,N.IL，等人，科学，265:1401-1404(1994))。利用遗传工程技术可以完成表达载体的构建和将载体和核酸转移到各种宿主细胞，如在类似于分子克隆和现在的分子生物学方案手册中描述的，在此可以引入作为参考，或利用商品试剂盒(Sambrook,J.,等人.,分子克隆，冷泉港出版社，1989；Ausubel,F.M.,等人.,现在的分子生物学方案，Greene出版社和Wile□Interscience,1989)可以完成。
如本文所述，以IL-12和抗原给宿主体内给药可以加强受体宿主的免疫应答。例如，本发明涉及诱导对宿主的病原体的Th14类免疫应答的方法，包括以有效量的IL-12和病原体的抗原给宿主鼻内给药。本发明也涉及加强对宿主的病原体的粘膜的免疫应答的方法，包括以有效量的IL-12和病原体的抗原给宿主鼻内给药。本文描述的方法可以导致IFNγ的表达加强。另外可以诱导和/或加强宿主的体液免疫应答，导致IgG2a,IgG2b和/或IgG3抗体的表达加强。免疫应答可以是抗原特异性的。
在宿主中加强对抗原的免疫应答的方法中，以有效量的IL-12给宿主体内给药，该量是加强和/或诱导宿主对抗原的免疫应答和导致宿主的条件改善的量(即，抑制，减轻或去除由从其获得或衍生抗原的病原体存在下引起的疾病或紊乱)。用于加强宿主中对抗原的免疫应答的IL-12的量将根据各种各样的因子进行变化，包括宿主的大小，年龄，体重，总的健康，性别和食料，给药分时间，疾病状态的持续时间或特定的性质。IL-12的合适的剂量范围通常每千克体重约0.5微克到约150微克。在一个实施方案中，剂量范围是从每千克体重约2.75微克到约100微克。在另一个实施方案中，剂量范围是从每千克体重约5微克到约50微克。从体外衍生的剂量应答曲线推知有效的剂量。
在本发明的方法中，将有效量的IL-12与抗原一起鼻内给药。即，在相对于以抗原免疫接种宿主的相近的时间以IL-12给药，以便相对于没有以IL-12免疫接种而言给宿主对抗原的免疫应答进行诱导或加强。因此，在免疫接种之前或优选地刚好在免疫接种之前，在免疫接种的时间(即皮下)；或在免疫接种之后(随后)将IL-12鼻内给药。另外可以在用抗原免疫接种，随后在抗原免疫接种之后以IL-12随后给药之前将IL-12鼻内给药。
如本文所述，鼻内和以非侵入的方式给药IL-12重新将免疫系统的粘膜腔室指导到Th1类型的细胞因子和抗体发布情况。如本文所述IL-12的体内释放调节在免疫系统的远缘全身的腔室中细胞因子和抗体的表达方式。
用DNP-OVA+IL-12鼻内免疫接种的小鼠显示在以24小时时表示的最大表达之后6小时肺中加强的IFN-γmRNA水平。在脾脏中在IL-12给药之后IFN-γmRNA水平有类似的增加。IFN-γTh性别亚型的潜在的免疫调节剂和其效应子的功能(Trinchieri,G.,等人，免疫学研究146:423431(1995)；Trinchieri,G.,今天的免疫学，14:335-338(1993))。特异性地说，已经证明IFN-γ激活巨噬细胞鼻腔调节异型转变为IgG2aand IgG3抗体的产生，它是类型免疫应答的特征[Snapper,C.M.,等人，科学，236:944～947(1987)；Snapper,C.M.,等人，免疫学杂志140:2121-2127(1988)；Finkelman,F.D.,等人，免疫学杂志140:1022-1027(1988)]。类似地，T-细胞应答的重要的负调节剂是白细胞介素-10[IL-10)[Meyaard,L.,等人。免疫学杂志，156:2776-2782(1996)]。IL-10主要是由T细胞和单核细胞产生的并且通过其在提供抗原的细胞的作用发挥调节作用[Fiorentino,D.F.,等人，免疫学杂志146:3444-3451(1991)；Ding,L.,等人，免疫学杂志148:3133-3139(1992)]。
近来，几个研究者已经发现IL-12流感诱导人T细胞分泌IL-10[Meyaard,L.,等人，免疫学杂志156:2776-2782(1996)；Daftarian,P.M.,等人，免疫学杂志157:12-20(1996)；Gerosa,F.,等人，实验方法杂志183:2559-2569(1996)]。在这些研究工作中，评价了鼻内给药IL-12在肺和脾脏中诱导IL-10mRNA的能力。该结果清楚地显示IL-12诱导IL-10mRNA的能力。但是，仅仅在接种后24小时注意到最大表达。在IL-12处理后对诱导IL-10mRNA表达的延迟表明该细胞因子参与设计为调节IL-12/IFN-γ的作用的反馈机理。还对作为针对Th2分化的特异性标记物的IL-5mRNA进行分析，并且发现在用IL-12治疗的小鼠的肺部IL-5mRNA明显降低。该结果与检查鼻内给药IL-12对全身免疫性的作用的其它结果一致[Trinchieri,G.,等人，免疫性研究.,146:423431(1995)；Trinchieri,G.,今天的免疫学，14:335-338(1993)；Manetti,R.,等人，实验方法学杂志.,177:1199-1204(1993)；Hsieh,CS.,等人，科学，260:547-549(1993)]并且进一步支持IL-12的免疫调节功能。该结果清楚地证明鼻内IL-12给药可以诱导全身性和粘膜腔室的Th1-型细胞因子应答。
由于体内产生的细胞因子可以决定在免疫应答期间产生的抗体的分布[Finkelman,F.D.,等人，免疫学综述年报303-333(1990)]，检查了BAL，血清和粪便提取物中抗原特异性的抗体的水平，抗原和IL-12的鼻内释放导致BAL IgG2a抗体水平明显加强。这是鼻内IL-12给药可以调节小鼠的呼吸道抗体应答的第一个证据。Yang等人[Yang,.,等人，自然方法学1:890-893(1995)]以前证明IL-12和重组腺病毒的呼吸道接种导致BAL中抗原特异性的IgA的降低，没有改变IgG水平。但是该系统中IL-12的作用没有完全根据IgG异型定性并且因此关于IL-12可能在呼吸道抗体应答中的作用没有任何信息。此外，呼吸道内接种是入侵性的并且与免疫接种方案没有相关性。根据宿主的防御系统本文描述的结果具有重大意义，因为抗病毒感染的较低呼吸道的保护作用是与IgG抗体[Palladino,G.,等人，病毒学杂志69:2075-2081(1995)]。此外，已知IgG2a异型的鼠抗体在补体的调理和固定是非常有效的，其初步的机理是参与呼吸道病原体例如肺炎沙门氏杆菌和脑膜炎奈瑟氏球菌的清除。
以前的研究工作证明鼻内IL-12给药可以改变小鼠的应答鸡蛋白溶菌酶(HEL)的异型-限制的抗体[Buchanan,J.M.,等人国际免疫学7:1519-1528(1995)；Metzger,D.W.,等人，美国科学院年报，79S:100-115(1996)]。非肠道注射IL-12+HEL大大地提高了HEL-特异性血清IgG2a和临时抑制的IgG1抗体的产生。另外，其它人[McKnight,AJ.,等人，免疫学杂志152:2172-2179(1994)；Morris,S.C.,等人，免疫学杂志152:1047-1056(1994)；Germann,T.,等人，免疫学杂志25:823-829(1995)；Wynn,TA.,等人，免疫学杂志157:40684078(1996)；Bliss,3.,等人，免疫学杂志156:887-894(1996)]已经证明鼻内IL-12给药加强了血清IgG2a,IgG2b和IgG3抗体对蛋白质抗原的应答。
