油佐剂为由94% (V/V)矿物油（10号白油）、6% (V/V)的Span-80、2% (g/V) 硬脂酸铝加热溶解后形成的淡黄色油状液体；油佐剂为疫苗蛋白溶液与油佐剂经乳化而形 成的粘稠的乳白色油包水型疫苗。一般采用注射接种，为现有技术中常用的产品，是目前在 动物用灭活疫苗中使用较广的佐剂。
[0033] 所述铝胶佐剂也为动物用灭活疫苗中使用较广的佐剂。
[0034] 实施例2 :小鼠可溶性IL_4Ra (sIL-4Ra )与截短型IL-4(IL-4_T118S)融合表达 质粒的构建与表达
[0035] 根据小鼠 IL-4Ra与IL-4的全基因或部分基因编码序列，设计一对合适的引物， 通过RT-PCR方法分别扩增主要IL-4R a cDNA序列（50个氨基酸）和IL-4的前118个氨基 酸cDNA序列。然后，经过DNA序列测定，证明所扩增的cDNA序列准确无误后，再将其克隆至 pET-32融合表达载体的适当部位，并进一步将重组质粒以及pET-32表达载体空白对照质 粒转入适当表达用大肠杆菌菌株中，经过规模发酵，提取纯化小鼠 sIL-4Ra与IL-4-T118S 融合蛋白以及载体对照蛋白。
[0036] 实施例3 :小鼠 IL-4、IL-4S、IL_4Ra与IL-13基因重组疫苗、小鼠 sIL_4Ra与 IL-4-T118S融合蛋白以及载体对照蛋白的安全性试验与过敏反应试验
[0037] 按实施例1的方法，将纯化IL-4、IL_4Ra蛋白或IL-4S、IL_13融合蛋白或载体对 照所表达的蛋白用生理盐水（或PBS)适当稀释后与油佐剂或铝胶佐剂按1:1的体积比混 合制备成IL-4、IL-4Ra蛋白或IL-4S、IL-13融合蛋白疫苗或载体对照蛋白疫苗。制备好 的IL-4、IL-4Ra蛋白或IL-4S、IL-13融合蛋白疫苗分低（0. lml，约1头份）、中（0. 25ml， 约2.5头份）、高（0.5ml，约5头份）三个不同剂量组分别免疫BALB/c小鼠，另设载体蛋 白疫苗和PBS免疫对照组，每组5只BALB/c小鼠，皮下多点注射。间隔3周，分别进行第二 次和第三次免疫注射。疫苗注射后分别观察小鼠有无不良反应、过敏、死亡等现象。结果表 明：小鼠接种疫苗后发育良好，精神状态和食欲均正常，接种部位有一过性肿胀、发热等不 良反应，尤其在高剂量组表现更为明显。对于油佐剂苗，高剂量组小鼠，由于疫苗吸收较慢， 有轻度肉芽肿反应。
[0038] 与上述疫苗的实验方法类似，将纯化的小鼠可溶性IL-4R a (SIL-4R a )与 IL-4-T118S融合蛋白以及载体对照蛋白分低（0. 5yg)、中（5yg)、高（50yg)三个不同剂 量组，另设生理盐水对照组，每组5只BALB/c小鼠，于后腿肌肉或尾静脉注射。间隔3周， 分别进行第二次和第三次注射。注射后分别观察小鼠有无不良反应、过敏、死亡等现象。结 果表明：小鼠注射蛋白后发育良好，精神状态和食欲均正常，未发现明显不良反应。
[0039] 实施例4 :小鼠 IL-4、IL-4S、IL-4R a与IL-13基因重组疫苗、小鼠可溶性 IL_4Ra (sIL-4Ra)与IL-4-T118S融合蛋白增强小鼠防治慢性乙型肝炎的试验
[0040] 按实施例1的方法，将纯化的IL-4、IL-4Ra蛋白或IL-4S、IL-13融合蛋白或载 体对照所表达的蛋白用生理盐水适当稀释后与铝胶佐剂按1:1的比例混合制备实验或对 照疫苗。要求每头份疫苗中IL-4、IL-4Ra蛋白或IL-4S、IL-13融合蛋白或载体对照蛋白 的量约为15-20 μ g ;每头份疫苗的体积约为0. lml。给实验小鼠分别于乙肝病毒接种前3 周和1周腹腔（i. P.)接种实施例1所制备的IL-4、IL-4Ra蛋白与IL-4S、IL-13融合蛋白 基因重组铝胶疫苗，另设载体蛋白铝胶疫苗和PBS免疫对照组。给每只小鼠尾静脉接种乙 肝病毒基因组当量（viral genome equivalents) 5 ΧΙΟ10。接种后14天尾静脉采血，ELISA 方法测定乙肝表面抗原（HbsAg)的含量。结果表明，IL-4、IL-4Ra蛋白与IL-4S、IL-13融 合蛋白基因重组疫苗均能够显著降低乙肝病毒的感染（见表1)。
[0041] 对于小鼠可溶性IL-4Ra (sIL-4Ra )与IL-4-T118S融合蛋白治疗组，给实验小鼠 分别于接种乙肝病毒后每间隔4天于小鼠尾静脉注射5yg sIL-4Ra或IL-4-T118S融合 蛋白或融合蛋白对照。接种后14天尾静脉采血，ELISA方法测定乙肝表面抗原（HbsAg)的 含量。结果表明，sIL-4Ra与IL-4-T118S融合蛋白治疗能够显著降低乙肝病毒的感染（见 表1)。表1 :小鼠（C57BL/6,早）IL-4、IL-4Ra蛋白与IL-4S、IL-13融合蛋白基因重组疫 苗组、小鼠sIL-4Ra与IL-4-T118S融合蛋白治疗组均能增强小鼠抗乙肝病毒感染的试验 结果（每组10只，数据为HbsAg含量平均值，单位：ng/ml)
