一种c型凝集素的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种鱼类C型凝集素的应用。
【背景技术】
[0002] 凝集素（lectin)是一类糖结合蛋白，广泛存在于动物和植物中。动物凝集素分为 几种不同亚类，其中一种为C型凝集素（C-typelectin)。所有C型凝集素都具有一个保守 的糖识别域（carbohydrate-recognitiondomain)，参与底物结合。大部分C型凝集素对底 物的识别依赖于钙离子。C型凝集素在多种生物过程中发挥作用，包括细胞间相互作用和细 胞信号传导等。许多C型凝集素能与病原表面的糖结合，造成病原凝集，从而诱发一系列免 疫反应，促进病原的清除。因此C型凝集素是一种重要的天然免疫防御因子。目前已知的 脊椎动物C型凝集素主要是作用于细菌和酵母，抗病毒C型凝集素尚无报道。
【发明内容】
[0003] 本发明目的在于提供一种鱼类（半滑舌鳎）C型凝集素的应用。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0005] 一种C型凝集素的应用，C型凝集素用于制备抗细菌或病毒感染的抑制剂。
[0006] 所述C型凝集素用于制备抗细菌或病毒感染的药物。
[0007] 所述C型凝集素用于制备鱼类抗病毒和抗细菌的药物或抑制剂，其中鱼类为半滑 舌鳎。
[0008] 所述C型凝集素为C型凝集素重组蛋白。
[0009] 所述C型凝集素在大肠杆菌中表达即得到重组蛋白。
[0010] 本发明具有如下优点：本发明的C型凝集素能够明显提高鱼类抗病毒和抗细菌感 染能力。
【附图说明】
[0011] 图1为本发明实施例提供的纯化的C型凝集素重组蛋白。其中，泳道1，分子量标 准；泳道2,C型凝集素。
[0012] 图2为本发明实施例提供的凝集素增强鱼类抵抗细菌和病毒侵染。其中，A为抗 细菌侵染；B为抗病毒侵染。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非以任何形式对本发明进行限制。
[0014] 实施例1
[0015] C型凝集素重组蛋白的制备
[0016] 1)表达C型凝集素重组蛋白的质粒pCTLl的构建：
[0017] 本发明中的C型凝集素基因序列已报道（GenBankaccessionnumber XP_008329461. 1)。以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增。PCR条件为： 94°C60s预变性模板DNA，然后 94°C40s，63°C60s，65°C60s，30 个循环。PCR产物用 天根的相应试剂盒纯化。将表达载体pET259(pET259构建过程参见HuYH，Zhengffff，Sun L.Identificationandmolecularanalysisofaferritinsubunitfromreddrum (Sciaenopsocellatus).FishShellfishImmunol2010 ;28:678-86)用限制性内切酶 SwaI酶切后与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5a， 在含卡那霉素（50ug/ml)的LB培养基上培养18 - 24小时，筛选转化子提取质粒，即为 pCTLl。DNA测序表明pCTLl含有编码C型凝集素序列的基因。
[0018] 所述LB组成成分按重量百分比计：1.0%蛋白胨，0. 5%酵母粉，1.0%氯化 钠，97. 5%蒸馏水。所述Fl为5' -GATATCATGITATCITTAAGCGAACCTGAGCC-3' ；R1为5'-GAT ATCAAGACAGCTCGAGGGACGGGTTGCAC-3 ' 〇
[0019] 2)重组C型凝集素蛋白的诱导表达和纯化
[0020]将上述的质粒pCTLl用常规方法转化大肠杆菌BL21 (DE3)(购自于"天根生化科技 有限公司"，北京），在含有卡那霉素（50ug/ml)的LB固体培养基上培养18 - 24小时，挑 取转化子，将其命名为BL21/pCTLl。
[0021] 将BL21/pCTLl于含有卡那霉素（50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取Iml 过夜后的培养液，加入100ml新鲜的含有卡那霉素（50ug/ml)的LB液体培养基中，于37°C 下转速200rpm摇动培养至OD6tltl为0. 6,加入终浓度为ImM的IPTG，37°C继续以转速160rpm 摇动培养4-5h，而后以5000g，4°C离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上 缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4°C离心30min，回收上清。 将上清中的蛋白用亲和层析柱HisTrapHPColumns(购于美国GEHealthcare公司）回 收纯化，将纯化的蛋白悬浮于PBS缓冲液。将纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测（8v/cm电 压下电泳25 - 30min，随后15v/cm电压下电泳2 - 2. 5h)，测定其分子量大小（参见图1)， 质谱分析证实纯化的蛋白具有C型凝集素蛋白的序列和保守的糖识别域。