本文所述的是下面事实由非侵入性途径鼻内释放的IL-12能够以类似的方式影响血清抗体应答。与仅仅接收抗原的动物相比以抗原和IL-12鼻内免疫接种的小鼠显著地提高了血清IgG2a,IgG2b和IgG3的水平。所观察到的IgG2a和IgG3水平的增加与IL-12诱导IFN-γ的能力一致，这是IgG2a和IgG3抗体应答的潜在的开关因子[Metzger,D.W.,et a1.欧洲免疫学杂志27:1958-1965(1997)；Snapper,C.M.,等人，科学236:9～947(1987)；Snapper,C.M.,等人，实验方法杂志175:1367-1371(1992)；Collins,3.T.,等人，国际免疫学杂志5:885-891(1993)]。另外，到第28天以IL-12治疗的情况，失去了对起始IgG1的抑制，这与以前的发现一致[Buchanan,IM.,等人，免疫学杂志7:1519-1528(1995)；Metzger,D.W.,等人，美国科学院年报795:100-115(1996)]。这些结果证明IL-12可以以非入侵的方式鼻内释放以类似于非肠道给药的方式影响体液的应答。因此鼻内IL-12给药对于蛋白质疫苗的释放是安全的和有效的佐剂。
也如本文所述，发现鼻内或非肠道给药IL-12导致粪便的IgG2a抗体水平增加。相反，鼻内以IL-12治疗导致IgA的表达降低，而IL-12的非肠道释放导致IgA水平增加。这些结果显示IL-12借助于两种不同的给药途径给药其作用有重要的差异。近来，与本文所述的数据相反，Okada等人[Okada,E.,等人，免疫学杂志，159:3638-3647(1997)]报道以表达IL-12的质粒中的HIV DNA疫苗鼻内免疫接种不限定粪便IgA抗体水平。此外，Marro等人[Marinaro,M.,等人.,实验方法杂志185:415427(1997)]报道囊包于脂质体中的IL-12的口腔释放没有改变IgA水平，而非肠道给药导致粪便IgA应答的降低。在Marinaro等人的研究工作中，对于释放IL-12的两条途径，口腔以抗原免疫接种小鼠，这样于本文所述的结果难于进行直接比较，本文的结果利用了释放抗原+IL-12的不同途径。该结果清除地显示IL-12分化影响粪便抗体应答的能力取决于免疫接种的途径。
对开发安全的，潜在的和更好的靶击的抗一定范围内的感染性疾病的疫苗佐剂一直是研究的重点[Van Regemnortel,M.,ASMNews,63:136-139(1997)]。其部分原因是目前批准用于人的佐剂例如明矾失去了激发细胞介导的免疫学的能力。对于抗特定的疾病的保护作用这是关键性的(Gupta，等人，″佐剂和释放系统在调节对疫苗的免疫应答中的作用，设计和生产疫苗的新方案，Cohen,S.和Shaffemian，编辑，A.,Plenum出版社出版，纽约1996,pp.105-113)。在疫苗的研制过程中，合适的Th细胞的激活是与免疫系统的调节整合的。例如，已经证明ml型免疫应答保护免受Leishmania菌的感染[Muller,I.,等人，免疫学综述，112:95-113(1989)]和利斯特菌(Listeria)的感染[Kratz,S.S.,等人，免疫学杂志141:598-606(1988)]。由于其指导Th细胞转变为IFN-γ分泌增加和IgG2a水平增加的Th1表现型的能力，在免疫调节中IL-12是关键的细胞因子。这样，本文所述的结果证明鼻内使用IL-12作为佐剂加强疫苗的免疫学。而且，在目前的阶段，没有用于临床的合适的粘膜佐剂。由给途径即时IL-12给药可以与目前用于临床实验的鼻用流感疫苗结合使用。由于抗流感的保护作用是由IgG抗体介导的[Palladino,G.,等人，病毒学杂志，69:2075-2081(1995)]，IL-12鼻内共给药是增加抗流感的粘膜和全身抗体应答的手段。关于这一点，如本文所述，亚单位流感疫苗+IL-12的鼻内给药显著增加了全身和呼吸道IgG2a水平。
如本文所述，将非侵入性的鼻内释放系统用于提高IL-12调节免疫系统的粘膜和全身腔室的能力。发现与没有接收IL-12的小鼠相比用偶合到OVA(NP-OVA)的DNP与CTB和IL-12一起免疫接种小鼠已经提高了肺部和脾脏中IFN-□和IL-10mRNA转录物的水平。另外抑制了肺部IL-5mRNA的表达。在IL-12治疗之后发现BAL显示IgG2a和未改变的IgG1和IgA抗OVA抗体水平显著增加。通过鼻内IL-12给药显著增加了血清IgG2a,IgG2b和IgG3抗-DNP抗体水平，而抑制了血清IgG1抗体水平，结果类似于全身性的抗原+IL-12给药之后观察到的结果。与增加粪便IgG2a和IgA抗体表达的非肠道治疗相反鼻内IL-12释放也加强了粪便的IgG2a和抑制了水平，这些结果显示鼻内IL-12治疗可以有效地调节抗原特异性免疫应答并且加强用于粘膜疫苗的免疫接种方案。
总之，该结果清楚地证明用于增加粘膜和全身性腔室的抗原特异性应答的IL-12鼻内给药的效果。该结果显示IL-12可作为抗粘膜病原体的免疫接种方案的潜在的疫苗佐剂。
因此，本文的描述和方法可用于治疗和/或抑制与宿主中具有一个或多个抗原的病原体相关的疾病或状态。本文所述的方法可以利用有效量的与单个抗原或来源于相同的病原体，来源于一个病原体的不同菌株或来源于不同的病原体的多个抗原结合的IL-12。因此，IL-12和一个或多个抗原可用于抑制和/或治疗与从其获得抗原的病原体的一种或多种疾病或状态。
通过下面的实施例描述本发明，这些实施例不是用于以任何方式对发明进行限制。
实施例1通过鼻内白细胞介素12的释放调节粘膜和全身性的免疫学材料和方法6到8周龄的雌性BALB/c小鼠是从国家癌症研究院(Bethesda,MD)获得。将小鼠圈养于Ohio医学院的动物饲养器中，并且随时提供食物和水。Ohio医学院动物护理和实验程序按照国家动物护理和使用委员会(IACUC)的规定。鼻内免疫接种方案对腹膜内用盐酸氯胺酮(Forr Dodge实验室，Fort Dodge,IO)和X□lazine盐酸赛拉嗪(Ba□er Corporation,Shawnee Mission,KA)结合麻醉的小鼠进行鼻内治疗，麻醉时浓度分别为每个小鼠80毫克和16毫克。在0天，以50毫升的含有100微克的偶合到卵白蛋白(D NP-OVA；Biosearch Techno1ogies,San Raphael,CA)和10微克的霍乱毒素B-亚单位(CTB；Sigma,St.Louis,MO)的二硝基苯半抗原无菌磷酸缓冲盐水(PBS)免疫接种小鼠。在0天，1,2和3天之后以1微克的溶于含有1％正常重组BALB/c小鼠血清(PBS-NMS)的PBS中的重组鼠IL-12鼻内给药，对于对照小鼠，仅仅用PBS-NMS给药。