调素启动子活性的诱导超过70% (图2G，柱4)。
[0141] 由于DRAGON. Fc在体内对铁调素表达和铁代谢没有作用，尽管与HJV. Fc相比其在 体外作为BMP-2和BMP-4的抑制剂具有较高的效力，同时与HJV. Fc相比，DRAGON. Fc在抑 制BMP-6方面不太有效，因此BMP-6可能是铁调素表达和铁代谢的重要内源性调节物。测 试了在小鼠中特异性中和BMP-6的抗体的施用是否影响铁调素表达和铁代谢。如图3A中 所示，中和BMP-6的抗体选择性地抑制Hep3B细胞中BMP-6对铁调素启动子荧光素酶报告 分子的活化，但对BMP-2、BMP-4、BMP-5或BMP-9没有显著的作用。BMP-6抗体在较高浓度 下显示针对BMP-7的一些抑制性活性，但与BMP-6相比显著较小（图3A)。如图3B中所示， 与假处理的对照小鼠相比，如通过定量实时RT-PCR测量，用BMP-6抗体处理三天的小鼠的 肝脏铁调素表达显著地减少约50%。另外，与假处理的对照相比，BMP-6抗体处理的小鼠具 有显著增加的血清铁和转铁蛋白饱和度（图3C和D)。
[0142] 通过在8周龄Bmp6敲除小鼠（Bmp6null mice)中测试，确认内源性BMP-6在调 节铁调素表达和铁代谢中的重要性，Bmp6敲除小鼠以前由Solloway等（Solloway MJ,等 1998. Dev Genet. 22:321-39)产生。这些Bmp6敲除小鼠被描述为在发育期间在骨骼形成 方面有些中度迟缓，但与野生型对照小鼠相比没有其他明显的缺陷，如通过定量实时RTPCR 测量，Bmp6敲除小鼠显示肝脏铁调素表达减少大约10倍（图4A)，并且如通过Western印 迹测量，脾膜铁转运蛋白表达增加2.3倍（图4B和C)。另外，Bmp6敲除小鼠具有显著增 加的血清铁，血清转铁蛋白饱和度接近100% (图4D和E)。与野生型对照相比，在Bmp6敲 除小鼠中肝脏铁含量增加超过20倍（图4F和H)，而脾铁含量减少4倍（图4G)。在8周 龄Bmp6敲除小鼠的肝脏中铁过载程度似乎与报道的类似年龄的Hfe2-I小鼠中的程度相当 (Huang, F. W.，等 J. Clin. Invest. 115:2187-2191 ;Niederkofler，V.，Salie，R.，Arber，S. 2 005. J Clin Invest. 115:2180-6)。因此，Bmp6敲除小鼠具有类似于由于BMP共同受体血 幼素的丧失引起的青少年血色素沉着病的表型。
[0143] 下一步，测试外源性BMP-6在体内调节铁调素表达和铁代谢的能力。小鼠以250和 1000 yg/kg IP注射以单剂量的外源性BMP-6配体。如通过定量实时RT-PCR测量，BMP-6 施用显著地增加肝脏铁调素表达。BMP-6施用还导致血清铁（图5B)和血清转铁蛋白饱和 度（图5C)的剂量依赖性减小。
[0144] 这些结果证明外源性BMP-6施用在体内正面调节铁调素表达并且减少血清铁，而 Bmp6基因的敲除或使用BMP-6抗体选择性抑制内源性BMP-6抑制铁调素表达、增加血清铁、 并且最终导致类似于由于BMP共同受体Hf e2中的突变引起的遗传性血色素沉着病的表型。 这些数据支持了 BMP-6作为铁调素表达的主要内源性调节物的重要性。
[0145] 大量BMP配体已经显示在体外调节铁调素，包括BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、 BMP-7 和 BMP-9(Babitt, J. L.，等 2006. Nat. Genet. 38:531-539 ;Babitt, J. L.，等 2007. J Clin Invest. 117:1933-1939 ;Wang，R.H·，等 2005. Cell Metab. 2:399-409 ;Truksa，J·，等 2006. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103:10289-10293)。除 BMP-7 以外的所有这些配体的信使 RNA在人肝脏中内源性地表达（Xia Y，等2008. Blood. 1115195-204)。尽管以前已经显示， 血幼素直接结合 BMP-2 和 BMP-4 配体（Babitt, J. L.，等 2006. Nat. Genet. 38:531-539)，血 幼素的可溶性形式HJV. Fc抑制BMP-6对铁调素活性的活化，甚至比其抑制BMP-2和BMP-4 活性的能力更有效（Babitt，J.L·，等 2007. J Clin Invest. 117:1933-1939)。另外，siRNA 或中和抗体对内源性BMP-6的抑制作用抑制了血幼素介导的对铁调素表达的诱导（Xia Y， 等2008. Blood. 1115195-204)。这些数据表明BMP-6是血幼素的配体。
