用于治疗贫血的方法

用于治疗贫血的方法
【专利说明】用于治疗贫血的方法
[0001] 本申请要求2012年10月24日提交的美国临时专利申请号61/718, 128的优先权， 其公开内容通过引用以其整体结合到本文中。
[0002] 1?引言
[0003] 本文提供用于治疗贫血的方法，其中所述方法包括将生长分化因子11(⑶Fll;亦 称为骨形态生成蛋白Il(BMPll))的拮抗剂给予需要所述治疗的对象。
[0004] 2.发明背景
[0005] 贫血是一种红细胞数减少或小于正常量或血液中的血红蛋白功能降低的疾病。贫 血是最常见的血液病症。
[0006] 贫血可能由无效红细胞发生（ineffective erythropoiesis)引起。如果发生有 效红细胞发生但成熟的红细胞不能以适当的速率发育，则存在无效红细胞发生。在达到红 细胞成熟期之前，祖细胞进行细胞凋亡。贫血还包括血红蛋白的氧结合能力降低。
[0007] 地中海贫血是一种无效红细胞发生的形式。在地中海贫血中，无效红细胞发生 的特征在于成熟中的有核类红细胞（erythroid cell)凋亡。具体地说，|3地中海贫血 (beta-thalassemia)是一种特征在于血红蛋白（或Hgb)合成缺陷导致红细胞成熟和产生 受损的疾病。所述减少主要被认为是由于在红细胞分化的晚嗜碱性（late basophilic)/ 多染性成红细胞（polychromatic erythroblast)期红细胞分化和凋亡异常加速所致，导致 了成熟红细胞产生的总体降低。e地中海贫血的特征在于细胞过多的骨髓腔隙，在腔隙中 异常成红细胞蓄积，并进行凋亡，导致了全身性贫血。
[0008] 转化生长因子e (TGF-e)家族（该家族包括TGF-e、激活素、骨形态发生蛋白 (BMP)和生长分化因子（GDF))包括已知在发育和组织稳态两者中调节多个细胞过程的分 泌的蛋白质。在各种模型系统中，TGF-M、激活素A、BMP-2和BMP-4全都与红细胞发生的 调节有关。TGF-M既抑制又促进红细胞分化，这取决于特定情况；激活素A显示是促红细 胞分化剂，而BMP-4在鼠模型中参与应激红细胞发生和从急性贫血中恢复。BMP-2作用于早 幼类红细胞以增加获自经动员的外周血或骨髓CD34+细胞的样品的集落形成。这些生长因 子中的一些的异常高的水平与各种血液病有关。例如，高水平的GDF-15通常不是正常红细 胞发生的特征，但在无效红细胞发生的情况下，⑶F-15表达升高。
[0009] TGF-0超家族包括30多种蛋白质，并仅通过少数受体和信号转导途径发出信号， 表明了其作用的固有混杂性和丰余性。此外，在任何指定的组织中，可发现几种不同的配 体，而且据推测，通过受体的重叠亚型发生信号转导，使将特定配体与其功能相关联的能力 复杂化。⑶Fll是⑶F亚家族的成员，与⑶F8(亦称为肌肉生长抑制素）有约90%氨基酸 同源性。两者可结合激活素IIA型和B型受体，并激活Smad 2/3信号转导途径。⑶Fll在 发育中起重大作用，参与肌肉、软骨、骨、肾和神经系统的形成，同时在成人组织中，在胰腺、 肠、肾、骨骼肌、脑和牙髓中检出GDF11。还可在循环中发现少量的GDF-11。然而，迄今仍没 有描述⑶F-Il在红细胞发生中的作用的证据。
[0010] 激活素的II型受体还可结合⑶F11。已鉴定出两种相关的II型受体ActRIIa和 ActRIIb (Mathews 和 Vale, 1991，Cell 65:973-982 ;Attisano 等，1992, Cell 68:97-108) 〇 除⑶Fll以外，ActRIIa和ActRIIb可与几种其它的TGF-0家族蛋白质在生物化学上相互 作用，包括 BMP7、Nodal、⑶F8 和激活素（Yamashita 等，1995, J. Cell Biol. 130:217-226 ; Lee 和 McPherron，2001，P;roc.Natl.Acad.Sci.98:9306-9311 ;Yeo 和 Whitman, 2001，Mol. Cell 7:949-957 ;0h 等，2002, Genes Dev. 16:2749-54)。ALK4 是激活素，特别是激活素 A 的 主要I型受体，而ALK-7也可用作激活素，特别是激活素B的受体。
[0011] 由激活素-受体IIA型（ActRIIA)的胞外域（E⑶）和人IgGlFc结构域组成的人源 化融合蛋白以高亲和力与激活素-A和其它TGF 0超家族配体结合，通过内源ActRIIA-受 体阻断信号转导。激活素-A亦称为红细胞分化因子（EDF)，其影响后期的RBC成熟 (Murata，1988)。描述了用于提高红细胞水平的ActRII抑制剂（例如专利申请公布号 20110038831、20100204092、20100068215、20100028332、20100028331 和 20090163417)。