[0022] 所述裂解液为终浓度的IOmMNaH2P04、IOmMTris和8M尿素，pH8. 0。
[0023] 所述PBS组成成分按重量百分比计：0. 8%NaCl, 0. 02%KC1, 0. 358% Na2HPO4. 12H20, 0? 024%NaH2PO4,余量为水。
[0024] 实施例2
[0025] 重组C型凝集素的免疫应用
[0026] 步骤1)凝集素的注射
[0027] 将上述实施例1获得的C型凝集素在PBS中稀释至20ug/ml，即为凝集素稀释液。 将20条半滑舌鳎（重约10.Ig)随机分为4组，每组5条。将这4组分别命名为A、B、C和 D。将A和C组的每条鱼分别注射50ul凝集素稀释液，将B和D组（对照组）的每条鱼分 别注射50ulPBS。
[0028] 所述PBS组成成分按重量百分比计：0. 8%NaCl, 0. 02%KC1, 0. 358% Na2HPO4. 12H20, 0? 024%NaH2PO4,余量为水。
[0029] 步骤2)细菌和病毒悬液制备
[0030] 在LB培养基中培养鳗弧菌C312至OD6tltl为0. 8,然后离心（5000g， 4 °C，IOmin)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为106cfu/ml，即为鳗弧菌 悬液。将细胞肿大病毒RBIV-Cl(具体制备方法见ZhangM，XiaoZ，HuY，Sun L.Characterizationofamegalocytivirusfromculturedrockbream,Oplegnathus fasciatus(Temminck&Schlege),inChina.AquacRes. 2012 ;43:556 - 64)于PBS中稀释至 105copies/ml，即为病毒悬液。
[0031] 所所述鳗弧菌C312保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCCNo. 6250,保 藏日期2012.6.21，分类命名为饅弧菌（/1131'；[03叩11；[113；101111)。
[0032] 步骤3)攻毒感染
[0033] 在上述步骤2)注射后lh，将A和B组的每条鱼注射IOOul上述步骤2)的鳗弧菌 悬液，将C和D组的每条鱼注射IOOul上述步骤2)的病毒悬液。在细菌感染后第2天，取 A和B组鱼肾脏和脾脏组织，在2mlPBS中匀浆，将IOOul匀浆液涂布于LB平板。将平板置 于30°C培养48h，计算出现的菌落数。在病毒感染后第7天，利用DNA提取试剂盒（购于 天根生化科技（北京）有限公司"）从C和D组鱼肾脏和脾脏组织中提取DNA，用绝对定量 PCR法检测组织中病毒含量（具体方法见上述参考文献）。结果表明A组鱼肾脏和脾脏的 细菌数（分别为323和327)显著（P〈0. 01)低于B组鱼肾脏和脾脏的细菌数（分别为460 和495) ;C组鱼肾脏和脾脏的病毒数（分别为6. 8XIO3和10. 8X10 5)显著（P〈0. 05)低于 D组鱼肾脏和脾脏的病毒数（分别为9. 3XIO5和13. 8X10 5)。（参见图2)。
[0034] 这些结果表明，本发明的C型凝集素能够显著增强鱼类抵抗细菌和病毒的侵染。
【主权项】
1. 一种C型凝集素的应用，其特征在于：c型凝集素用于制备抗细菌或病毒感染的抑制 剂。
2. 按权利要求1所述的C型凝集素的应用，其特征在于：C型凝集素用于制备抗细菌或 病毒感染的药物。
3. 按权利要求1或2所述的C型凝集素的应用，其特征在于：所述C型凝集素为C型 凝集素重组蛋白。
4. 按权利要求3所述的C型凝集素的应用，其特征在于：所述C型凝集素在大肠杆菌 中表达即得到重组蛋白。
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种鱼类C型凝集素的应用。C型凝集素用于制备抗细菌或病毒感染的抑制剂。本发明重组C型凝集素用于制备鱼类预防细菌或病毒感染的制剂，即能显著增强鱼类的抗细菌和抗病毒能力。CGMCC No.625020120621
【IPC分类】A61P31-12, A61P31-04, A61K38-17
【公开号】CN104623631
【申请号】CN201510010426
【发明人】孙黎, 周泽军
【申请人】中国科学院海洋研究所
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月9日