一种高效抗炎性pb odn序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药技术领域，更具体地，涉及一种高效抗炎性PB ODN序列及其 应用。
【背景技术】
[0002] 国内众多兽用抗炎性药物都主要依靠抗生素，但长期使用抗生素，会导致严重的 耐药性，目前国内外众多企业已经开始限制使用多种抗生素，抗生素的滥用也极大程度限 制了我国肉类食品的出口。另外一个预防兽类疾病的手段就是利用疫苗。但多种病原菌的 血清型众多，疫苗交叉反应，保护效果差。因此急需一种新型安全的抗炎性制剂。
[0003] 益生菌DNA是益生菌能够抑制多种炎症反应的主要效应因素，其中存在特定的益 生基序（Probiotics Motif)。益生菌DNA中益生基序的筛选与此前从大肠杆菌DNA中筛 选CpG基序具有异曲同工之处。这里，我们为了区别其与哺乳动物来源的抑制性寡核苷酸 (Suppressive oligodeoxynucleotide，Sup 0DN)，将益生菌 DNA 的益生基序命名为益生 ODN (Probiotics oligodeoxynucleotide，PB 0DN)。细菌 DNA 能够通过非甲基化 CpG 序 列作用于宿主免疫系统的TLR9受体，促使B细胞增殖，诱发强烈的Thl炎性反应，增强抗原 抗体反应，因此，细菌DNA早期也被应用于感染治疗。后来，Krieg等筛选出细菌DNA中的 CpG序列（嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶)，进而人工合成含有CpG序列的寡具脱氧核酸（CpG oligodeoxynucleotide, CpG 0DN)，并证实免疫效果远远高于细菌DNA，由此开创了 CpG预 防细菌感染和治疗癌症的光辉历史。
[0004] 相类似的，2000年，Pisetsky等发现哺乳动物的DNA具有免疫抑制功能。继而发 现了 Sup ODN序列，近来人类微卫星DNA和线粒体DNA等哺乳动物保守区域都成为了新的 Sup ODN的研究位点，从此掀开了抑制性ODN研究的热潮。
[0005] 2012年，Bouladoux发现Sup基序大量存在于益生菌DNA中，而且认为此前很多有 关益生菌DNA在炎症治疗方面的研究可能最终起作用的就是DNA中存在的Sup基序。认为 在益生菌DNA中存在一类全新的免疫调苄基序，而且具有调控炎症反应，恢复免疫微环境 平衡的功能，申请人对益生菌DNA进行了大量筛选分析工作，发现其中存在类似"ACTTGG" 为特征的高重复率的PB ODN基序，经过验证，确定具有明显的炎症调控能力。因此，从益生 菌DNA中筛选出具有明显炎症抑制活动的特征序列，不仅可以为益生菌的开发利用研究提 供更多信息，也可以控制多种病原体感染后炎症，具有可观的研究前景和价值；但是目前还 没有PB ODN的相关文献及用于防治猪炎症的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种高效安全 的抗炎症PB ODN序列。
[0007] 本发明是第二个目的是提供含有上述PB ODN序列的PB ODN制剂，基于所述制剂， 可成功替代或部份替代抗生素，避免疫苗保护效果不全面的目的。
[0008] 本发明的第三个目的是提供上述PB ODN制剂的应用。
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的： 一种高效抗炎的PB ODN序列，如SEQ ID NO :1所示。本发明从益生菌DNA中筛选获得 了一种PB ODN序列，该序列具有高效抗炎作用。
[0010] 本发明所述PB ODN序列获得方法如下：通过对绝大部分大肠杆菌和乳酸杆菌的 保守重复序列进行分析，发现"CCAAGG"和"CCAAGC"可能是两类潜在的抑制性基序，并参 照Bouladoux的方法，从NCBI数据库中获得28种乳酸杆菌的基因组、27种大肠杆菌的基 因组、金黄色葡萄球菌基因组、猪微卫星DNA、猪线粒体DNA和猪端粒酶DNA等近100个基 因组，借助"fuzznuc"在线分析软件分析上述基序的拷贝数，再参照胡大利等(胡大利等， 2007)筛选方法进行ODN活性筛选得到。
[0011] 在使用前，本发明所述PB ODN序列需经过硫代化，硫代化处理为本领域常规技术。
[0012] 本发明还提供含有上述PB ODN序列的制剂(简称为PB ODN制剂);具体的，可以将 经硫代化后的PB ODN序列用无菌PBS溶液配制浓度为10~lOOPg/ml，保存于-15~-25°C。
[0013] 优选地，所述PBS溶液的组成为：按照重量百分比计，0. 6~I. 0% NaCl、0. 01~ 0· 04% KC1、0. 0124 ~0· 0164% Na2HP04、0. 014 ~0· 034% KH2PO4,在 115 ~121Γ 下，灭菌 15 ~25min〇
[0014] 具体地，所述灭菌可以采用湿热高压灭菌法，其操作可以参照本领域常规技术。
[0015] 本发明还提供所述PB ODN序列在制备治疗或预防猪疾病的制剂中的应用。
[0016] 更优选地，所述猪疾病为由猪嗜血杆菌引起的疾病。
[0017] 本发明还提供上述制剂在治疗和/或预防猪疾病中的应用，具体地，当用于治疗 时，是在猪的疾病发病后，立即按每公斤猪重量皮下注射〇. 2~Iml PB ODN制剂，3~7天 后再次给药；当用于预防时，是在猪的疾病发病高峰期前一周，按每公斤动物重量皮下注射 0· 1~0· 5ml PB ODN制剂，3~7天后再次给药。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明提供了一种高效抗炎的PB ODN序列及其应用，该序列具有高效抗炎作用；含有 该序列的制剂非常有利于控制猪疾病和炎症，可成功替代或部份替代抗生素，从而降低抗 生素及疫苗的使用量；使动物类食品更加安全，符合绿色环保的要求，有利于降低养殖动物 生产企业的成本，也能提高养殖企业的养殖效率。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。 在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换， 均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知 的常规手段。
[0020] 实施例1 PB ODN的序列（SEQ ID N0:l):5'- TCCAAGTACTTGGACTTGG-3'，可采用现有基因工程或 化学方法合成，该序列均经硫代化处理(硫代化处理可以参考本领域的常规工艺进行)。合 成后，用无菌PBS溶液配制成l(^g/ml的制剂（PB ODN制剂)，保存于-15°C备用。
[0021] 所述PBS溶液组成为：按照重量百分比计，0. 6%的NaCl、0. 01%的KC1、0. 0124%的 Na2HP04、0. 014%的KH2PO4溶于水中；然后米用湿热高压灭菌法在115°C下，灭菌20min。湿 热高压灭菌法是本领域常用的灭菌方法，其操作可以参照现有技术进行。
[0022] 预防：在猪的疾病发病高峰期前一周，按每公斤动物重量皮下注射0.1 ml所述PB ODN制剂，3天后再次给药。
[0023] 治疗：在猪的疾病的发病后，立即按每公斤动物重量皮下注射0. 2ml所述PB ODN 制剂，3天后再次给药。
[0024] 实施例2 PB ODN的序列（SEQ ID N0:l):5'- TCCAAGTACTTGGACTTGG-3'，可采用现有基因工程或 化学方法合成，该序列均经硫代化处理(硫代化处理可以参考本领域的常规工艺进行)。合 成后，用无菌PBS溶液配制成3(^g/ml的制剂（PB ODN制剂)，