[0012] 3?发明概述
[0013] 在某些实施方案中，本文提供用于治疗患者的贫血、无效红细胞发生、0地中海贫 血或增加患者的正染性成红细胞（Ery-C)的方法，其中所述方法包括给予GDFll拮抗剂。在 某些实施方案中，相对于健康个体和/或相对于贫血发病前患者的GDFll水平，在骨髓、脾、 肝、血清或血浆中患者的⑶Fll水平升高。
[0014] 在某些实施方案中，如果⑶Fll拮抗剂是ActRIIA多肽，则ActRIIA多肽优先与 ⑶Fll结合。如果⑶Fll拮抗剂是ActRIIB多肽，则ActRIIB多肽优先与⑶Fll结合。
[0015] 在某些实施方案中，⑶Fll拮抗剂降低⑶Fll的表达、降低⑶Fll活性或降低 ⑶Fll蛋白水平。在某些实施方案中，⑶Fll拮抗剂是抗⑶Fll抗体。在某些实施方案中， ⑶Fll拮抗剂是结合⑶Fll的截短受体。在某些实施方案中，⑶Fll拮抗剂包含ActRIIA 的突变胞外域，其中与野生型的ActRIIA相比，ActRIIA的突变胞外域相对于激活素A对 ⑶Fll的亲和力提高。
[0016] 在某些实施方案中，本文提供的方法还包括监测⑶Fll水平。在某些实施方案中， 所述方法还包括
[0017] a.测定⑶Fll水平；和
[0018] 调节⑶Fll拮抗剂的剂量，其中，如果⑶Fll增加超过正常，则增加⑶Fll拮抗剂 的剂量，且其中，如果GDFll降低低于正常，则减少GDFll拮抗剂的剂量。在某些实施方案 中，以⑶FllmRNA水平、⑶Fll蛋白水平或⑶Fll蛋白活性水平测定⑶Fll水平。
[0019] 在某些实施方案中，给予GDFll拮抗剂导致患者中晚嗜碱性和多染性成红细胞的 细胞计数减少。在某些实施方案中，⑶Fl 1拮抗剂降低⑶Fl 1表达、⑶Fl 1活性和/或⑶Fl 1 蛋白水平。
[0020] 4?附图简述
[0021] 图1说明SEQ ID NO 7的鼠对应物（mActRIIA-Fc)改进0地中海贫血小鼠的血液 学参数。Hbb thl/tM小鼠（Skow LC等，Cell 34:1043-52, 1983)用PBS或mActRIIA-Fc(10mg/ Kg体重一周两次）治疗60天。在第5、10、30和60天评价血液学参数。（A)红细胞计数、 (B)血细胞比容和（C)血红蛋白的评价与（D)网状细胞增多减少有关。循环红细胞（RBC) 参数的分析还显示在用mActRIIA-Fc治疗的小鼠中，（E)平均红细胞容积（MCV)、（F)平均 红细胞血红蛋白（MCH)和（G) MCH浓度（MCHC)增加。（H)总抗氧化状态。（I)形态学分析 显示红细胞大小不均、异形红细胞和靶细胞减少。还对地中海贫血小鼠的（J)全身铁水平、 (K)运铁蛋白合成、（L)运铁蛋白和（M)铁蛋白水平饱和度进行了评价。（N)还评价了炎性 细胞计数。通过（O)脾重和总细胞数评价的地中海贫血小鼠中mActRIIA-Fc对脾大的作用。 (P)在用mActRIIA-Fc治疗的小鼠中，骨髓成红细胞数和增殖（伊红/苏木精染色）也减 少。（Q)经TER119染色，通过流式细胞术定量测定了骨髓和脾成红细胞。*p〈0. 05,对于各 独立实验N = 3-5。
[0022] 图2说明mActRIIA-Fc降低地中海贫血小鼠的无效红细胞发生。（A-C)收获骨髓 和脾，经⑶71/TER119染色和FSC/SSC分配，通过流式细胞术评价了成红细胞分化。（D)总 胆红素水平和直接胆红素水平的分析。（E)使用二氯二氢荧光素，通过流式细胞术评价了主 要原成红细胞分化中的活性氧类别（ROS)产生。（F)用mActRIIA-Fc或PBS处理48小时的 主要地中海贫血原成红细胞中血红蛋白溶解度的分析。*P〈〇.05，#p〈0. 01，*#p〈0. 005,对 于各独立实验N = 3-5。
[0023] 图3说明mActRIIA-Fc对来自地中海贫血小鼠的成红细胞的凋亡的作用。来自 用mActRIIA-Fc或PBS治疗的小鼠的骨髓（A)和脾⑶成红细胞中Fas-L的表达。（C)在 mActRIIA-Fc治疗的小鼠中成红细胞的Tunel染色增强。
[0024] 图4表明地中海贫血小鼠脾中ActRIIA配体的表达。（A)在mActRIIA-Fc治疗的 动物中，ActRII、激活素A、激活素B和⑶Fll的mRNA表达水平提高。（B)⑶Fll蛋白水平的 蛋白质印迹分析，在mActRIIA-Fc治疗的动物该水平降低。（C)针对⑶Fll的骨髓免疫组织 化学染色显示野生型和用mActRIIA-Fc治疗的小鼠之间无变化。