[0146] 对于BMP-6在铁代谢中的作用的更多支持证据来自最近的一项研宄，该研宄报 道Bmp6转录物响应于富铁饮食而增加，并且响应于贫铁饮食而减少（Kautz，L，等2008. Blood. 112:1503-9)。在该研宄中Bmp2转录物在极端铁过载的条件下轻微上调并且Bmp4 没有变化（同前）。尽管血幼素结合BMP-2和BMP-4两者，但在我们的研宄中选择性抑制 BMP-2和BMP-4的DRAGON. Fc不能抑制铁调素表达和调控全身铁平衡，表明BMP-2和BMP-4 配体在此背景下可能是不太重要的。本发明人进行的测试也没有发现在Bmp6敲除小鼠的 肝脏中Bmp2和Bmp4转录物水平有任何变化，尽管存在明显的铁过载（数据未显示）。然 而，数据并没有明确地排除其他BMP配体（包括BMP-2和BMP-4)在铁代谢中的任何可能的 作用。
[0147] 数据清楚地表明选择性BMP-6抑制剂可能是用于治疗由于铁调素过量引起的炎 症性贫血的有效药剂。Bmp6敲除小鼠中缺少任何其他明显的表型表明更有选择性的抑制 剂可以被较好的耐受且存在较少的脱祀（off-target)效应。另外，BMP-6样激动剂可能是 在当前疗法难以治疗的患者中处理铁过载失调的可替代治疗策略。尽管还没有记载带有 BMP-6突变的人类患者，但数据也表明BMP-6突变或BMP-6基因变体可以作为遗传性血色素 沉着病的另一病因或疾病外显率的调节剂起作用。
[0148] 无需进一步详细说明，相信本领域技术人员能够使用前面的描述以其最充分的程 度利用本发明。下面的实施例仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开内容的其余部 分。
[0149] 实施例
[0150] 实施例LcDNA的制备
[0151] 由 GenScript Corporation (Piscataway, NJ 08854)基于预测的 GPI 销上游的人 DRAGON 蛋白序列（UniProtKB/Swiss-Prot 登记号 Q6NW40,氨基酸 1-409)和人 IgGlFc 序 列（来自 Signal pig plus 载体（R&D Systems)和 GenBank AF150959)生成 cDNA 编码密 码子优化的DRAGON. Fc0
[0152] 实施例2. DRAGON. Fe和HJV. Fe的制备和纯化
[0153] 根据生产厂商的说明书，使用293fectin(Invitrogen)将cDNA编码的DRAGON. Fe 转染进 Freestyle 293-F 细胞（Invitrogen)中。转染的细胞培养在 GIBCO Freestyle 293表达培养基（Invitrogen)中，以IlORPM在增湿的8 % CO2培养箱中在37 °C下振 摇。转染后7天，细胞通过离心而沉淀，并且如中Babbitt, J. L，等2005. J. Biol. Chem. 280:29820-29827所述，从培养基中经一步蛋白A亲合色谱法，使用Hi-Trap rProtein A FF 柱（Amersham Biosciences)纯化 DRAGON. Fc。如 Babitt, J.L·，等 2007. J Clin Invest. 117:1933-9中所述制备HJV.Fc。为了测定纯度和定量蛋白浓度，将DRAGON. Fe和HJV. Fe进行还原性SDS-PAGE，接着进行Bio-safe考马斯蓝染色（Bio-Rad)以及使用 抗 HJV 抗体（Babitt, J. L.，等 2006. Nat. Genet. 38:531-539)、抗 DRAGON 抗体（Samad, ΤΑ. ， 等 2004. J. Neurosci. 24:2027-2036) 、 和 羊抗人 Fc 抗体 （Jackson ImmunoResearch Laboratories)如所述的那样进行 Western 印迹。（Babitt, J. L.，等 2006.似1:· Genet. 38:531-539 ;Samad, T. A.，等 2004. J. Neurosci. 24:2027-2036)。蛋白浓度还通过牛 血清白蛋白蛋白测定（Pierce)进行定量。
[0154] 实施例3. BMP-6的制备
[0155] 纯化的重组人BMP-6如以前所述进行制备（Simic，P.，等2006. J Biol Chem. 281:25509-21)。冻干的BMP-6溶解在20mM乙酸钠、5%甘露醇溶液，pH 4. 0中用于 动物注射。
[0156] 实施例4.荧光素酶测定
[0157] 使用双重焚光素酶报告分子测定系统（Dual-Luciferase Reporter Assay System) (Promega)如以前所述（Babitt, J. L.，等 2006. Nat. Genet. 38:531-539 ;Babitt，J. L.，等2007. J Clin Invest. 117:1933-9)采用下列的改进方案在肝细胞瘤来源的H印3B 细胞中进行铁调素启动子荧光素酶报告分子测定。用铁调素启动子荧光素酶报告分子 (Babitt, J. L，等 2006. Nat. Genet. 38:531-539)和对照 Renilla 荧光素酶载体（pRL-TK) 转染的Hep3B细胞在补充了 1 % FBS的含有L-谷氨酰胺（Invitrogen)的a-MEM中进行 血清饥饿培养6小时，接着用25ng/mL BMP-2(由哈佛牙科医学院（Harvard School of Dental Medicine)的 Vicki Rosen 馈赠）、BMP-4、BMP-6 或 BMP-7, 50ng/mL BMP-5 或 5ng/ mL BMP-9 (R&D Systems)单独或与 0· 2-25 μ g/mL DRAGON. Fe、HJV. Fe 或抗 BMP-6 抗体一起 刺激16小时。选择相对浓度的BMP配体来引起类似程度的铁调素启动子荧光素酶活性，如 以前所述的那样（Babitt，J.L·，等 2007. J Clin Invest. 117:1933-9)。
