E6) 的Fab抑制MUCl阳性癌细胞的生长，但干细胞特异性抗体2D6C3和2D6C8 (C3和C8)的Fab 则不。图16表明，癌症特异性或干细胞特异性抗体的Fab对于MUCl阴性细胞，如PC3前列 腺癌细胞，均没有影响。
[0133] 作为结合特异性的再一种测试，可以体内测试选择为干细胞特异性的抗体并测定 它们刺激干细胞或祖细胞生长的能力。可以体内测试癌症特异性抗体抑制癌细胞生长的能 力。在一个实施例中，为了测试利用本发明的方法确定的癌细胞抗体的体内效应，其中已植 入雌激素颗粒的雌性裸鼠被异种移植有人乳腺肿瘤细胞（T47D)。在用80mg/kg的E6 Fab， 每周两次，来治疗小鼠以前，允许植入肿瘤14天。对同等数目的对照小鼠仅注射缓冲液。 在第31天至第45天的14天期限暂停治疗以确定经治疗的小鼠是否将发展对治疗的抗性。 图17的图形表明，相比于对照小鼠，E6 Fab有效地降低了肿瘤生长速率和容积。在治疗的 14天流逝以后小鼠继续回应E6 Fab的事实表明，它们并没有发展耐药性。图18示出所研 宄的两只小鼠的照片。
[0134] 在另一种体内研宄中，使雄性NOD/SCID小鼠异种移植有人前列腺肿瘤（DU-145)。 在开始治疗或模拟治疗以前，允许肿瘤发展14天。在肿瘤移植60天以后，组被交换；接收 癌细胞抗体E6 Fab的小鼠仅被给予缓冲液，以及对照组开始接收E6 Fab。治疗是每24小 时给予160mg/kg的E6 Fab。图19的图形表明，治疗组具有比对照组显著更小的肿瘤。在 交换治疗组以前，在对照组中的肿瘤比治疗组中的肿瘤大三倍以上。此外，当暂停治疗时， 经治疗的小鼠的仅之一具有肿瘤生长的增加。图20是MUCl*的Western印迹，其表明，甚 至在没有治疗的2周以后，平均而言，治疗组也具有比对照组更少的MUC1*。另外，图20的 图形表明，治疗组具有增加量的它们产生的微RNA-145 (miR-145)，其说明，E6 Fab治疗引起 癌细胞分化，其限制了它们自我复制的能力。
[0135] 在用来测试利用本发明方法确定的癌细胞抗体的功效的另一动物研宄中，使雄性 NOD/SCID小鼠异种移植有人前列腺肿瘤（DU-145)。在开始治疗或模拟治疗以前，允许肿瘤 发展27天。将动物分为四组，其中组1和2具有350-500mm 3的肿瘤容积以及组3和组4具 有175-300mm3的肿瘤容积。治疗是每24小时给予160mg/kg的E6 Fab (组1和3)以及模 拟治疗是仅给予缓冲液（组2和组4)。图21的图形表明，在对照小鼠中的肿瘤以相同的速 率进行生长而不管它们的起始容积。虽然两个治疗组均具有比对照组小得多的肿瘤，但其 肿瘤为175-300mm 3的小鼠反应好于携带350-500mm3的肿瘤（在开始治疗以前）的组。图 22示出来自对照组的小鼠的代表性照片以及图23示出来自治疗组的小鼠的代表性照片。
[0136] 因此，可以差不多以和使用ESA和CSF如红细胞生成素针剂和白细胞素的相同的 方式来使用干细胞特异性抗体2D6C3和2D6C8 (C3和C8)、以及利用本发明方法鉴定或选择 的其它单克隆抗体、多克隆抗体和抗体变体，包括以加速自化疗效果的血细胞的恢复，在骨 髓移植以后使用，在干细胞移植以前或以后使用，其可以被移植到周围血液，和/或以治疗 患者，其可以得益于造血干细胞或血细胞或它们的祖细胞的增加的生产。有几种方法来人 源化干细胞特异性抗体2D6C3和2D6C8 (C3和C8)、以及利用本发明方法鉴定或选择的其它 单克隆抗体、多克隆抗体和抗体变体，其中小鼠单克隆抗体的恒定区被同源人恒定区替代 以及其中可变区可以保留为小鼠序列或被同源人序列替代。噬菌体展示技术可以连同本发 明的肽一起用来选择最好结合于优选的MUCl*肽的抗体。可替换地，可以从头筛选完全人 抗体文库结合于用于选择干细胞特异性抗体的肽或用于选择癌症特异性抗体的肽的能力。 如果期望干细胞特异性抗体，则可以在去选择过程中筛查候选抗体结合于癌症特异性肽的 能力。
[0137] 癌症特异性抗体如C2 (MIN-C2)和E6 (MIN-E6)以及利用本发明方法鉴定或选择的 其它单克隆抗体、多克隆抗体和抗体变体可以用来治疗癌症患者，并具有降低的杀伤患者 的干细胞或血细胞前体和祖细胞的风险。有几种方法来人源化癌症特异性抗体C2 (MIN-C2) 和E6(MIN-E6)、以及利用本发明方法鉴定或选择的其它单克隆抗体、多克隆抗体和抗体变 体，其中小鼠单克隆抗体的恒定区被同源人恒定区替代以及其中可变区可以保留为小鼠序 列或被同源人序列替代。噬菌体展示技术可以连同本发明的肽一起用来选择最好结合于优 选的MUCl*肽的抗体。可替换地，可以从头筛选完全人抗体文库结合于用于选择干细胞特 异性抗体的肽或用于选择癌症特异性抗体的肽的能力。如果期望癌症特异性抗体，则可以 在去选择过程中筛查候选抗体结合于干细胞特异性肽的能力。