用相同量的DNP-OVA和CTB在第14天和第28天给小鼠鼻内加强给药。在第28天，小鼠接收1微克的溶于PBS-NMS的IL-12或仅仅PBSNMS。对于鼻内接种，在0天用溶于完全弗氏佐剂(CFA；Life Technologies,Galthersburg,MD)，随后在0,1,2和3天，用溶于PBS-NMS的1微克IL-12注射。对照小鼠仅仅接收抗原和PBS-NMS。在第14和28天以相同的途径用溶于不完全弗氏佐剂(IFA；Life Technologies)的DNP-OVA加强免疫。在第28天，以单独的溶于PBS-NMS或PBS-NMS的IL-12腹膜内注射小鼠。通过从小鼠的眼眶采血制备血清。RNA分离根据制造商的说明用Trizol试剂(Gibco-BRL Gaithersburg,MA)从速冻的脾脏和肺部分离总RNA。简单地说，用臼和钵匀浆冷冻的组织，立即转移到含有2毫升的Trizol试剂的聚苯乙烯试管。将匀浆的样品在室温下保温5分钟以允许核蛋白复合物的解离并且以12000g在4℃离心10分钟。将上清液与0.4毫升的氯仿混合15秒，置于冰上保温，并且以12000g在4℃离心15分钟。离心之后，通过加入1毫升的异丙醇在20℃将液相中的RNA沉淀1小时。以12000g将样品离心15分钟并且用1毫升的75％乙醇洗涤RNA沉淀两次。将沉淀空气干燥2-5分钟，溶解于DEPC处理的水中，并且储存于-80℃。利用单链RNA的A260值计算总RNA的浓度(1A260单位=40微克的单链RNA/ml)。最后制备的总的RNA产生260/280比例为1.7-2.0。cDNA合成的第一条链根据制造商的说明(Gibco-BRL)进行第一条链cDNA的合成。简单地说，将1微克的寡聚(dT),3微克的总RNA，和无菌的DEPC-处理的水加入到无菌的eppendorf试管至终体积为11微升。将混合物于70℃动物20分钟，然后于冰上冷冻。随后，依次加入下面的成分4.0微升的5X第一条链的缓冲液，2微升的0.1M DDT，和1微升的dNPT混合物(各10mM的dATP,dGTP,dCTP和dTTP)。将试管的内含物缓慢混合并且在42℃保温2分钟，随后加入1微升(200U)的转录物Ⅱ逆转录酶(RT)。将反应混合物缓慢混合并且在42℃保温1小时，然后在70℃保温15分钟中止反应。聚合酶链反应(PCR)用下列成分31.30微升DEPC处理的水，10.0微升的5×Tris-HCL缓冲液(对于各个引物组沉淀最适镁和pH)，来自于第一条链合成的2微升的cDNA，2微升引物(20微摩尔浓度的原液浓度)，5.0微升的dNTP混合物(2.5mM aATP,2.5mM dCTP,2.5mMdGTP,和2.5mM dTTP,pH8.0)(Invitrogen公司)，和0.5微升1(2.5U)的Taq DNA聚合酶(Gibco-BRL)在无菌的eppendorf试管中制备50微升的反应混合物。将试管置于Perkin Elmer热循环仪480(Perkin Elmer Cetus,Norwalk,CT)的孔中，在95℃保温5分钟并且然后进行下面的扩增反应95℃1分钟，56℃1分钟和72℃进行1分钟，持续35个循环。随后的在72℃保温10分钟，随后在4℃进行渗透循环。在2.5％的琼脂糖凝胶上制备PCR产物并且以溴化已啶染色。观察谱带，利用透射照相。将次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)用作为管家对照以确保在所有的泳道RNA的负载量相同并且将100bp DNA梯(Gibco-BRL)用作为分子量标记物。引物序列HPRT5′GTT GGA TAC AGG CCA GAC TTT GTT G3′(SEQ ID NO:1)5′GAT TCA ACT TGC GCT CAT CTT AGG C3′(SEQ ID NO:2)IL-55′ GAC AAG CAA TGA GAC GAT GAG 3′(SEQ ID NO:3)5′ GTT ATC CTT GGC TAC ATT ACC 3′(SEQ ID NO:4)
IL-105′ATG CAG GAC TTT AAG GGT TAC TTG GGT T3′(SEQDNO:5)5′ATT TCG GAG AGA GGT ACA AAC GAG GTT T3′(SEQ IDNO:6)IFN-γ5′TGA ACG CTA CAC ACT GCA TCT TGG3′(SEQ ID NO:7)5′CGA CTC CTT TTC CGC TTC CTG AG3′(SEQ ID NO:8)支气管肺泡的灌洗液(BAL)和粪便提取物的收集为了收集BAL，杀死小鼠并且将其气管暴露，利用0.58mmOD聚乙烯导管(Becton Dickinson,Sparks,MD)保温。将肺用含有5mMEDTA的PBS浸泡至2-3倍。每个小鼠获得约1.5毫升的浸泡液并且利用Hemastix(Bayer公司，Elkhart,IN)监测血污染。以12000g在4℃离心5分钟回收的BAL体液，在-70℃储存上清液直到使用。通过deVos和Dick[deVos,T.,等人，免疫方法学杂志，141:28S-288(1991)]的方法制备粪便提取物。简单地说，将来自于各个小鼠的0.1克的粪便材料于1毫升的PBS混合，并且置于室温下保温5分钟。随后将样品涡旋5分钟并且以12,000xg离心10分钟。然后在-70℃储存上清液。采用ELISA检测抗体和异型的水平如下所述[Buchanan,3.M.,等人，国际免疫学，7:1519-1528(1995)；Metzger,D.W.,欧洲免疫学杂志，27:1958-1965(1997)]。采用ELISA测定抗-DNP和抗-OVA抗体水平。
简单地说，用溶于PBS的10微克/毫升DNP-牛血清白蛋白(BSA)或100微克/毫升的OVA包被微滴板(Nalge NuncInternational,Rochester,N□)。用含有0.1％(w/v)明胶和0.05％(v/v)吐温20的PBS洗涤该平板。然后加入连续稀释的血清或BAL体液并且在将该平板在室温下保温2小时。再次将该平板洗涤并且与偶合到碱性磷酸酶(Southern生物技术协会，Birmingham,AL)的羊抗小鼠IgG1,IgG2a,IgG2b或IgG3一起保温1小时。洗涤该平板和加入p-硝基苯磷酸酶底物获得最适的显色反应。在405nm用ELISA微滴板(Bio-Tek Instruments,Winooski,VT)对该平板读数。为了检测IgA，将该孔用偶合到生物素(Sigma,St.Louis,MO)的羊抗小鼠IgA一起保温，在加入底物之前用偶合到链霉抗生物素(Biorad,Richmond,CA)的碱性磷酸酶一起保温。在相同的模式测量总的免疫球蛋白，不同的是用10微克/毫升的亲和纯化的羊抗小鼠Ig(Southern生物技术协会)[Buchanan,J.M.等人，国际免疫学杂志7:1519-1528(1995)]包被该平板。在所有的情况下，利用纯化的已知的异型的mycloma蛋白质(Sigma,St Loius,:MO)测定第二抗体偶合物的合适的工作释放液和异型特异性。