【主权项】
1. 一种用于治疗慢性传染性肝病的Th2免疫反应拮抗剂，其特征在于，以抗Th2类细胞 因子及其受体的抗体、Th2类细胞因子和/或其受体的抗原成分制成的疫苗、可溶性受体、 失去生理活性但仍具有与Th2类细胞因子受体结合活性的细胞因子突变体、源于Th2类细 胞因子或其受体的多肽或寡肽，或抗产生Th2类细胞因子的细胞的抗体中的一种或任意几 种为有效成分。
2. 根据权利要求1所述的用于治疗慢性传染性肝病的Th2免疫反应拮抗剂，其特征在 于，所述Th2类细胞因子为IL-4、IL-13、IL-5、IL-6或IL-10。
3. 根据权利要求1所述的用于治疗慢性传染性肝病的Th2免疫反应拮抗剂，其特征 在于，所述Th2类细胞因子的受体为IL-4Ra、alpha-l、alpha-2、IL-5受体、IL-6受体或 IL-IO受体。
4. 根据权利要求1所述的用于治疗慢性传染性肝病的Th2免疫反应拮抗剂，其特征在 于，所述失去生理活性但仍具有与Th2类细胞因子受体结合活性的细胞因子突变体，是指 由存在序列缺失的氨基酸所编码的蛋白质。
5. 根据权利要求1所述的用于治疗慢性传染性肝病的Th2免疫反应拮抗剂，其特征在 于，所述源于Th2类细胞因子或其受体的多肽或寡肽，具有与相应的细胞因子受体结合的 活性，或具有与受体相互竞争与相应的细胞因子相结合的活性，从而降低了 Th2类细胞因 子的生理活性。
6. 根据权利要求1所述的用于治疗慢性传染性肝病的Th2免疫反应拮抗剂，其特征在 于，所述产生Th2类细胞因子的细胞为CD4+T细胞。
7. 根据权利要求1所述的用于治疗慢性传染性肝病的Th2免疫反应拮抗剂，其特征在 于，所述Th2类细胞因子和/或其受体的抗原成分制成的疫苗，是以Th2类细胞因子的天然 或人工合成的完整蛋白或含有抗原表位的蛋白片段做抗原制成的任何形式的蛋白疫苗或 偶联蛋白疫苗； 或：以Th2类细胞因子的完整基因或表达抗原表位的基因片段做抗原基因或主要抗原 基因制成的任何形式的基因疫苗或融合基因疫苗。
8. -种用于预防或/和治疗慢性传染性肝病的卵黄抗体，其特征在于，以权利要求1的 Th2免疫反应拮抗剂为有效成分制成疫苗，对母鸡进行免疫，收集免疫后母鸡所产的鸡蛋， 制成ELISA效价高于1:10000的高免卵黄抗体。
9. 权利要求8所述的用于预防或/和治疗慢性传染性肝病的卵黄抗体的制备方法，其 特征在于，步骤如下： 以Th2免疫反应拮抗剂为有效成分制成疫苗，对母鸡进行免疫，免疫程序为：首免剂量 为1头份/只；首免3周后进行二免，剂量为2头份/只；首免6周后三免，剂量为2头份/ 只；每头份疫苗中Th2免疫反应拮抗剂的含量为50-100 μ g ;二免和三免后20天测定免疫 母鸡产蛋的卵黄抗体效价，ELISA效价高于1:10000判定为合格；否则，继续进行第4次免 疫，免疫剂量为4头份/只，四免后20天测定免疫母鸡产蛋的卵黄抗体效价；收集ELISA效 价高于1:10000的鸡蛋，制成高免卵黄蛋白粉，即得。
10. 根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述高免卵黄蛋白粉的制备，具体 包括以下步骤： (1)将收集的ELISA效价高于1:10000的鸡蛋的外壳进行消毒，打蛋收集蛋黄液；消毒 采用体积分数为70 %的乙醇擦拭； (2)将步骤⑴的蛋黄液低温冷冻干燥或瞬间高温喷雾干燥，制成高免卵黄蛋白粉。
【专利摘要】本发明公开了一种用于治疗慢性传染性肝病的Th2免疫反应拮抗剂，以抗Th2类细胞因子及其受体的抗体、Th2类细胞因子和/或其受体的抗原成分制成的疫苗、可溶性受体、失去生理活性但仍具有与Th2类细胞因子受体结合活性的细胞因子突变体、源于Th2类细胞因子或其受体的多肽或寡肽，或抗产生Th2类细胞因子的细胞的抗体中的一种或任意几种为有效成分。本发明还公开了一种用于预防或/和治疗慢性传染性肝病的高免卵黄抗体。本发明系首次通过抑制Th2免疫反应来治疗慢性传染性肝炎，提供了一组Th2免疫拮抗剂，其疗效显著，安全无毒副作用。
【IPC分类】A61P1-16, A61K38-19, C07K16-18, C07K16-02, A61P31-14, A61P31-20, A61K38-20, A61K39-395
【公开号】CN104826093
【申请号】CN201510180570
【发明人】刘永庆, 郭继英
【申请人】刘永庆
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月16日