[0138] 本发明包括抗体以及抗体样蛋白，包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗 体、人源化抗体、单链抗体、抗体片段等。此外，本发明包括蛋白支架应用于生成抗体模拟 物以获得蛋白质，其可以通过本文描述的结合测定和按照本发明的方法被表征为是干细胞 抗体或癌细胞抗体，因而能够特异性地结合于MUCl* (当它存在于癌细胞上时），或结合于 MUCl* (当它存在于干细胞、祖细胞或工程细胞（其表达一种形式的MUCl*)上时。本发明进 一步包括利用在这里阐述的方法来确定抗体，它们识别在MUCl*胞外域内的特异性表位， 其表达在不同类型的祖细胞或非肿瘤癌细胞上。
[0139] 通常，用于癌症的治疗的抗体应抑制MUCl*受体的二聚化。因此，在一种优选的实 施方式中，用于治疗MUCl阳性癌症的抗体是单价抗体，如Fab、单链抗体，或双特异性抗体。 本发明确实设想将抗体如五价IgM用于癌症的治疗，这是因为多价可以用来再群集MUCl* 胞外域。然而，在足够高的浓度下，二价抗体将一个抗体结合于每个受体而不是一个抗体/ 每一个受体并且在这样做时对于肿瘤生长和发展也是抑制性的。
[0140] 通常，本发明的适合于刺激干细胞和祖细胞生长的抗体是二价的以致它们激活生 长，存活和多能性途径，其中通过二聚化MUCl*胞外域。干细胞和祖细胞特异性抗体可以用 来治疗患有贫血、低白细胞计数、低血小板或任何血细胞或血液祖细胞缺乏的患者。另外， 本发明设想干细胞和祖细胞特异性抗体用作抗老化治疗剂、用来促进整体健康的制剂、用 来增强干细胞或祖细胞生长或用来增强细胞植活的制剂。如在用于用机械方式可到达的身 体的眼睛或其它区域的药剂中，可以全身或局部地、作为注射剂或作为局部治疗，将这里描 述的干细胞和祖细胞特异性抗体给予患者。
[0141] 二价干细胞特异性抗体2D6C3和2D6C8 (C3和C8)、以及利用本发明方法鉴定或选 择的其它单克隆抗体、多克隆抗体和抗体变体可以用来体外或体内刺激干细胞生长或可以 可替换地用来增强干细胞移植物的植活，而不考虑来源。在另一种实施方式中，本发明的干 细胞特异性二价抗体用来体外或体内刺激造血干细胞的生长。在一些情况下，干细胞抗体 用来治疗患有贫血或低白细胞计数或具有发展贫血或低白细胞计数的风险的患者。这些患 者可以患有癌症并且可以用本发明的癌细胞抗体加以同时治疗，用于抑制他们的癌细胞生 长。
[0142] 在另一个方面，本发明的抗体和肽用于诊断。使患者细胞接触癌症特异性抗体并 获得显著结合将表明患者患有癌症。类似地，使患者细胞接触干细胞特异性抗体并获得显 著结合将表明患者未患癌症并且将进一步确定那些细胞为干细胞或祖细胞。可以用两种类 型的抗体来接触患者细胞以区别开干细胞和癌细胞。可以体外或体内进行上述诊断。在体 外，可以利用癌症或干细胞特异性抗体来分析组织样品、血液样品、或体液样品。在体内，可 以将显像剂附着于本发明的抗体以能够鉴定在患者中的癌症或干细胞。
[0143] 实施例
[0144] 实施例1 -促进人干细胞附着于表面的单克隆抗体、2D6C8和2D6C3 (在本文中还 被称为C3和C8)的开发
[0145] 鉴定了 MUCl*单克隆抗体，这些抗体优先结合于MUCl*胞外域的部分，其更远离细 胞表面，以及这些单克隆抗体显示更好的促进人ES和iPS细胞到表面的附着。用由PSMGFR 序列定义的肽使小鼠免疫。通过ELISA来测试杂交瘤克隆的上清液结合于PSMGFR肽的能 力以及通过FACS来确定何者结合于活的MUCl*阳性细胞。如果它们优先结合于PSMGFR肽 (缺少10个C端氨基酸），但如果肽缺少10个N端肽则并不结合，那么进一步选择杂交瘤。 此外，筛选杂交瘤促进干细胞附着于表面如塑料细胞培养板的能力。在这些克隆中，选择了 两种，2D6C8和2D6C3,当被涂布在表面上时其捕获干细胞并促进它们的生长。
【主权项】
1. 一种用于治疗患者的方法，所述患者将得益于所述患者的干细胞的刺激，所述方法 包括给予所述患者特异性地结合于表达在人未分化干细胞上的MUC1蛋白的表位的抗体。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗体特异性地结合于SEQIDNO:4、SEQID 勵:5、5￡〇10勵:6、5￡〇10勵:9、5￡〇10勵：10或5￡〇10勵：11的肽的至少6个连续氨 基酸。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗体并不结合于或显著较少结合于SEQID NO: 3、SEQIDNO: 7 或SEQIDNO:8 的肽。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述患者患有癌症。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述患者患有癌症并且正在接受化疗或放疗。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述患者患有慢性肾脏疾病。