[0025] 图5说明主要地中海贫血原成红细胞中mActRIIA-Fc对⑶Fll表达的作用。（A) 对用PBS或mActRIIA-Fc治疗30天的地中海贫血小鼠的激活素/⑶F信号转导途径的免 疫组织化学分析，显示地中海贫血小鼠中高水平的⑶Fll、ActRII和p-Smad2。（B)与其 它贫血模型相比，对地中海贫血小鼠的激活素A、激活素B和⑶Fll的免疫组织化学分析。 (C)使用针对激活素A、激活素B、⑶Fll前肽和⑶F8/⑶Fll切割肽的特异性抗体对用PBS 或mActRIIA-Fc处理48小时的主要地中海贫血原成红细胞的FACS分析。柱状图中表示 ⑶Fll染色的定量测定。（D)用PBS或mActRIIA-Fc治疗的地中海贫血小鼠脾中⑶Fll前 体（proform)表达的免疫组织化学分析。*p〈0. 05, N = 4。
[0026] 图6说明抑制⑶Fll降低地中海贫血小鼠中的无效红细胞发生。（A)收获骨髓和 脾，经⑶71/TER119染色和FSC/SSC分配，通过流式细胞术评价主要原成红细胞分化。（B) 使用二氯二氢荧光素，通过流式细胞术评价主要原成红细胞分化中的ROS产生。*p〈0. 05， N = 4〇
[0027] 图7说明检测血清中的⑶Fll的夹心ELISA测定法。（A)测定示意图。⑶将板用 5 y g/mL mActRIIA-Fc 和递增剂量的重组⑶Fll (Ong/ y 1、0. lng/ y 1、0. 5ng/ y 1、2. 5ng/ U 1)包被或将对照血清（1/4-1/500稀释度）加入用mActRIIA-Fc包被的板中，板经洗 涤，用抗GDF8/11抗体检测结合的蛋白质，接着使用辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG检测。 GDFll蛋白以剂量依赖性方式结合板。
[0028] 图8说明在0地中海贫血患者的血清中检出递增水平的⑶F11。血清获自出现地 中海贫血的患者和健康对照。
[0029] 图9说明检测血清中的激活素A的夹心ELISA测定法。（A)测定示意图。（B)将 板用 5 y g/mL ActRIIA-Fc (SEQ ID NO. 7)和递增剂量的重组激活素A(0ng/ y 1、0. lng/ y 1、 0? 5ng/ y 1、2. 5ng/ y 1)包被或将对照血清（1/4-1/500稀释度）加入ActRIIA-Fc板中，板 经洗涤，并用抗激活素A抗体检测结合的蛋白质，接着使用辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG 检测。激活素A蛋白以剂量依赖性方式结合板。（C)0地中海贫血患者血清中激活素A水 平的检测。血清获自出现地中海贫血的患者和健康对照。地中海贫血患者中激活素A的血 清水平没有变化。
[0030] 图10说明检测血清中的激活素B的夹心ELISA测定法。（A)测定示意图。（B) 将板用 5 y g/mL ActRIIA-Fc 和递增剂量的重组激活素 B(0ng/ y 1、0. lng/ y 1、0. 5ng/ y 1、 2. 5ng/ y 1)包被或将对照血清（1/4-1/500稀释度）加入ActRIIA-Fc板中，板经洗涤，并 用抗激活素B抗体检测结合的蛋白质，接着使用辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG检测。激 活素B蛋白质以剂量依赖性方式结合板。（C) 0地中海贫血患者血清中激活素B水平的检 测。血清获自出现地中海贫血的患者和健康对照。地中海贫血患者中激活素B的血清水平 没有变化。
[0031] 图11说明将mActRIIA-Fc给予C57BL/6野生型小鼠不改变其血液学参数。（A)红 细胞计数，（B)血细胞比容，（C)血红蛋白的评价显示与mActRIIA-Fc无关。（D)网状细胞增 多略有减少。mActRIIA-Fc不改变红细胞（RBC)参数，例如（E)平均红细胞容积（MCV)，（F) 平均红细胞血红蛋白（MCH)或（G)MCH浓度（MCHC)。*p〈0. 05,对于各独立实验N = 3-5。
[0032] 图12说明将mActRIIA-Fc给予C57BL/6野生型小鼠对小鼠的脾和骨髓细胞数无 作用。
[0033] 图13说明mActRIIA-Fc通过抑制⑶Fll刺激红细胞分化。（A-C)通过在含有EP0、 +/-50 y g/mL mActRIIA-Fc的培养基中培养，来进行⑶34+/⑶36+细胞的红细胞分化；对 (A)祖红细胞，（B)细胞增殖和（C)红细胞前体进行了分析。（D-F)当在含有EP0、+/-50yg/ mL mActRIIA-Fc的培养基中与骨髓（BM)细胞共培养时⑶34+/⑶36+细胞的红细胞分化； 对（D)祖红细胞，（E)细胞增殖和（F)红细胞前体进行了分析。（G-H)通过在含有EP0、 +/-200ng/mL⑶Fll、+/-100ug/mL mActRIIA-Fc的培养基中培养来进行CD36+细胞的红细 胞分化；对（G)细胞增殖和⑶红细胞前体GPA+的百分比进行了分析。
[0034] 5?发明详述
[0035] 5. 1 概述
