对于炎性肠疾病具有预防或治疗作用的包含百部提取物的药物组合物的制作方法_3

文档序号:8343786阅读:来源:国知局
酒、水果酒等。发酵食品的实例包括酱油、豆瓣酱、辣椒酱等。罐头食品的实 例包括海产罐头食品(如罐头金枪鱼、鲭鱼、秋刀鱼、海螺等)、畜牧罐头食品(罐头牛肉、猪 肉、鸡肉、火鸡等)、农产品罐头食品(罐头玉米、桃子、菠萝等)。牛奶加工食品的实例包括 奶酪、黄油、酸奶等。肉类加工食品的实例包括猪肉饼、牛肉饼、鸡肉饼、香肠、咕嗜肉、鸡块、 烤牛肉片等。面条的实例包括密封和包装的鲜面条。此外,组合物可用于制造甑煮食品、汤 等。
[0052] 如本文使用的,具有与术语"特殊保健用(FoSHU) "相同的含义的术语"功能性食 品"是指在医药和医学治疗上高效地,调节以有效地发挥身体调节功能,以及提供养分的食 品。功能性食品可以被制备成各种形式,包括片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、液体剂、丸剂等, 以获得对于预防或改善炎性肠疾病有用的效果。
[0053] 实现所述目的的本发明的又一方面,提供用于抑制炎性细胞因子表达的方法,其 包括以本发明的药物组合物治疗具有炎性细胞因子过表达的组织或细胞。
[0054] 如本文使用的,术语"炎性细胞因子"是指在体内诱发炎症反应的细胞因子,且炎 性细胞因子可以包括IL-I β、TNF-a、IL-6、MCP-I等,但不限于此。
[0055] 根据本发明的一个实施方案,炎性肠疾病发生在暴露于香烟烟雾的小鼠中,因此 增加炎性细胞因子如TNF-a、IL-6和IL-I β的表达水平。但是,当对小鼠施用本发明的 药物组合物时,抑制了炎性细胞因子如TNF-a、IL-6和IL-I β表达水平的增加(图4a至 4c)。此外,MMP12(已知其破坏弹性蛋白和胶原蛋白)的mRNA水平显示了相同的模式(图 4d)
[0056] 以下,通过如下文所列的以下实施例更详细地解释本发明,但它们公开仅用于说 明用途,并且不应当被解释为限制本发明的范围。
[0057] 实施例1 :百部提取物对细朐系的作用
[0058] 实施例1-1 :材料的制各
[0059] 首先,将购自SUN TEN(台北,台湾)的百部热水提取物的干燥粉末溶解于水中,并 过滤获得百部液体提取物(蔓生百部根的提取物,ERSJM)。
[0060] 同时,将购自韩国细胞系库(KCLB)的RAW264. 7细胞系在DMEM培养基中(10% FBS,1%生理盐水)孵育,并在具有5% 0)2且保持在37°C的培养箱中培养。
[0061] 实施例1-2 :百部提取物细朐毒件评价
[0062] 实施例1中培养的RAW264. 7细胞系以2xl05细胞/孔的浓度等分至96孔板中,加 入DMEM培养基,并在具有5 % 0)2且保持在37 °C的培养箱中培养。然后,从培养的细胞中去 除培养基,以包含〇、1、10或100 μ g/mL浓度的百部提取物且不含FBS的DMEM培养基补充, 并在具有5% 0)2且保持在37°C的培养箱中再培养24小时。培养完成后,在每个孔中加入 50 μ L MTT溶液(2mg/mL),使其在具有5% 0)2且保持在37°C的培养箱中反应4小时,从每 个孔中去除培养基,加入200 yL DMSO,并使用ELISA酶标仪测定它们各自的吸光度。比较 由此获得的吸光度以评价百部提取物的细胞毒性(图1)。
[0063] 图1是阐明百部提取物细胞毒性评价结果的图。如图1所示,即使以高浓度百部 提取物(蔓生百部的提取物,ERSJM)处理时,也未观察到细胞毒性。因此,其证实了百部提 取物是安全无细胞毒性的材料。
[0064] 实施例1-3 :百部提取物对一氣化氮(NO)牛成的作用
[0065] 已知炎性肠疾病(例如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)病人血浆中的一氧化氮(NO) 的浓度显著增加。就此而言,检验了百部提取物对LPS处理以人工地增加 NO生成的细胞系 的作用。