此外，利用仅仅以BSA包被的平板建立测试的抗原特异性。利用两端加尾的StudentⅠ-测试测定统计学显著性。如果p值＜0.05认为从统计学上说该数据是显著的。结果鼻内IL-1释放诱导肺和脾脏的Th1类的应答。为了测定鼻内抗原+IL-12是否调节肺的细胞因子mRNA的表达，以DNPOVA和CTB+/-IL-12免疫接种小鼠，在6和24小鼠之后通过RT-PCR分析单个动物的肺中细胞因子mRNA水平。发现在以IL-12治疗之后6小时小鼠中IFN-γmRNA的表达急剧增加，并且与没有与IL-12接触的免疫接种的小鼠相比，该表达的增加至少保持24小时。在6小时之后以IL-12治疗的小鼠的肺中IL-10mRNA的表达没有差异，但是在接种之后24小时观察到表达增加。由于已经发现IFN-γmRNA下调Th2型细胞因子例如IL-5[Mosmann,TIL,等人，免疫性综述年报7:145-173(1989)；Coffman,ILL.,等人，免疫性综述.,123:189-207(1991)]，也监测了IL-5mRNA的表达并且到6小时强力较低，在24小时之后仍然明显。
肺中细胞因子的表达相当于以抗原+IL-12鼻内接种之后脾脏。以IL-12治疗之后6小时脾脏的IFN-γmRNA表达增加。这种增加延续到24小时，而未治疗的小鼠在此时IFN-γmRNA几乎没有可检测的增加。在IL-12治疗的小鼠的脾脏中也监测了IL-10mRNA水平的增加，与未治疗的对照相比在24小时有最大的增加。静脉IL-12给药诱导IL-10表达的能力以前已经由其他人证明[Me□aard,L.,等人，免疫学杂志156:277&2782(1996)；Daftarian,P.M.,等人，免疫学杂志，157:12-20(1996)；Gerosa,F.,et aL,J Eq,Meci,183:255902569(1996)]。最后，与肺的情况相反，在IL-12处理的或对照小鼠的脾脏没有检测到IL-5，而在鼻内抗原处理之后检测IL-5mRNA，但是受IL-12共给药的抑制。HPRT mRNA同时扩增证实在所有RT-PCR反应中使用等量的RNA。这些结果清楚地证明I在粘膜和全身性腔室中IL-12鼻内给药可以调节抗原衍生的细胞因子反应，导致IFN-□和IL-10mRNA的表达显著加强。这些结果也为鼻内释放的IL-12具有负调节Th2-相关的细胞因子，IL-5的表达的能力提供了强有力的证据。鼻内IL-12给药调节呼吸道抗体应答以前的研究工作[Buchanan,R.I.,等人，国际免疫学杂志，7:1519-1528(1995)；Metzger,D.W.,等人，美国科学院年报年报795:100-115(1996)；McKnight,AJ.,等人，免疫学杂志152:2172-2179～994)；Morris,S.C.,等人，免疫学杂志152:1047-1056(1994)；Germann,T.,等人，欧洲免疫学杂志，25:823-829(1995)；W□m,TA.等人，欧洲免疫学杂志157:40684078(1996)；Bliss,3.,等人，欧洲免疫学杂志156:887-89～(1996)]证明非肠道释放IL-12加强了血清IgG2a抗体应答蛋白质和半抗原载体抗原的能力。IL-12也暂时抑制了IgG1的产生[Buchanan,3.M.,等人，免疫学杂志7:1519-1528(1995)；Metzger,D.W.,等人，美国科学院年报795:100-115(1996)]。如本文所述，现在已经证实鼻内IL-12给药以相同的方式调节呼吸道抗体应答。在免疫应答的35天收集BAL体液并且通过ELISA分析。与没有与IL-12接触的免疫接种的小鼠(附图1A-1C)相比，以DNP-OVA免疫接种和以IL-12鼻内治疗的小鼠显示IgG2a抗-OVA抗体水平急剧增加(p＜0.05)。对于对照和实验组IgG1或IgA抗-OVA抗体水平之间没有差异。在呼吸道分泌没有白蛋白存在下排除血液污染。这些结果提供了鼻内释放IL-12改变呼吸道抗体应答的能力的第一证据。鼻内IL-12给药调节血清抗体应答ELISA分析第14天的血清显示与接收DNP-OVA和载体的(附图2A-2E)对照小鼠相比，小鼠的DNP-OVA和IL-12鼻内接种也导致血清IgG2a抗-DNP抗体水平显著增加(p＜0.05)。另外，在IL-12治疗之后血清IgG2b和IgA抗-DNP抗体水平显著增加(p＜0.05)。重要的是，在鼻内IL-12治疗之后28天，血清IgG2a,IgG2b和IgG3抗-DNP应答仍然增加。在IL-12治疗的小鼠第14天血清IgG1抗-DNP抗体的产生受到抑制，但是IgA抗-DNP抗体水平几乎没有改变。但是，到第28天免疫应答失去了用IL-12治疗的观察到的起始的IgG1抑制，显示IgG1的抑制仅仅是临时的作用。也检查了鼻内IL-12治疗对血清总(非特异性)IgG1和IgG2a水平的影响。发现治疗之后14天，IL-12治疗的小鼠血清IgG2a有相应的增加，IgG1降低(附图3A-3B)。IL-12接种之后4星期仍然观察到该模式。IL-12对粪便抗体的影响检查鼻内或静脉给药IL-12对粪便抗体应答的影响。与没有接触IL-12的小鼠相比(附图4AAF)，采用任一途径给药的抗原和IL-12的小鼠粪便IgG2a抗-DNP抗体水平显著提高(p＜0.05)。事实上，仅仅非肠道接收抗原的小鼠粪便提取物没有可检测的IgG2a。当以抗原和IL-12非肠道治疗时也导致粪便IgA水平增加(p＜0.05)，鼻内释放IL-12导致IgA抗体水平r降低(p＜0.05)。在非肠道和鼻内免疫接种之后IL-12治疗的和导致IL-12治疗的和对照组之间粪便的IgG1抗体水平显著不同。这些结果显示与非肠道注射IL-12所看到的结果类似，鼻内释放IL-12和抗原诱导IgG产生的变化。但是，仅仅IL-12非肠道给药导致粘膜IgA抗体水平增加。利用纯化的来源于流感病毒的血凝素和神经氨酶检测IL-12对全身性抗体应答的影响利用纯化的来源于流感病毒(HANA)的血凝素和神经氨酸酶检测鼻内IL-12给药对全身性抗体应答的影响。在0天以HANA鼻内免疫接种小鼠和在0,1,2和3天以IL-12或PBS载体鼻内治疗小鼠。采用异型-特异性ELISA，利用HAHA包被的微滴板测定第14天血清抗HANA抗体水平，参见附图5A-5B。另外，在0天以HANA免疫接种小鼠，和在0,1,2和3天以IL-12或PBS载体鼻内治疗小鼠，在第14天加强接种。在第28天，利用HAHA包被的微滴板，采用异型-特异性ELISA测定血清抗HANA抗体水平。参见附图6A～6B。鼻内IL-12给药对呼吸道粘膜应答的影响检测鼻内IL-12给药对呼吸道粘膜应答的影响。在0天以HANA免疫接种小鼠和在0,1,2和3天以IL-12或PBS载体治疗小鼠，在14和28天加强接种。在第28天小鼠接收IL-12或载体。在第35天杀死小鼠，利用HAHA包被的微滴板，通过ELISA分析BAL体液中抗-HANA抗体水平。参见附图7A-7B。