[0158] 实施例5.动物
[0159] 所有动物实验方案均由位于马萨诸塞州总医院的机构内动物照护和使用委员 会（Institutional Animal Care and Use Committee)和位于萨格勒布大学医学院 (University of Zagreb School of Medicine)处的机构内动物照护和使用委员会和 科技部批准。8周龄129S6/SvEvTac小鼠（Taconic)圈养在马萨诸塞州总医院啮齿动 物设施中并以含有380ppm铁的Prolab5P75Isopro RMH 3000膳食饲养。由Elizabeth J. Robertson馈赠的具有混杂129Sv/C57背景的Bmp6敲除小鼠 （Solloway MJ,等1998. Dev Genet. 22:321-39)圈养在萨格勒布大学医学院（University of Zagreb School of Medicine)处并且以含有 180mg/kg 铁的标准 GLP 膳食（4RF21，Mucedola, Italy)饲养。
[0160] 对于 DRAGON. Fe 和 HJV. Fe 实验，8 周龄 129S6/SvEvTac 小鼠（Taconic)接受腹膜 内注射5或10mg/kg剂量的DRAGON. Fc，5或7mg/kg剂量的HJV. Fc，或等体积的等渗盐水每 周3次持续3周。对于BMP-6抗体注射实验，8周龄129S6/SvEvTac小鼠接受腹膜内注射 lOmg/kg单克隆抗人BMP-6抗体（R&D Systems)或等渗盐水每天一次持续3天。最后一次 注射后12小时，将小鼠处死并采集血液和肝脏用于测量铁参数和铁调素表达。
[0161] 对于BMP-6注射实验，8周龄129S6/SvEvTac小鼠接受腹膜内注射250或1000 mcg/ kg的BMP-6或仅等体积的载体（20mM乙酸钠，5%甘露醇溶液，pH 4. 0)。注射后6小时，将 小鼠处死并采集血液、肝脏和脾用于测量铁参数和铁调素表达。
[0162] 对于Bmp6敲除小鼠实验，5只8周龄Bmp6敲除小鼠和5只野生型对照小鼠被处死 并采集血液、肝脏和脾用于测量铁参数和铁调素表达。
[0163] 实施例6.定量实时RT-PCR.
[0164] 使用RNeasy试剂盒（QIAGEN)根据生产厂商的说明书从小鼠肝脏中分离总 RNA。如以前所述使用2步定量实时RT-PCR进行Hampl mRNA转录物相对于RPL19的实 时定量（Babitt, J. L.，等 2006. Nat. Genet. 38:531-539 ;Babitt, J. L.，等 2007. J Clin Invest. 117:1933-9 ;Xia，Y·，等 2007. J Biol Chem. 282:18129-40)。也使用以前描述的引 物对来自Bmp6敲除小鼠的肝脏的Bmp2、Bmp4和Bmp6mRNA相对于野生型小鼠进行实时定量 (Kautz, L.，等 2008. Blood. 112:1503-9) 〇
[0165] 实施例 7. Western 印迹·
[0166] 对于膜铁转运蛋白测定，如以前所述制备脾膜制剂。蛋白浓度通过BCA测定 (Pierce)确定。在室温下在lx Laemmli缓冲液中溶解30分钟后，每个样品20 μ g蛋白使 用预制的 NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 凝胶（Invitrogen)通过 SDS-PAGE 解析并转移至 HWF膜上（液体转移法）。印迹用处于含有0. 1 % Tween的tris缓冲盐水（TBS) (TBS-T) 中的10%脱脂乳饱和并用2. 5 μ g/ml膜铁转运蛋白抗体（稀释在含有5%脱脂乳的TBS-T 中）在4°C探测过夜。Knutson，M.D·，等 2005.Proc Natl Acad Sci USA. 102:1324-8。在 用TBS-T洗涤后，印迹与1:5000稀释的过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG(Sigma)温育1小时。 使用增强化学发光ECLB法（Perkin Elmer)进行检测。剥离印迹并且如Babitt, J.L.,等 2006. Nat. Genet. 38:531-539中所述重新探测作为内参照（loading control)的β-肌动 蛋白表达。化学发光使用IPLab光谱软件3. 9. 5r2版（Scanalytics)进行定量。
[0167] 实施例8.血清和组织铁测量.