[0066] 具体而言,实施例1中培养的RAW264. 7细胞系以IxlO6细胞/孔的浓度等分至96 孔板中,加入DMEM培养基,并在具有5 % 0)2且保持在37 °C的培养箱中培养。然后,从培养 的细胞中去除培养基,分别以包含〇、1、10或100 μ g/mL浓度的百部提取物且不含FBS的 DMEM培养基补充,并在具有5% 0)2且保持在37°C的培养箱中再培养。两小时后在每个孔 中加入LPS至终浓度为1 μ g/mL并培养24小时。培养完成后,收集每个孔中的上清液,并 在其中加入格里斯试剂。检测、比较每个孔中所得的NO生成水平,并且评价百部提取物对 NO生成的作用(图2)。特别地,用作对照组的细胞系未进行任何处理,而用作比较组的细 胞系只用LPS而未用百部提取物处理。
[0067] 图2是阐明百部提取物对NO生成作用的评价结果的图。如图2所示,相比于对照 组(con),在以LPS处理的比较组中(Ips),N0的水平迅速增加,但是NO的水平随着百部提 取物(ERSJM)处理浓度的增加而减少。
[0068] 因此,其证实了百部提取物对由NO生成所致的细胞损伤有抑制作用。
[0069] 实施例1-4 :百部提取物对炎件细朐闵子牛成的作用
[0070] 检验了百部提取物对实施例1-3中制备的以LPS处理的各自RAW264. 7细胞系中 炎性细胞因子(TNF-α、IL-I β、IL-6、或MCP-1)生成水平的作用。
[0071] 首先,将对应于各个炎性细胞因子(TNF-a、IL-6、IL_1 β或MCP-1)的各自的抗体 包覆在ELISA试剂盒的底物上,并将其放置在4°C过夜。然后,通过向其上加入分析稀释剂 封闭各个底物,并以实施例1-3制备的LPS处理的各个RAW264. 7细胞系获得的培养上清液 进行处理,加入ELISA试剂盒的检测抗体,加入ELISA试剂盒的TMB溶液以诱发显色反应。 然后,通过应用ELISA酶标仪测定所得的底物的吸光度,并进行相互比较(图3a至3d)。
[0072] 图3a是阐明百部提取物对TNF- α生成作用的评价结果的图;图3b是阐明百部提 取物对IL-I β生成作用的评价结果的图;图3c是阐明百部提取物对IL-6生成作用的评价 结果的图;图3d是阐明百部提取物对MCP-I生成作用的评价结果的图。
[0073] 如图3a至3d所示,在RAW264. 7细胞系中,相比于对照组(con),在以LPS处理的 比较组中(Ips)炎性细胞因子的水平迅速增加,但是炎性细胞因子的水平随着百部提取物 (ERSJM)处理浓度的增加而降低。
[0074] 因此,其证实了百部提取物对炎性细胞因子的生成具有抑制作用。
[0075] 实施例2 :百部提取物对小鼠的作用
[0076] 实施例2-1 :以香烟烟雾处理的炎件肠疾病(IBD)的诱发
[0077] 已知香烟诱发炎性肠疾病(IBD) (Gareth A 0 Thomas 等人,Postgrad. Med. J., 76(895) :273-279, 2000年5月),因此将小鼠暴露于香烟烟雾中以诱发小鼠炎性肠疾病。
[0078] 首先,使六周龄体重20g至25g的雌性C57BL/6小鼠自由接近食物和水,将饲养室 温度设定为21 °C至24°C,湿度为40 %至60%,并且在12小时间隔控制光-暗循环。
[0079] 以100mg/kg的剂量将实施例1-1获得的百部液体提取物口服施用由此饲养的小 鼠,将其放入烟雾室中,通过吸烟3支参照香烟3R4F (肯塔基大学,列克星敦市,肯塔基州) 而暴露于香烟烟雾中30分钟,在从中除去香烟烟雾后在其中保持30分钟,香烟烟雾处理过 程重复4次,整个香烟烟雾处理过程以每日1次,每周5次,进行三周,由此诱发小鼠炎性肠 疾病(IBD),并将它们用作为实验组。特别地,未用香烟烟雾处理的小鼠用作对照组(CON), 暴露于香烟烟雾,但未用百部液体提取物处理的小鼠作为
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