实施例2鼻内IL-12是保护粘膜免疫学的有效的佐剂方法小鼠从国家癌症研究院(Bethesda,MD)获得6-8周龄的雌性BALB/c小鼠。C57BL/6 IgM缺陷(μMT)是从Jackson实验室(BarHarbor,ME)购买的。将小鼠圈养于Ohio医学院的动物饲养器中，并且随时提供食物和水。Ohio医学院动物护理和实验程序按照国家动物护理和使用委员会(IACUC)的规定。免疫接种静脉用盐酸氯胺酮(Fort Dodge实验室，Fort Dodge,10)和X□lazine盐酸赛拉嗪(Bayer公司，Shawnee Mission,KA)麻醉的小鼠进行鼻内治疗。在0天以反应1微克亚单位流感疫苗的25 M1of无菌PBS免疫接种小鼠，所述疫苗由可溶性的血凝素亚型1(HI)和从Dr.Doris提供A□PR8134流感病毒纯化的神经氨酸酶亚型1(N1)(Bucher，纽约医学院，纽约)组成。在0,1,2和3天以溶于含有1％正常BALB/c小鼠血清(PBS-NMS)的PBS的重组小鼠IL-12的lpg鼻内接种或仅仅以PBS-NMS接种的对照小鼠。在14和28天以相同量的疫苗鼻内加强接种小鼠。在第28天，小鼠还接收溶于PBS-NMS IL-12或仅仅接收PBS-NMS。以这种治疗方式没有观察到毒性。通过从小鼠的眼眶采血制备血清。RNA分离和RT-PCR根据制造商的说明用Ambion总RNA分离试剂盒(Austin,TX从速冻的脾脏和肺部分离总RNA。简单地说，用臼和钵匀浆冷冻的组织，立即转移到含有1毫升的变性溶液的试管。以苯酚和氯仿提取之后。以12000g在4℃离心匀浆的样品10分钟。将上清液进行另一轮的苯酚-氯仿提取，获得的RNA以异丙醇沉淀，用75％乙醇洗涤两次，溶于DEPC治疗的水，通过在260纳米处以分光光度计测定总RNA的浓度。利用逆转录试剂盒(Life Technologies,Gaithersburg,MD)，利用寡聚(dT)16-18引物将3微克的总RNA逆转录为cDNA。利用特异于IFN-γ和IL-10的引物次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)引物作为对照扩增获得的cDNA。利用具有下列序列的有义和反义引物IFN-γ5′-TGAACGCTACACACTGCATCTTGG-3′(SEQ ID NO:7) 和5′-CGACTCCTTTTCCGCTTCCTGAG-3′(SEQ ID NO:8)；IL-1051-ATGCAGGACTTTAAGGGTTACTTGGGTT-3′(SEQ ID NO:5)和51-ATTTCGGAGAGAGGTACAAACGAGGTTT-3′(SEQ ID NO:6)；
HPRT5′-GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG-3′(SEQ ID NO:1)和5′-GATTCAACTTGCGCTCATCTTAGGC-3′(SEQ ID NO:2)。
通过将溶于60mM Tris-HCl(pH8.5),15mM(NH4)2SO4,0.4mM MgCI2的终体积为50微升的2微升的cDNA，0.25mM dNTPs(Invitrogen公司，San Diego,CA),0.8微摩尔浓度引物和2.5U的Taq DNA聚合酶(Life Technologies)混合进行PCR扩增。在95℃保温该混合物5分钟，然后进行下面的扩增在95℃1分钟，56℃1分钟和在72℃1分钟，持续35个循环。随后在72℃延伸最后的10分钟。在2.5％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，用溴化已啶染色，通过UV透射观察。核糖核酸酶保护分析利用RiboQuant多探针核糖核酸酶保护系统(Pharmingen,SanDiego,CA)，根据制造商的说明，测定细胞因子mRNA水平。简单地说，在56℃10微克的总RNA与32p标记的RNA探针过夜杂交。用核糖核酸酶在30℃消化单链核酸45分钟，进行苯酚-氯仿的提取，在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上分离。在Storm 840Phosphorlmager(Molecular Dynamics,Sunnyvale；CA)定量测定转录物水平。将总RNA标准化为管家基因甘油醛3-磷酸脱氢酶和将相对的细胞因子mRNA水平以任意值表达支气管肺泡灌洗液的收集为了收集BAL体液，杀死小鼠，利用0.58mmOD聚乙烯导管(Becton Dickinson,Sparks,MD)保温其气管。将肺用含有5mMEDTA的PBS浸泡至2-3倍。以12,000g在4℃离心5分钟回收的BAL体液，在-70℃储存上清液直到使用。采用ELISA检测抗体和异型的水平基本上按照所述(Buchanan,3.M.,等人，国际免疫学，7:1519-1528(1995)；Buchanan,O R.M.,等人，免疫学杂志161:5525-5533(1998))采用ELISA测定血清和BAL中抗-H1N1水平，仅仅进行了微小的改变。
简单地说，用溶于PBS的10微克/毫升H1N1包被微滴板(Nalge Nunc International,Rochester,NA)过夜。该微滴板用含有0.3％Brij-35(Sigma,St.Louis,MO)的PBS洗涤并且在室温下用含有5％胎牛血清(Hyclone实验室，Logan,UT)和0.1％的Brij-35的PBS在室温下封阻1小时。然后加入连续稀释的血清并且在将该平板在室温下保温2小时。将该平板洗涤并且与偶合到碱性磷酸酶(Southern生物技术协会，Birmingham,AL)的羊抗小鼠IgG1,IgG2a一起保温。保温1小时之后，洗涤该平板和加入p-硝基苯磷酸酶底物获得最适的显色反应。在405nm用ELISA微滴板(Bio-TekInstruments,Winooski,VT)对该平板读数。为了检测IgA，将该平板用偶合到生物素(Sigma,St.Louis,MO)的羊抗小鼠IgA一起保温，，然后洗涤并且用偶合到链霉抗生物素(Biorad,Richmond,CA)的碱性磷酸酶一起保温。在相同的模式测量总的免疫球蛋白，不同的是用10微克/毫升的亲和纯化的羊抗小鼠Ig(Southern生物技术协会)(Buchanan,3.M.,等人，国际免疫学杂志7:1519-1528(1995))包被该平板。在所有的情况下，利用已知异型的(Sigma)骨髓瘤蛋白质测定第二抗体偶合物的合适的工作稀释液和异型特异性。利用两头加尾的Student t-测试测定统计学差异。如果p值＜0.05统计学上认为该数据是显著的。病毒攻击为了进行保护研究，在第0天以含有1微克H1N1亚单位流感疫苗的25微升的PBS免疫接种小鼠。随后在0,1,2和3以鼻内接种溶于PBS-NMS的1微克的IL-12Ⅰ或仅仅以PBS-NMS接种。一些小鼠仅仅接收溶于PBS-NMS的IL-12或仅仅以PBS-NMS(非H1N1亚单位疫苗)。在初次接种4-5星期之后，利用(由Dr.DorisBucher提供的)感染性A1PR8134流感病毒通过鼻内给药在40微升无菌的PBS中麻醉小鼠进行病毒攻击。