梯度。
[0131] 8.通过HPLC测定脂质浓度。
[0132] 9?将脂质体悬浮液加热到50°C并缓慢加入环丙沙星粉末（总脂质质量的60% ) 并同时搅拌。逐渐加入环丙沙星（每4分钟加入质量的10%，在40分钟内进行）并且将产 物在50°C温育20分钟，然后加入最后一小份以完成药物装载过程。
[0133] 10.相对于3体积的145mM NaCl，5mM乙酸盐，pH 4. 0进行装载有环丙沙星的脂质 体的渗滤以除去未包封的环丙沙星，在其中游离环丙沙星是可溶的条件下进行。
[0134] 11.相对于5体积的145mM NaCl，25mM组氨酸，pH 6. 0进行装载有环丙沙星的脂 质体的渗滤以除去任何残留的未包封的环丙沙星，进一步降低残留溶剂的水平并进行外部 缓冲液的交换用于所需的最终产物缓冲液。
[0135] 12.将制剂超滤达到环丙沙星浓度为50mg/mL (生产中的检验要求）。
[0136] 13.将脂质体预先过滤通过0. 45/0. 2微米的滤板以除去可阻塞灭菌级过滤器的 粒子。使用的过滤器实际上是灭菌级过滤器；然而，它们在高压下被使用而不与它们的无菌 过滤作用相矛盾。
[0137] 14.在此过滤通过0. 2微米的灭菌级过滤器。
[0138] 15.样品的装瓶和包装。
[0139] 总的制造方案如图1所示。
[0140] 感染模型的说明：
[0141] 在铜绿假单胞菌肺感染的小鼠模型中评价了包封环丙沙星的脂质体。在用装载 有铜绿假单胞菌的琼脂糖小珠感染后，经内脏校正的Cftr剃除小鼠已经显示具有囊性纤 维化肺表型（van Heeckeren等人，2004)，并且与UNC Cftr剃除小鼠具有相似的炎性应答 (van Heeckeren等人，2004)。所有这些特征使得其成为被选品系用于研宄药物在囊性纤 维化肺感染小鼠模型中是否具有效力，如果没有效力是否在野生型小鼠和囊性纤维化小鼠 之间具有差别性应答。一种性别即雄性小鼠用于消除性别带来的可能的混淆。所有小鼠为 6-8周龄并且重量大于16克。
[0142] 装载有铜绿假单胞菌的琼脂糖（PA)小珠如前所述被制造和使用（van Heeckeren 等人，1997, van Heeckeren 等人，2000, van Heeckeren 和 Schluchter, 2002)，具有微小差 异。对小鼠灌注小珠的1:35的稀释物，并且小珠被递送进入用异氟烷麻醉的小鼠中。将其 确立为是LD50剂量，尽管由于实验与实验之间的细微差别可导致不可预测的差别性应答。 也就是说，在一个实验中，所述剂量是LD50,但是在另一个实验中，所述剂量可以是LD90。 因为本发明人所关心的是研宄这些药物是否具有临床效力，本发明人试图获得在被感染的 CF对照小鼠中的LD50和LD90范围之间的剂量。如果小鼠濒临死亡（正位反射严重延迟和 可触知的变冷）则进行干预性安乐死，并且进行尸体解剖以确定是否有明显的肺感染。被 处死的小鼠与已发生自发性死亡的小鼠一样被包含在内。
[0143] 脂质体环丙沙星治疗：
[0144] 脂质体环丙沙星制剂或赝品（稀释剂）（< 0. 05ml)经鼻内递送。
[0145] 剂量-范围探索研宄的设计：
[0146] 实验了三个剂量：由99%的被包封的环丙沙星和1 %的游离环丙沙星组成的全部 浓度（50mg/ml)环丙沙星的10%、33%和100%，加上脂质体稀释剂作为阴性对照。通过稀 释制备了低剂量和中剂量。在第〇天，对小鼠经气管接种装载有铜绿假单胞菌的琼脂糖小 珠，其在无菌PBSpH 7. 4中以1:35稀释。在第2-9天，小鼠每天一次用药物或稀释剂赝品 治疗。在第10天，将小鼠处死，测量结果包括临床征象（包括表皮质量、姿势、将其置于侧 卧姿势后自身变成正卧的能力，走动），最初体重的改变，和存活。在处死时，注意到了大体 肺病理，使用lml无菌PBS pH7.4进行支气管肺泡灌洗（BAL)，检验了全血、未处理的BAL液 和脾匀浆中是否存在铜绿假单胞菌，并且使用血球计进行BAL细胞的计数。
[0147] 存活结果：
[0148] 图2显示了每组存活超过10天的累积存活率，作为存活小鼠数的百分数被报道。 在第10天，用脂质体环丙沙星治疗的三个组比稀释剂对照组具有更高的存活率。在每个用 脂质体治疗的组中仅有2例死亡，而在稀释剂组中有6例死亡。在所有组中100%剂量组具 有最长存活，所有小鼠存活超过5天，而其它组全都在第5天时有2例死亡。
[0149] 鼻内给药（以靶向于肺）用脂质体包封的环丙沙星（其包含约1%的游离的环丙 沙星）增加了罹患铜绿假单胞菌肺感染的小鼠的存活率。因此，吸入式脂质体环丙沙星在 囊性纤维化患者中是有效的，或者在具有肺感染的其它疾病中是有效的。
[0150] 图2表示在感染后的累积存活率。在第0天用装载有铜绿假单胞菌的琼脂糖感染 小鼠。小鼠从第2天开始到第9天结束，每天使用三种不同浓度（100%，空心菱形；33%实 心正方形；或10%，空心三角形）之一的环丙沙星（药物）的脂质体制剂进行鼻内治疗。稀 释剂用作对照（实心圈）。在第10天处死存活的小鼠。