[0036] -方面，本文提供用于治疗贫血的方法，其中所述方法包括将生长分化因子 11 (⑶Fll ;亦称为骨形态生成蛋白Il(BMP-Il))的拮抗剂给予需要治疗的患者。在某些实 施方案中，所述方法包括给予有需要的个体（例如患有贫血的个体）治疗有效量的GDFll 拮抗剂。在某些具体的实施方案中，⑶Fll拮抗剂不是ActRII受体或ActRII受体的衍生 物，例如不是ActRIIA-Fc融合蛋白或ActRIIB-Fc融合蛋白。GDFl 1拮抗剂可在任何水平上 对⑶Fl 1起作用，即可降低或消除⑶Fl 1表达、降低⑶Fl 1稳定性（例如通过增加⑶Fl 1降 解）或拮抗⑶Fll活性（例如通过防止⑶Fll与其受体结合）。⑶Fll拮抗剂更详细的描 述可见下面的第 Error ! Reference source not found?节。
[0037] 在某些实施方案中，本文提供用于提高贫血患者的红细胞水平的方法（对于待用 本文所述方法治疗的贫血类型参见例如第5. 2节）。可如下描述本文提供的方法的生理结 果。具体地说，以下参数的提高表明患者贫血的治疗。在某些实施方案中，红细胞水平提 高至少 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、 17 %,18%,19%,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %,55 %,60 %,65 %,70 %,75 %, 80%、85%、90%、95%或至少100%。在某些实施方案中，血红蛋白水平提高至少1%、 2%,3 %,4%,5 %,6%,7 %,8 %,9 % ,10% > 11 % > 12 % ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18%, 19 %,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %,55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %, 90%、95%或至少100%。在某些实施方案中，血细胞比容水平提高至少1%、2%、3%、4%、 5 %,6 %,7 %,8 %,9 %UO %> 11 %> 12 %,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20 %, 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 至少100%。在某些实施方案中，集落形成单位水平提高至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、 7%,8%,9 % UO % > 11 % > 12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20 %,25%,30 %, 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或至少 100%。 在某些实施方案中，平均细胞容积提高至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、 10%>11 %> 12 %,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %, 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或至少100%。在某些实施 方案中，平均细胞血红蛋白提高至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、 12 %,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %, 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或至少 100%。在某些实施方案中，平均 红细胞血红蛋白浓度提高至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、 13 %,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %,55 %, 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或至少 100%。