每天称重小鼠并且检测发病率和死亡率。血清和BAL体液的被动转移对于被动转移实验，在鼻内用H1N1亚单位疫苗免疫接种之后在第28天获得血清。用储存的血清的100微升的1∶10稀释液静脉注射小鼠并且5小时以后用感染性病毒鼻内攻击。在鼻内用H1N1亚单位流感疫苗免疫接种之后第35天从小鼠收集的BAL体液离心去除细胞并且将上清液与病毒一起以40微升的总体积给麻醉的小鼠给药。结果在免疫接种的小鼠的肺和脾脏中鼻内IL-12给药诱导Th1型细胞因子的表达已经证明了通过其较好地激活Th1和NK细胞，IL-12非肠道给药对免疫系统具有调节作用，并且诱导IFN-γ的产生[Trinchieri,G.,等人，免疫学研究，146:423431(1995)；Gately，等人，免疫学综述年报16:495-521(1998)]。如本文所述，现在已经检查了IL-12鼻内给药对呼吸道细胞因子基因表达的影响。在单独的鼻内接种IL-12或PBS载体和H1N1亚单位流感疫苗之后分析单独的小鼠(每组3个)的肺中细胞因子mRNA的表达。治疗之后24或48小时杀死小鼠，通过RT-PCR分析总肺RNA中指示的细胞因子的表达IL-10(455bp),IFN-γ(459bp)和HPRT(162bp)。发现与仅仅用疫苗免疫接种相比，在24小时内以流感H1N1亚单位疫苗和IL-12鼻内治疗对肺JFN-γmRNA水平具有加强作用。IL-12接种48小时之后仍然有证据证明IFN-γmRNA水平的增加。
以前已经证明(Meyaard,L.,等人，免疫学杂志，1s6:277～2782(1996)；Daftarian,P.M.,等人，免疫学杂志，157:12-20(1996)；Gerosa,F,等人，实验方法杂志183:2559-2569(1996))用IL-12治疗加强了IL-10mRNA的表达。如本文所述，H1N1疫苗+IL-12的鼻内释放也导致肺IL-10mRNA的表达水平的急剧增加，相反，在仅仅接收疫苗的小鼠中没有IL-10mRNA。在48小时之后，与仅仅接收疫苗的动物相比IL-12治疗的小鼠的肺中IL-10mRNA表达显著增加。也检查了IL-5mRNA的表达并且在IL-12治疗之后没有发现差异。
为了测定IL-12原位粘膜释放调节远距离的全身性腔室，检查了免疫接种的小鼠的脾脏中细胞因子mRNA模式。在单独的鼻内接种IL-12或PBS载体和H1N1亚单位流感疫苗之后分析单独的小鼠(每组3个)的脾脏中细胞因子mRNA的表达。治疗之后24或48小时杀死小鼠，通过RT-PCR分析总肺RNA中指示的细胞因子的表达IL-10(455bp),IFN-γ(459bp)和HPRT(162bp)。发现与仅仅用疫苗免疫接种相比，在24小时内以流感H1N1亚单位疫苗+IL-12鼻内治疗对脾脏JFN-γmRNA表达显著增加。在IL-12治疗之后24小时和48小时内脾脏IL-5mRNA水平仍然保留增加。最后，在IL-12治疗的或对照动物的脾脏中没有检测到。HPRT mRNA同时扩增证实在所有的RT-PCR反应中利用等量的RNA。为了进一步对流感疫苗免疫接种之后观察到的细胞因子mRNA转录物进行定量测定，通过核糖核酸酶保护测试分析肺和脾脏中细胞因子mRNA的水平。发现与仅仅接收疫苗的小鼠相比，以H1N1+IL-12治疗的动物的肺中IFN-γmRNA水平增加2倍(参见表)。此外，在IL-12治疗之后肺中IL-10mRNA的表达增加5倍。在这些动物的脾脏中，在IL-12治疗之后24小时IFN-γmRNA提高5倍，48小时之后提高2倍。类似地，IL-12治疗之后24小时脾脏IL-5mRNA提高8倍，48小时之后提高5倍。表用流感亚单位疫苗免疫接种的小鼠的的肺和脾脏中IFN-γ和IL-10mRNA水平*肺
脾脏
*在用H1N1亚单位流感疫苗±IL-12治疗之后24小时和48小时杀死小鼠。分离总RNA通过多个核糖核酸酶保护测试分析IFN-γ和IL-10转录物水平。在phosphorimager定量检测相对的RNA水平和标准化为甘油醛3-磷酸脱氢酶。细胞因子mRNA水平以任意单位+SE表示。鼻内疫苗+IL-12共给药对全身性抗体应答具有潜在的影响以前已经证明IL-12非肠道给药改变了对鸡蛋白溶菌酶的异型限制的抗体应答[Buchanan,J.M.,等人，免疫学杂志，7:1519-1528(1995)]。另外，如实施例1描述的，鼻内释放的IL-12调节粘膜和全身性对DNP半抗原的免疫学。在该实施例中，已经证明鼻内释放的与H1N1流感疫苗具有类似的影响。以疫苗本身或与IL-12一起免疫接种14天之后，可检测的IgG1和H1N1抗体几乎没有(附图8A-8B)。相反，与仅仅接收疫苗的小鼠相比，IL-12治疗后IgG2a抗-H1N1抗体水平显著增加。因此，鼻内IL-12治疗导致血清IgG2a抗体应答早期激活。
在第35天进行类似的分析以测定鼻内IL-12治疗的长期作用。关于这一点，IL-12治疗的小鼠比仅仅用疫苗接种的小鼠总抗H1N1血清抗体水平增加6倍(附图9A-9E)。此外，鼻内IL-12治疗之后，(非特异性)总Ig增加。在接收IL-12的小鼠内IgG2a抗体水平仍然仅仅增加，此外，与仅仅接收疫苗的小鼠相比在实验和对照组中IgG1抗-H1N1抗体中等增加，该结果与我们以前的发现一致(Buchanan,3.M.,等人，国际免疫学7:1519-1528(1995))。的任何小鼠的血清中没有检测到IgA。该结果清楚地证明IL-12以作为佐剂共给药和以非侵入性方式释放具有增加血清抗体水平的能力。鼻内IL-12释放加强呼吸道抗体水平对来自于免疫接种的小鼠的BAL体液的抗体应答进行评估。在免疫应答的第35天收集的BAL体液分析显示IL-12处理的小鼠对H1N1亚单位流感疫苗的粘膜抗体应答加强。作为一个组，与仅仅以疫苗免疫接种的小鼠相比，鼻内IL-12治疗导致总的抗H1N1呼吸道抗体的产生增加15倍(附图10A-10D)。另外，在鼻内接收H1N1+IL-12t的小鼠的BAL体液中总的非特异性Ig增加13倍。重要的是，与没有与IL-12接触的动物相比，以IL-12免疫接种的和治疗的动物显示BAL体液中IgA抗-H1N1抗体水平提高。该结果与这些小鼠的循环中没有可检测的IgA形成鲜明的对比。还发现与仅仅接收疫苗的小鼠相比，BAL体液中IgG1和IgG2a抗H1N1抗体水平急剧加强。该结果坚定地证实鼻内释放的IL-12对呼吸道抗体水平的作用。IL-12给药增加了流感亚单位疫苗的保护作用也对用流感病毒攻击之后IL-12和H1N1鼻内共给药对成活率和临床缺陷的影响。在0天用H1N1疫苗鼻内免疫接种小鼠，在0,1,2和3以1微克的IL-12或PBS载体给小鼠免疫接种。一些小鼠仅仅接收IL-12或PBS载体。免疫接种之后4-5周用感染性A/PR8134流感病毒接种小鼠，并且每天监测发病率和死亡率。在第一个实验中，利用一个剂量的病毒，以便在小鼠仅仅与疫苗接触之后有50％的存活(附图11A-11B)。发现与仅仅接收疫苗的小鼠相比在免疫接种期间包含Ⅰ了2导致100％存活和发病率明显降低，如由重量损失证明的。在病毒攻击之后11天内仅仅用IL-12或PBS-NMS(没有H1N1亚单位疫苗)预处理的小鼠显示逐渐的重量损失和所有的显示死亡。
