独或与来自假处理对照小鼠（Con，n =4)或来自DRAGON. Fe处理小鼠（Dra. Fe, η = 4)的20%混合血清一起温育16小时。如 图1中那样计算相对荧光素酶活性。结果报告为平均数+1-标准差。显示确切P值。
[0177] 实施例13.特异性中和ΒΜΡ-6的抗体在体内抑制肝脏铁调素表达并增加血清铁和 转铁蛋白饱和度.
[0178] 图3. (A)如图1中那样，Hep3B细胞用铁调素启动子荧光素酶报告分子和对照 pRL-TK转染。转染后48小时，如所示的那样，细胞在缺少或存在BMP-2、BMP-4、BMP-5、 BMP-6、BMP-7或BMP-9配体的条件下，单独或与0. 2-25 μ g/mL中和BMP-6的抗体一起孵育 (每组η = 2)。如图1中那样计算相对荧光素酶活性。（B-D) 8周龄雄性129S6/SvEvTac小 鼠接受腹膜内注射l〇mg/kg(a-BMP-6, η = 4)的中和BMP-6的抗体或等体积的等渗盐水（对 照，η = 4)每天一次持续3天。（B)分离总肝脏RNA，并且通过定量实时RT-PCR相对于作 为内部对照的RPL19mRNA分析铁调素 mRNA。（C和D)血清铁（C)和转铁蛋白饱和度（D)的 测量。结果表示为平均数+1-标准差。显示确切P值。
[0179] 实施例14. Bmp6敲除小鼠显示减少的肝脏铁调素表达、增加的脾膜铁转运蛋白表 达、增加的血清铁和转铁蛋白饱和度、增加的肝脏铁含量和减少的脾铁含量.
[0180] 图4. 8周龄雄性Bmp6敲除小鼠 （η = 5)和品系匹配的野生型对照小鼠（WT，η = 5) (A)通过定量实时RT-PCR分析相对于RPL19mRNA表达的铁调素 mRNA表达，（Β和C)通过 Western印迹（C)分析相对于β-肌动蛋白表达的膜铁转运蛋白表达，然后使用IPLab光 谱软件定量（B)，（D)分析血清铁，（E)分析血清转铁蛋白饱和度，（F)分析肝脏铁含量，和 (G)分析脾铁含量，如图2中所述。（H)在野生型（WT)和Bmp6敲除小鼠肝脏中对组织铁的 Perls普鲁士蓝染色。原放大倍数X 10。结果表示为平均数+/-标准差。显示确切P值。
[0181] 实施例15.在小鼠中施用BMP-6增加铁调素 mRNA表达并减少血清铁.
[0182] 图5. 8周龄雄性129S6/SvEvTac小鼠接受腹膜内注射250 μ g/kg (η = 6)或 1000 μ g/kg (η = 7)的ΒΜΡ-6或仅等体积的载体（η = 6)。注射后6小时，采集血液和肝脏。 (A)分离总肝脏RNA，并且通过定量实时RT PCR相对于作为内部对照的RPL19mRNA分析铁 调素 mRNA。（B和C)血清铁（B)和转铁蛋白饱和度（C)的测量。结果表示为平均数+/-标 准差。显不确切P值。
[0183] 实施例16.制备用于在小鼠贫血模型中使用的腹膜内注射液的流产布鲁氏菌 (Brucella abortus)
[0184] 当经腹膜内（IP)注射至小鼠体内时流产布鲁氏菌（BA)用来诱导炎症性贫血。通 常在7天内产生建立贫血，其特征为2-3g/dL滴的血红蛋白水平。注射后贫血典型地持续 28天。28天后，小鼠开始复原并且看到血红蛋白水平开始升高。此实验方案描述了如何1) 从苯酷处理的缓冲液洗绦和分离BA颗粒和2)为10只小鼠制备BA从而以200 μ 1的体积 IP递送5χ108颗粒/小鼠。
[0185] 以下列的方式洗涤和制备5χ109储备液。首先，从冰箱中取出60mL瓶子并充分混 合。然后将500ml BA转移至500mL离心瓶中。然后使用超速离心机（Ultracentrifuge) 将这些以10, OOOrpm离心15分钟。去除上清液并且重新悬浮在IOOmL PBS中。悬浮液现 在为5xl09颗粒/mL。将试样等分并在-80°C冷冻，典型地为ImL等分试样。
[0186] 以下列的方式制备用于注射的5xl08颗粒（例如用于10只小鼠）。起始浓度必需 为2. 5xl09颗粒/mL，因为将注射200 μ L/小鼠。使用PBS将储备液稀释2倍。例如，需要 10 只小鼠 X 〇· 200 μ L = 2mL+20%剩余物（overage) = 2. 2mL 2· 5χ109颗粒 /mL。I. ImL BA 储备液+1. ImL PBS。
[0187] 材料
[0188] BA:在60mL瓶中的流产布鲁氏菌环状试验抗原（Ring Test Antigen) (1119-3 株）购自美国农业部动植物卫生检验局国家兽医服务实验室（U.S. Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, National Veterinary Services Laboratories) ,Ames, Iowa。布鲁杆菌病环状试验抗原含有死亡的染色的流产布 鲁氏菌1119-3株细胞在苯酚处理的缓冲液中的悬浮液。每个60mL瓶子的浓度为大约IO 9 颗粒/mL。抗原保存在4°C。
[0189] 稀释剂！DPBS(Gibco)使用的洗涤剂、载体和对照。
[0190] 结果
[0191] 对接受腹膜内注射流产布鲁氏菌的小鼠施用特异性结合BMP-6的抗体。在腹膜内 注射流产布鲁氏菌的小鼠中减少或消除炎症性贫血症状的抗体适合用于治疗哺乳动物贫 血。
[0192] 实施例17.在BMP-6上的多个位点的结合抑制肝脏铁调素表达并增加血清铁和转 铁蛋白饱和度.