[0151] 实施例2
[0152] 未包封的环丙沙星的制备：制备了浓度为30mg/mL的未包封的或"游离"的环丙沙 星在10mM乙酸钠pH 3. 2中的溶液。
[0153] 被包封环丙沙星的制造：如实施例1所述，将环丙沙星（50mg/mL)包封在脂质体 中，该脂质体组成如下：氢化大豆磷脂酰基-胆碱（HSPC) (70. 6mg/mL)、天然大豆磷脂酰胆 碱的半合成的全氢化衍生物（SPC)和胆固醇（29. 4mg/mL)。该脂质体制剂的表征表明有约 1 %的环丙沙星是游离的；也就是说，其未被包封在脂质体内。
[0154] 感染模型的说明：如实施例1所述，在另外两个实验中在铜绿假单胞菌肺感染小 鼠模型中评价了包含游离的环丙沙星和用脂质体包封的环丙沙星的制剂。
[0155] 剂量-范围探索研宄的设计：在两个单独实验中评价了一个剂量的游离环丙沙星 和脂质体环丙沙星的组合（〇. 36mg/kg游离环丙沙星和0. 6mg/kg脂质体环丙沙星），两个 剂量的脂质体环丙沙星（〇.6mg/kg和1.2mg/kg)和作为阴性对照的脂质体稀释剂。在第0 天，对小鼠经气管接种装载有铜绿假单胞菌的琼脂糖小珠，其在无菌PBS pH 7. 4中以1:35 稀释。在第2-9天，小鼠每天一次用药物或稀释剂赝品处理。在第0天，将小鼠处死。测量 结果包括临床征象（包括表皮质量、姿势、将其置于侧卧后自身变成正卧的能力，走动），最 初体重的改变，和存活。在处死时，注意到了大体肺病理，使用lml无菌PBS pH 7. 4进行支 气管肺泡灌洗（BAL)，检验了全血、未处理的BAL液和脾匀浆中是否存在铜绿假单胞菌，并 且使用血球计进行BAL细胞的计数。
[0156] 存活结果：表1显示了每组在超过10天后的累积存活率，作为得自两个研宄的存 活小鼠数的百分数被报道。在第10天，用游离环丙沙星和脂质体环丙沙星的组合治疗的所 有组比稀释剂对照组具有更高的存活率。
[0157] 表1 :得自在铜绿假单胞菌肺感染CF小鼠中进行的两个研宄中的每组平均存活 率，采用鼻内滴注ARD-3100或对照进行治疗。
[0158]
【主权项】
1. 用于治疗感染的粒子的气雾化组合物，其包括： 游离的未包封的环丙沙星； 可药用的赋形剂；和 用脂质体包封的环丙沙星，其中所述脂质体组成如下：50mg/mL的环丙沙星、70. 6mg/ mL的氢化大豆磷脂酰基-胆碱、天然大豆磷脂酰胆碱的半合成的全氢化衍生物和29. 4mg/ mL的胆固醇，其中脂质的平均粒度为75到120nm，以及其中所述脂质体被悬浮在由25mM组 氨酸和145mM NaCl组成的pH 6. 0以及300m0sm/kg的等渗缓冲液中，以及所述脂质体的脂 质为双分子层结构； 其中该组合物被配制用于气雾化递送。
2. 权利要求1的气雾化组合物，其中用脂质体包封的环丙沙星以每小时0. 1到100% 的速率被释放，在1到24小时后发生抗生素的接近完全的释放。
3. 权利要求1的气雾化组合物，其中用脂质体包封的环丙沙星以每小时0. 5到20%速 率被释放，在1到24小时后发生抗生素的接近完全的释放。
4. 权利要求1的气雾化组合物，其中用脂质体包封的环丙沙星以每小时2到10%的速 率被释放，在1到24小时后发生抗生素的接近完全的释放。
5. 权利要求1的气雾化组合物，其中脂质体具有的直径为10纳米到10微米。
6. 权利要求1的气雾化组合物，其还包含选自支气管扩张药和抗炎药的附加的药学活 性药物。
7. 权利要求6的气雾化组合物，其中支气管扩张药选自β -肾上腺素能受体激动剂、抗 毒蕈碱药物及其组合。
8. 权利要求6的气雾化组合物，其中抗炎药选自皮质留类、白细胞三烯受体拮抗体、白 细胞三烯合成抑制剂和环加氧酶抑制剂。
9. 权利要求1的气雾化组合物，其中游离的环丙沙星占总的游离的环丙沙星和用脂质 体包封的环丙沙星的1到75%。
【专利摘要】本发明涉及提供立即释放模式和持续释放模式双重作用的吸入制剂，具体地，涉及配制立即释放和持续释放抗感染药物的方法和递送这种抗感染药物用于治疗呼吸道感染和其它医学状况，以及与这些有关所用的装置和制剂。
【IPC分类】A61K9-72, A61P31-00, A61K31-496, A61P11-00, A61K9-127, A61K45-06, A61K9-12
【公开号】CN104666248
【申请号】CN201510089105
【发明人】大卫·C·奇波拉, 詹姆斯·布兰查德
【申请人】阿拉迪姆公司
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2007年10月23日
【公告号】CA2667494A1, CA2667494C, CN101553209A, EP2079443A2, EP2079443A4, EP2079443B1, EP2759292A1, EP2789330A1, US8268347, US8414915, US20120244206, US20120282328, WO2008063341A2, WO2008063341A3