在第二个实验中，将较大剂量的病毒用于攻击以便仅仅用H1N1免疫接种几乎没有保护作用(附图11C-11D)。在这种情况下，发现以H1N1和IL-12免疫接种攻击以后50％成活率。通过重新获得体重证明在存活的小鼠中从感染恢复了。正如所预期的，仅仅接收IL-12或PBS-NMS的动物对于病毒攻击没有存活下来。因此，c～admihistration of以IL-12和H1N1亚单位流感疫苗鼻内共给药逐渐了疫苗的效率并且授予抗致死剂量的肝流感病毒的显著的保护作用。在以H1N1+IL-12免疫接种之后抗流感感染的保护加强是抗体介导的为了确定体液免疫性对免受流感病毒感染的保护作用，检测对IL-12处理失去了B细胞的微MT小鼠的应答[Kitamura,D.,等人，自然，350:423426(1991)]。发现仅仅以PBS，仅仅疫苗或疫苗+IL-12预处理的微MT小鼠在第10天没有屈服于感染(附图12A-12B)。在感染之后12天仅仅以PBS预处理的野生型小鼠死亡。另外，所有小鼠显示稳定的逐渐的体重的损失。因此，有IL-12治疗授予的加强的保护作用是增加的B细胞的功能的结果。
为了进一步确定以疫苗和IL-12接种的小鼠中观察到的抗流感病毒的保护作用是通过抗体介导的，我们从这些小鼠转移储存的血清到天生的动物，然后5小时之后以流感病毒攻击。接收从以仅仅疫苗或PBS-NMS免疫接种的小鼠的血清的动物所有都屈服于感染(附图13)。但是在病毒攻击之后接收来自于以疫苗+IL-12免疫接种的小鼠的血清的动物显示50％的成活率。
还测定了在免疫接种的小鼠的呼吸道中产生的抗体是否在保护免受流感病毒感染中具有关键的作用。将从未免疫接种的动物或以H1N1+IL-12免疫接种的动物回收的BAL体液和活病毒一起鼻内给天生的小鼠给药。该结果显示将将病毒与从以仅仅PBS-NMS治疗的小鼠被动转移的BAL体液一起给药导致到7天时100％死亡(附图14A-14B)。在仅仅以H1N1免疫接种的小鼠的BAL体液存在下被动攻击仅仅导致只有1/8的感染的小鼠存活。但是，接收来自于以H1N1+Ⅰ了2的小鼠的BAL体液的动物100％抵抗病毒感染。这些小鼠显示在感染过程中没有体重的损失，而其他两组治疗都显示体重逐渐损失导致死亡。此外，在感染之后4天，仅仅接收来自于仅仅以疫苗免疫接种的动物的BAL体液具有的病毒的肺效价为103pfu，而接收来自于以疫苗+IL-12治疗的动物的BAL体液的小鼠具有的肺病毒效价＜100pfu。最后，接收来自于以H1N1+IL-12的BAL体液的病毒攻击的动物的总体的健康状况显著好于接收了来自于仅仅以H1N1免疫接种的动物的BAL体液的小鼠。因此，从以H1N1亚单位疫苗2免疫接种的小鼠的BAL体液鼻内被动转移提供了抗流感病毒攻击的急剧的保护作用。讨论如本文所述，与流感亚单位药理一起鼻内释放IL-12可用作为有效的粘膜佐剂，并且授予抗随后的病毒感染的增加的保护作用。使用B细胞缺陷的小鼠和被动转移的血清或BAL体液证明有IL-12诱导的保护作用是由抗体诱导的。
在以IL-12鼻内治疗之后分析细胞因子mRNA的产生显示在24小时内肺和脾脏中IFN-γmRNA病毒增加。IFN-γ具有各种各样的免疫调节功能，包括诱导Th1细胞的分化和NK细胞的激活[Boehm,U.,等人，欧洲免疫学杂志15:749-795(1998)]。另外，IFN-γ加强调理小鼠抗体例如IgG2a[Buclimiau,J.M.,等人，国际免疫学杂志7:1519-1528(1995)；Metzger,D.W.,等人，欧洲免疫学杂志27:1958-1965(1997)；McKnight,A.J.,等人免疫学杂志，152:2172-2179(1994)；Wynn,T.A,等人，免疫学杂志157:4068-4078(1996)]的产生。通过以IL-12鼻内治疗在肺和脾脏中诱导IL-10mRNA的表达。IL-10主要是由T细胞和单核细胞产生的，并且已经证明抑制Th1细胞分化[Fiorentino,D.F.等人，免疫学杂志，146:3444-3451(1991)；Ding,L.,等人，免疫学杂志14&3133-3139(1992)]。其他人[Meyaard,L.,等人，免疫学杂志156:2776-2782(1996)；Daftarian,P.M.,等人，免疫学杂志157:12-20(1996)；Gerosa,F.,等人，实验方法杂志，183:2559-2569(1996)]已经证明在以IL-12治疗之后诱导IL-10的产生，该结果暗示设计为下调IL-12和IFN-γ的炎性的作用的反馈机理。
在实施例2中，检查IL-12对应答临床的相对的流感亚单位疫苗的作用。发现IL-12治疗具有对早期启动的体液应答的急剧作用，如有IgG2a抗-H1N1抗体水平的显著增加的反应的。比较而言，仅仅接收疫苗的动物没有产生早期IgG2a应答。在仅仅接收疫苗或疫苗+IL-12的动物的免疫应答的早期几乎没有可检测的IgG1抗体。在35天之后，在IL-12治疗的小鼠IgG2a水平仍然增加和IgG1水平也有所增加，该结果与以前在溶菌酶系统中的发现一致[Buchanan,J.M.等人，国际免疫学杂志，7:1519-1528(1995)]。这些结果证明鼻内释放IL-12具有长期持续的作用并且提供了使用这些给药途径用于增加全身性体液免疫性的进一步的证据。
鼻内IL-12给药也导致呼吸道抗体水平显著增加，包括IgG1和抗-H1N1抗体水平。IgA是粘膜分泌中的占优势的抗体，并且被认为在阻止病原体结合到粘膜表皮表面中起主要的作用[Lamm,M.E.,免疫性综述年报51:311-340(1997)]。
也如本文所述，从以亚单位流感疫苗HIL-12免疫接种的小鼠收集的血清或BAL体液的被动转移导致从发病率和死亡率看具有显著的保护作用。在微MT小鼠中完全去除了IL-12增加抗体水平和加强抗流感病毒感染的保护作用的能力。由这里观察到的BAL体液的被动转移授予的增加的保护作用几乎是在IL-12鼻内治疗之后观察到的呼吸道抗体水平的显著增加的结果。
已经用于加强粘膜免疫应答的佐剂包括微生物产品例如CT和LT，这些已经用于各种各样的释放系统[Stasts,H.F.,等人，目前的免疫学观点6:572-583(1994)；Elson,C.O.,肠道疾病的病原体的机理，Paul,P.S.,等人，eds.,(NY:Plenum出版社)，pages 373-385(1997)]。CT是Th2-型应答的有效的诱导剂，而LT激发混合的Th1和Th2应答[Marinaro,M.,等人，实验方法杂志，185:415-427(1997)；T8kahashi,，I.,等人，感染性疾病173:627～35(1996)]。但是这些佐剂导致严重的腹泻，不适用于作为人的粘膜佐剂。也有最近的报道暗示CT实际上抑制IL-12的产生和IL-12受体的表达[Braun,M.,等人，实验方法杂志出版中(1999)]。此外对于呼吸道合胞体表达的感染，Th1应答是保护性的，而Th2应答导致肺发病[Graham,B.S.,等人临床投资杂志，88:1026-1033(1991)；Graham,B.S.,等人，免疫学杂志151:2032-2040(1991)]。因此鼻内IL-12给药加强流感疫苗的效率是与粘膜免疫接种的方案直接相关。等同作用参照优选的实施方案特定地证明和描述了本发明，本领域内技术人员将会明白对其形式和具体进行各种变化不会脱离由权利要求定义的本发明的精神和范围。本领域内技术人员将会认识到或能够明白利用不止一条的实验途径，本文特异性地描述了本发明的特定的实施方案的许多等同代替，这样的等同代替可用于包括在本发明的范围内。