[0193] 进行捕获测定（pulldown assay)以明确上面实施例13中使用的HJV和BMP-6抗 体是否在相同位点上结合BMP-6。
[0194] hBMP6 (1 μ g) +/-hHJV. His (对于相对于mAb的5x摩尔比为7. 1 μ g或相对于25x 摩尔比为35. 5 μ g)在500 μ 1盐水溶液中在4°C下温育过夜。然后在用蛋白A珠子捕获之 前加入 2. 5 μ g mAb (mAb507, R&D Systems)持续 lhr。
[0195] 然后样品在SDS-PAGE凝胶4-12%上跑样，并且转移至PVDF膜。使用兔多克隆抗 BMP6抗体作为一抗，山羊抗兔IgG-HRP作为二抗进行图6中所示的Western印迹分析。印 迹用ECL试剂显影，曝光3分钟。箭头指示BMP6蛋白条带，并且该条带仅存在于含有BMP6 的样品中（泳道2、3、4、5、8和9)，但不存在于不含BMP6的样品中（泳道6、7和10)。
[0196] 泳道：
[0197] L 可见 Blue Plus 2 预染 MW 梯
[0198] 2. hBMP6+mAb混合物的腹膜内注射前等分试样（Pre-IP aliquot)
[0199] 3.腹膜内注射 hBMP6+mAb
[0200] 4.腹膜内注射 hBMP6+mAb+5x hHJV. His
[0201] 5.腹膜内注射 hBMP6+mAb+25x hHJV. His
[0202] 6.仅腹膜内注射mAb
[0203] 7.空白
[0204] 8. hBMP6+mAb+5x hHJV. His的腹膜内注射前等分试样
[0205] 9. hBMP6+mAb+25x hHJV. His的腹膜内注射前等分试样
[0206] 10. mAb的腹膜内注射前等分试样
[0207] 结果：
[0208] 抗BMP6mAb(R&D Systems)捕获hBMP6,如图6中所示，泳道3。添加摩尔过量的 hHJV. His不抑制捕获，如图6中所示，泳道4和5。基于此，我们认识到hHJV. His和抗BMP6 可能与hBMP6上不同的位点结合。下一步检查印迹中hHJV. his的存在，观察是否其也被捕 获。
[0209] 图7显示与图6中所示相同的剥离后的印迹，并且用mAb 24C8-C10 (对HJV特异） 再探测以使hHJV. His显影。如图7中所示，在hBMP6的存在下，抗BMP6mAb (R&D Systems) 捕获hHJV. His蛋白（泳道4和5)。因此，我们得出结论，hHJV. his和抗BMP6与hBMP6上 不重叠的位点结合，这是一个非显而易见的结果。
[0210] 实施例18. hBMP-6肽用于产生针对BMP-6的抗体.