[0038] 还可如下描述本文提供的方法的生理结果。具体地说，下列参数的降低表明患者 的无效红细胞发生的治疗。在某些实施方案中，血液中网织红细胞的比例降低至少1%、 2%,3 %,4%,5 %,6%,7 %,8 %,9 % ,10% > 11 % > 12 % ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18%, 19 %,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %,55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %, 90%、95%或至少100%。在某些实施方案中，血液中网织红细胞的比例降低至少1%、 2%,3 %,4%,5 %,6%,7 %,8 %,9 % ,10% > 11 % > 12 % ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18%, 19 %,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %,55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %, 90%、95%或至少100%。在某些实施方案中，脾重或脾细胞总数降低至少1%、2%、3%、 4 %,5 %,6 %,7 %,8 %,9%UO%> 11 %> 12 %,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%, 20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %,55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %, 95%或至少100%。在某些实施方案中，每股骨的骨髓细胞数降低至少1%、2%、3%、4%、 5 %,6 %,7 %,8 %,9 %UO %> 11 %> 12 %,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20 %, 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 至少100%。在某些实施方案中，骨髓成红细胞数降低至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、 7%,8%,9 % UO % > 11 % > 12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20 %,25%,30 %, 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或至少 100%。
[0039] 5. 2待治疗的贫血
[0040] 在某些实施方案中，待用本文提供的方法治疗的患者被诊断为贫血。在某些 更具体的实施方案中，贫血由无效红细胞发生引起。在某些实施方案中，本文提供用 于治疗遗传性骨髓衰竭综合征（例如但不限于无巨核细胞性血小板减少症、戴-布贫 血（Diamond-Blackfan Anemia)、先天性角化不良、范科尼贫血、皮尔逊综合征（Pearson Syndrome)、重度先天性中性白细胞减少症、重度先天性中性白细胞减少症、血小板减少伴 烧骨缺失（Thrombocytopenia Absent Radii))的方法，特别是影响红细胞的遗传性骨髓衰 竭综合征。更具体地讲，本文提供方法用于治疗特异性影响红细胞的遗传性骨髓衰竭综合 征。在某些实施方案中，本文提供用于治疗贫血的方法，其中对象对给予红细胞生成素无反 应。在某些实施方案中，本文提供用于治疗贫血的方法，其中对象对给予铁、维生素B-12和 /或叶酸无反应。在某些实施方案中，本文提供用于治疗贫血的方法，所述贫血由对通过细 胞凋亡的死亡十分敏感的祖红细胞和红细胞前体引起。
[0041] 在某些甚至更具体的实施方案中，待用本文提供的方法治疗的患者被诊断为0 地中海贫血。e地中海贫血是特征在于血红蛋白合成缺陷的疾病，所述血红蛋白合成缺陷 导致红细胞成熟和产生受损。该疾病主要被认为是在红细胞分化的晚嗜碱性/多染性成红 细胞期由于红细胞分化和凋亡异常加速，导致了成熟红细胞产生的总体降低所致。该疾病 的特征在于细胞过多的骨髓腔隙，在所述骨髓腔隙中成红细胞蓄积并进行细胞凋亡，导致 全身性贫血。
[0042] 在某些实施方案中，待用本文提供的方法治疗的患者的脾和/或骨髓和/或血清 和/或血浆和/或肝中的GDFll表达和/或活性的水平提高。在某些实施方案中，对患者 的GDFll水平相对于贫血之前同一人中的GDFll表达和/或活性的水平（如果可获得样品 或数据）或相对于没有贫血的人的GDFll表达和/或活性的水平进行比较。在某些实施方 案中，测量并比较脾、骨髓、血清、血浆和/或肝中的GDFll表达和/或活性水平。在某些实 施方案中，待用本文提供的方法治疗的患者的⑶FllmRNA水平升高至少1 %、2%、3%、4%、 5 %,6 %,7 %,8 %,9 %UO %> 11 %&g