[0168] 采集血清并如以前所述分析铁浓度和不饱和铁结合力。如以前所述计算总铁结 合力和转铁蛋白饱和度。如以前所述对肝脏和脾组织进行非血红素铁的定量测量（参见 Babitt, J.L.,等 2007. J Clin Invest. 117:1933-9) 〇
[0169] 实施例9.组织学
[0170] 来自Bmp6敲除小鼠和野生型小鼠的肝脏固定在2%多聚甲醛中，然后固定在2% 乙醇中，并包埋在石蜡中。5pm切片在二甲苯中脱蜡并在蒸馏水中水化。然后将切片在室 温下在含有等体积的2%亚铁氛化钾（Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)和 2%盐酸的染色溶液中放置60min。然后切片在蒸馏水中漂洗，在0.2%番红精（Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)中复染2min,并在1%乙酸中洗绦，然后在95%乙醇、 无水乙醇中脱水，在二甲苯中澄清，并在DPX中封片（mount)。
[0171] 实施例10.统计学.
[0172] 以P〈0. 05,采用学生双尾t检验来确定统计学显著性。
[0173] 实施例11. DRAGON. Fc选择性抑制BMP对铁调素表达的诱导.
[0174] 图I. H印3B细胞用铁调素启动子荧光素酶报告分子和对照Renilla荧光素酶载体 (pRL-TK)转染。转染后48小时，如显示的那样，细胞在缺少或存在BMP-2、BMP-4、BMP-5、 BMP-6、BMP-7 或 BMP-9 配体的条件下，单独或与 0. 2-25 μ g/mL 纯化的 DRAGON. Fe (Dra. Fe) 或HJV. Fe -起温育16小时。测定细胞溶胞产物的荧光素酶活性，并且相对荧光素酶活性 计算为萤火虫与Renilla荧光素酶的比率以控制转染效率。对于用BMP配体结合DRAGON. Fe或HJV. Fe处理的细胞与用BMP配体单独处理的细胞相比较，结果报告为相对荧光素酶活 性的减少百分比的平均数+/_标准差，每组η = 2-4。显示确切P-值。（lA)DRAGON. Fe对 BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7 和 BMP-9 配体的作用。（1B-1D) ·显示 DRAGON. Fe 和 HJV. Fe 抑制 BMP-2 (IB)、BMP-4 (1C)和 BMP-6 (ID)的头对头比较（Head to head comparison)。
[0175] 实施例12.在小鼠中施用DRAGON. Fe不影响铁调素表达或铁代谢.
[0176] 图2. 8周龄雄性129S6/SvEvTac小鼠接受腹膜内注射5(n = 3)或10mg/kg(n = 4) 的纯化的可溶性DRAGON. Fe (Dra. Fe)或等体积的等渗盐水（Con, η = 7)每周3次持续3 周。作为阳性对照，另一组小鼠接受腹膜内注射5(η = 3)或7mg/kg(n = 4)的等量HJV. Fe 或等体积的等渗盐水（Con，η = 7)每周3次持续3周。两种DRAGON. Fe和HJV. Fe剂量的 结果是相似的，并且因此合并成一组。（A)分离总肝脏RNA，并且通过定量实时RT-PCR相对 于作为内部对照的RPL19mRNA分析铁调素 mRNA。（B)通过Western印迹对脾膜制剂分析膜 铁转运蛋白（FPN)表达。剥离印迹并且用作为内参照的抗β-肌动蛋白抗体探测。对于膜 铁转运蛋白相对于β-肌动蛋白的表达，化学发光通过通过IPLab光谱软件定量。（C和D) 血清铁（C)和转铁蛋白饱和度⑶的测量。（Ε和F)肝脏（E)和脾（F)组织铁含量的定量。 (G)如图1中那样，Hep3B细胞用铁调素启动子荧光素酶报告分子和pRL-TK转染。转染后 48小时，细胞在缺少或存在Ing/mL BMP-2的条件下，单