[0211] 已经制备了针对hBMP6肽TQSQDVARVSSASDY的抗体。
[0212] 进行Western印迹分析测定以证明有可能产生针对被定义为 TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID NO:3)的成熟hBMP6中的特殊肽结构域的抗体。
[0213] 山羊多克隆抗hBMP6抗体（R and D Systems AF507)特异性地检测通过半胱氨酸 残基与 hBMP6 肽缀合的牛血清白蛋白（BSA)(BSA-C-TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID N0:4))(图 8，泳道1)。
[0214] 用500x摩尔过量的未缀合的hBMP6肽竞争，阻断了多克隆抗体与 BSA-C-TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID N0:4)的结合（图 8,泳道 2)。
[0215] 这表明有可能产生针对被定义为TQSQDVARVSSASDY (SEQ ID NO: 3)的成熟hBMP6 中的特殊肽结构域的抗体。
[0216] 参考文献
[0217] 下列参考文献的每一篇均通过引用合并入本文中如同其全部内容在本文中给出 一样：
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[0248] 下列专利文献中的每一篇的全部内容均通过引用合并入本文中：PCT申请号 PCT1/US08/059753 (2008年4月9日提交）；美国专利申请号11/884, 509 (2007年8月 16日提交）；美国专利申请号11/195,205 (2005年8月2日提交）；和美国专利申请号 10/419, 296 (2003 年 4 月 17 日提交）。
[0249] 本说明书中引用的所有出版物和专利申请均通过引用合并入本文中如同单个的 出版物或专利申请各自被具体地和单独地指出通过引用而合并。
[0250] 尽管前面为了便于理解的目的已经通过举例说明和实施例一定程度地详细描述 了本发明，但对于本领域普通技术人员来说，鉴于本发明的教导，在不背离附带的权利要求 的精神或范围的前提下可以对其作出某些改变和修改是显而易见的。
【主权项】
1. 一种药物组合物，其包含特异性结合成熟BMP-6蛋白质的单克隆抗体或其片段。2. 根据权利要求1的药物组合物，其中所述成熟BMP-6包含氨基酸序列SEQIDNO: 2。3. 权利要求1或2所述的药物组合物，其中相对于人BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7或 BMP-9，所述单克隆抗体优先抑制人BMP-6。4. 权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述组合物结合BMP-6的亲和性比结合 BMP-7的亲和性大至少5倍。5. 权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体选自由嵌合单克隆抗体、人 源化单克隆抗体、全人单克隆抗体、单链Fv片段、F(ab'）2片段、Fd、结构域抗体（dAb)、双抗 体、maxibody和纳米抗体组成的组。6. 权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体减少受试者中铁调素表达 或活性。7. 权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体减少BMP-6信号传导。8. 权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体增加受试者中的血清铁水 平。9. 权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体增加受试者中的血细胞比 容。10. 权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体增加受试者中的血清血红 蛋白水平。11. 权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体导致受试者中的血清转铁 蛋白饱和度增加。12. 权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体结合的人BMP-6的表位与 R&DSystems的MAB507单克隆抗体结合的人BMP-6的表位相同。13. 包含特异性结合成熟BMP-6蛋白质的单克隆抗体或其片段的药物组合物在制备用 于治疗受试者中缺铁性失调的药物中的用途。14. 根据权利要求13的用途，其中所述缺铁性失调是贫血。15. 根据权利要求13或14的用途，其中所述成熟BMP-6包含氨基酸序列SEQIDNO: 2。16. 根据权利要求13或14的用途，其中相对于人BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7或BMP-9， 所述单克隆抗体优先抑制人BMP-6。17. 根据权利要求13或14的用途，其中所述组合物结合BMP-6的亲和性比结合BMP-7 的亲和性大至少5倍。18. 根据权利要求13或14的用途，其中所述单克隆抗体选自由嵌合单克隆抗体、人源 化单克隆抗体、全人单克隆抗体、单链Fv片段、F(ab'）2片段、Fd、结构域抗体（dAb)、双抗 体、maxibody和纳米抗体组成的组。19. 根据权利要求13或14的用途，其中所述单克隆抗体减少所述受试者中铁调素表达 或活性。20. 根据权利要求13或14的用途，其中所述单克隆抗体减少BMP-6信号传导。21. 根据权利要求13或14的用途，其中所述单克隆抗体增加所述受试者中的血清铁水 平。22. 根据权利要求13或14的用途，其中所述单克隆抗体增加所述受试者中的血细胞比 容。23. 根据权利要求13或14的用途，其中所述单克隆抗体增加所述受试者中的血清血红 蛋白水平。24. 根据权利要求13或14的用途，其中所述单克隆抗体导致所述受试者中的血清转铁 蛋白饱和度增加。25. 根据权利要求13或14的用途，其中所述单克隆抗体结合的人BMP-6的表位与R&D Systems的MAB507单克隆抗体结合的人BMP-6的表位相同。
【专利摘要】本发明提供了通过调整BMP-6活性来调节铁稳态。提供了使用BMP-6和BMP-6蛋白特异性试剂诸如抗体用于改变人血清铁水平的方法。此类抗体可用于预防和治疗血色素沉着病和炎症性贫血的药物组合物中。
【IPC分类】A61P7/06, A61K39/395
【公开号】CN104922669
【申请号】CN201510184557
【发明人】H·林, 朱迪·巴比特
【申请人】通用医疗公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2009年11月13日
【公告号】CA2742871A1, CN102215869A, CN102215869B, EP2349332A2, EP2349332A4, US8318167, US20100136015, WO2010056981A2, WO2010056981A3