权利要求
1．诱导宿主中对病原体的免疫应答的方法，它包括以有效量的白细胞介素-12和病原体的抗原鼻内给药宿主。
2．根据权利要求1所述的方法，其中病原体选自于包括细菌，病毒，分枝杆菌，寄生虫和真菌。
3．根据权利要求2所述的方法，其中细菌选自于下列组肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，流感嗜血菌。
4．根据权利要求2所述的方法，其中病毒选自于下列组脊髓灰质炎病毒，流感病毒，副流感病毒，呼吸道合胞体病毒。
5．根据权利要求2所述的方法，其中寄生虫选自于下列组利什曼虫，血吸虫，Tranpanosomes，弓形虫属，肺囊虫属。
6．根据权利要求1所述的方法，其中抗原来源于病原体的毒素。
7．根据权利要求1所述的方法，其中免疫应答是Th1-型细胞因子应答。
8．根据权利要求7所述的方法，其中Th1-型细胞因子应答导致IFN-？在宿主中的表达加强。
9．根据权利要求1所述的方法，其中免疫应答是体液免疫应答。
10．根据权利要求9所述的方法，其中体液免疫应答导致特异于抗原的IgG2a,IgG2b and IgG3抗体的表达加强。
11．加强宿主对病原体的免疫应答的方法，包括以有效量的白细胞介素-12和病原体的抗原给宿主鼻内给药。
12．根据权利要求11所述的方法，其中病原体选自于下列组细菌，病毒，分枝杆菌，寄生虫和真菌。
13．根据权利要求12所述的方法，其中细菌选自于下列组肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，流感嗜血菌。
14．根据权利要求12所述的方法，其中病毒选自于下列组脊髓灰质炎病毒，流感病毒，副流感病毒，呼吸道合胞体病毒。
15．根据权利要求12所述的方法，其中寄生虫选自于下列组利什曼虫，血吸虫，Tranpanosomes，弓形虫属，肺囊虫属。
16．根据权利要求11所述的方法，其中抗原来源于病原体的毒素。
17．根据权利要求11所述的方法，其中免疫应答是Th1-型细胞因子应答。
18．根据权利要求17所述的方法，其中Th1-型细胞因子应答导致IFN-γ？在宿主中的表达加强。
19．根据权利要求11所述的方法，其中免疫应答是体液免疫应答。
20．根据权利要求19所述的方法，其中体液免疫应答导致特异于抗原的IgG2a,IgG2b and IgG3抗体的表达加强。
21．诱导宿主对粘膜病原体的免疫应答的方法，其中包括以包括以有效量的白细胞介素-12和病原体的抗原给宿主鼻内给药。
22．根据权利要求21所述的方法，其中病原体选自于下列组细菌，病毒，分枝杆菌，寄生虫和真菌。
23．根据权利要求22所述的方法，其中细菌选自于下列组肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，流感嗜血菌。
24．根据权利要求22所述的方法，其中病毒选自于下列组脊髓灰质炎病毒，流感病毒，副流感病毒，呼吸道合胞体病毒。
25．根据权利要求24所述的方法，其中寄生虫选自于下列组利什曼虫，血吸虫，Tranpanosomes，弓形虫属，肺囊虫属。
26．根据权利要求24所述的方法，其中抗原来源于病原体的毒素。
27．根据权利要求21所述的方法，其中免疫应答导致特异于抗原的IgG2a,IgG2b和IgG3抗体的表达加强。
28．诱导宿主对病原体产生Th1-类免疫应答的方法，包括以有效量的白细胞介素-12和病原体的抗原鼻内给药宿主。
29．根据权利要求28所述的方法，其中病原体选自于下列组细菌，病毒，分枝杆菌，寄生虫和真菌。
30．根据权利要求29所述的方法，其中细菌选自于下列组肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，流感嗜血菌。
31．根据权利要求29所述的方法，其中病毒选自于下列组脊髓灰质炎病毒，流感病毒，副流感病毒，呼吸道合胞体病毒。
32．根据权利要求29所述的方法，其中寄生虫选自于下列组利什曼虫，血吸虫，Tranpanosomes，弓形虫属，肺囊虫属。
33．根据权利要求28所述的方法，其中抗原来源于病原体的毒素。
34．根据权利要求28所述的方法，其中Th1-型细胞因子应答导致IFN-γ在宿主中的表达加强。
35．根据权利要求34所述的方法，其中Th1-型免疫应答导致特异于抗原的IgG2a,IgG2b和IgG3抗体的表达加强。
36．加强宿主对病原体产生粘膜免疫应答方法，包括以有效量的白细胞介素-12和病原体的抗原鼻内给药宿主。
37．根据权利要求36所述的方法，其中病原体选自于下列组细菌，病毒，分枝杆菌，寄生虫和真菌。
38．根据权利要求37所述的方法，其中所述的细菌选自于下列组肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，流感嗜血菌。
39．根据权利要求37所述的方法，其中病毒选自于下列组脊髓灰质炎病毒，流感病毒，副流感病毒，呼吸道合胞体病毒。
40．根据权利要求37所述的方法，其中寄生虫选自于下列组利什曼虫，血吸虫，Tranpanosomes，弓形虫属，肺囊虫属。
41．根据权利要求36所述的方法，其中抗原来源于病原体的毒素。
42．根据权利要求36所述的方法，其中免疫应答是Th1-型细胞因子应答。
43．根据权利要求42所述的方法，Th1-型细胞因子应答导致IFN-γ在宿主中的表达加强。
44．根据权利要求36所述的方法，其中免疫应答是体液免疫应答。
45．根据权利要求44所述的方法，其中体液免疫应答导致特异于抗原的IgG2a,IgG2b和IgG3抗体表达加强。
全文摘要
本发明涉及利用白细胞介素－12鼻内给药加强宿主对病原体的免疫应答的方法。在一个实施方案,本发明涉及诱导宿主对病原体的免疫应答,包括以有效量的IL－12和病原体的抗原给宿主鼻内给药。在另一个实施方案中,本发明涉及诱导宿主对病原体的免疫应答的方法,包括以有效量的IL－12和病原体的抗原给宿主鼻内给药。在一个特定的实施方案中,本发明涉及诱导宿主对粘膜病原体的免疫应答的方法,包括以有效量的IL－12和病原体的抗原给宿主鼻内给药。本发明还包括诱导宿主对病原体的Th1型免疫应答的方法,包括以有效量的IL－12和病原体的抗原给宿主鼻内给药。本发明还涉及诱导宿主对病原体的粘膜免疫应答的方法,包括以有效量的IL－12和病原体的抗原给宿主鼻内给药。
文档编号A61P37/04GK1298307SQ99803679
公开日2001年6月6日 申请日期1999年3月4日 优先权日1998年3月5日
发明者丹尼斯·W·梅特泽杰, 伯纳德·P·阿鲁兰达姆 申请人:俄亥俄医学院