7. -种用于治疗患有癌症或具有发展癌症的风险的患者的方法，包括给予所述患者抗 体，所述抗体特异性地结合于表达在癌细胞上但并不表达在人未分化干细胞上的MUC1蛋 白的表位。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中，所述抗体特异性地结合于SEQIDNO: 3的肽并且 并不结合于或显著较少结合于SEQIDNO:4的肽。
9. 一种用于治疗被诊断为患有MUC1阳性癌症的患者的方法，包括给予所述患者单价 癌细胞特异性抗体。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中，所述癌细胞特异性抗体特异性地结合于SEQID N0:3的肽并且并不结合于或显著较少结合于SEQIDN0:4的肽。
11. 一种用于治疗被诊断为患有MUC1阳性癌症的患者的方法，包括给予所述患者单价 癌细胞特异性抗体和二价干细胞特异性抗体。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中，所述癌细胞特异性抗体特异性地结合于SEQ IDNO:3的肽并且并不结合于或显著较少结合于SEQIDNO:4的肽。
13. 根据权利要求11所述的方法，其中，所述干细胞特异性抗体特异性地结合于SEQ 10勵：4、5￡〇10勵：5、5￡〇10勵：6、5￡〇10勵：9、5￡〇10勵：10或5￡〇10勵：11的肽 的至少6个连续氨基酸，并且并不结合于或显著较少结合于SEQIDNO:3、SEQIDNO:7或 SEQIDNO:8 的肽。
14. 一种用于增殖干细胞或祖细胞的方法，包括使所述细胞接触抗体，所述抗体特异性 地结合于表达在人干细胞上的MUC1蛋白的表位，而没有引起癌细胞的增殖。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中，所述抗体特异性地结合于SEQIDNO:4、SEQ 10勵:5、5￡〇10勵:6、5￡〇10勵:9、5￡〇10勵：10或5￡〇10勵：11的肽的至少6个连续 氨基酸。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中，所述抗体并不结合于或显著较少结合于SEQ IDNO: 3、SEQIDNO: 7 或SEQIDNO:8 的肽。
17. -种获得特异性地结合于干细胞但并不结合于癌细胞的抗体的方法，包括以下步 骤： (i) 生成混合的抗体的组，所述抗体识别肽，所述肽的序列是具有SEQIDNO: 1-11的序 列的任何肽的序列； (ii) 选择结合于SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、或SEQIDN0:6的肽但并不结合于SEQ IDNO:3的肽的那些抗体； (iii) 选择当被吸附到表面上时促进干细胞的附着的那些抗体；以及 (iv) 选择当处于二价形式时刺激干细胞的生长而当处于单价形式时抑制干细胞的生 长，同时对癌细胞没有影响的那些抗体。
18. -种获得特异性地结合于癌细胞但并不结合于干细胞的抗体的方法，包括以下步 骤： (i) 生成混合的抗体的组，所述抗体识别肽，所述肽的序列是具有SEQIDNO: 1-11的序 列的任何肽的序列； (ii) 选择结合于SEQIDN0:3的肽但并不结合于SEQIDN0:4、SEQIDN0:5或SEQ IDNO:6的肽那些抗体； (iii) 选择当被吸附到表面上时促进癌细胞的附着的那些抗体，；以及 (iv) 选择当处于二价形式刺激癌细胞的增殖而当处于单价形式时抑制癌细胞的生长， 同时对干细胞的增殖没有影响的那些抗体。
【专利摘要】本申请披露了用于治疗患者的方法，该患者将得益于患者的干细胞的刺激，该方法包括给予患者特异性地结合于表达在人未分化干细胞上的MUC1蛋白的表位的抗体。
【IPC分类】A61K39-395, C12N5-00, C12N5-02
【公开号】CN104717980
【申请号】CN201380053708
【发明人】辛西娅·巴姆达德
【申请人】米纳瓦生物技术公司
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2013年8月14日
【公告号】CA2882222A1, EP2885000A2, WO2014028668A2, WO2014028668A3