用于动态可配置神经网络的神经突生长的电动力约束的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求于2013年1月14日提交且名称为"Electrokinetic Confinement of Neurite Growth for Dynamically Configurable Neural Networks"的美国临时专利申请 第61/752, 183号的优先权，将其整体通过引用并入本文以用于各种目的。
[0003] 政府资助
[0004] 本发明在政府支持下并利用国家科学基金会授予的编号为DBI-0852654的资助 金和国家卫生研究院授予的编号为R01-NS066352的资助金完成。政府享有本发明的某些 权利。
技术领域
[0005] 提供了用于改变神经突生长的系统和方法。
[0006] 背景
[0007] 在体内发育神经突同时经受在空间上和时间上变化的导向因子的影响。这些导向 因子使神经元能够形成功能性的神经网络。例如，来自非洲爪蟾蜍（Xenopus)幼体中的视 网膜神经节细胞的早期的神经突在视神经交叉处交叉呈十字形以形成对侧的连接，但是某 些之后的神经突由于增高的印hrin-B型配体表达被从中线排斥，并且不交叉。研究和操纵 这样的过程要求能够随着神经突发育同时在时间和空间上提供控制的方法和系统。此外， 同时还需要能够形成具有分布在短距离上的几个神经突的小神经网络和具有分布在较长 距离上的数量较多的神经突的大神经网络的可扩展的方法和系统。现有的方法不能够动态 地改变神经突发育和/或不容易扩展。因此，需要改进的方法和系统。
[0008] 概述
[0009] 提供了用于改变神经突生长的系统和方法。本发明的主题涉及，在某些情况下的， 相互有关的产品、对特定的问题的可选择的解决方案和/或一个或多个系统和/或产品的 多个不同的用途。
[0010] 在实施方案的一个集合中，一系列的方法被提供。在一个实施方案中，方法包括提 供包括一个或多个神经突的神经元，提供交变电流电场，以及使用交变电流电场定向引导 一个或多个神经突的伸长。
[0011] 在另一个实施方案中，方法包括使用交变电流电场定向引导神经突的伸长。
[0012] 在另一个实施方案中，方法包括使用由两个或多于两个电极产生的场影响神经突 的生长。电极之间的中心到中心间距小于或等于约200微米。
[0013] 在另一个实施方案中，方法包括使用电场在多个方向影响神经突的生长。电场在 神经突的附近具有大于或等于约lOOV/m的强度。
[0014] 在另一个实施方案中，方法包括提供包括神经突的神经元，提供物理导向因子，以 及使用物理导向因子控制神经突的生长。物理导向因子能够可逆地阻止神经突的生长。
[0015] 在另一个实施方案中，方法包括允许神经突在第一取向上的生长以及把非机械致 动的物理导向因子应用于神经突，由此影响神经突使得神经突的生长在第二取向上发生。
[0016] 在另一个实施方案中，方法包括提供多于一个神经元，其中每个神经元包括一个 或多个神经突。方法还包括提供电场，独立于另外的神经突而控制一个神经突，以及由所述 多于一个神经元形成神经网络。
[0017] 在一个实施方案中，方法包括使用导向因子使第一神经突与第二神经突重叠。
[0018] 在另一个实施方案中，方法包括引导神经突的生长使其与第二神经突重叠。
[0019] 在一个实施方案中，方法包括使用电场在三维支架（scaffold)内定向引导第一 神经突和第二神经突的伸长以形成在第一神经突的集群和第二神经突的集群之间的神经 网络。
[0020] 在另一个实施方案中，方法包括使用电场在三维支架内加速神经突伸长。
[0021] 在实施方案的另一个集合中，一系列的产品被提供。在一个实施方案中，产品包括 能够容纳活细胞并且促进细胞生长的室、通道、以及多个电极对。通道被连接于室并且通道 具有小于或等于约20微米的高度和/或宽度。一个电极对包括具有小于或等于约200微 米的中心到中心间距的两个电极。所述多个电极对交叉通道。
[0022] 在另一个实施方案中，产品包括连接于第一通道的第一室、与第一通道的至少一 部分对准的第一电极对、连接于第二通道的第二室、以及与第二通道的至少一部分对准的 第二电极对。第一电极对的一部分可以与第一室的至少一部分重叠并且第二电极对的一部 分可以与第二室的至少一部分重叠。在某些例子中，第一通道和第二通道在具有大于约10 微米的高度的重叠区处交叉。
[0023] 在另一个实施方案中，产品包括连接于第一室和第二室的第一通道以及与第一通 道的至少一部分对准的第一电极对。在某些例子中，第一电极对的一部分与第一室的至少 一部分重叠并且第一电极对之间的中心到中心间距小于或等于约200微米。
[0024] 根据本发明的各种非限制性的实施方案的以下的详细描述，同时参照附图考虑， 本发明的其他的优点和新颖的特征将变得明显。在本说明书和通过引用并入的文献包括矛 盾的和/或不一致的公开内容的情况下，本说明书应当主导。
[0025] 附图简述
[0026] 本发明的非限制性的实施方案将参照附图以实施例的方式被描述，附图是示意性 的并且不旨在按比例进行绘制。在附图中，被图示的每个相同的或近似地相同的部件通常 由单个数字表示。为了清楚的目的，不是每个部件都在每个附图中被标记，也不是所示出的 本发明的每个实施方案的每个部件都在每个附图中被标记，在这些情况下，图示对于使本 领域的技术人员理解本发明不是必需的。在附图中：
[0027] 图1A-E图示了大体上涉及改变神经突生长的本发明的某些实施方案；
[0028] 图2A-D图示了大体上涉及形成神经连接的本发明的某些实施方案；
[0029] 图3A图示了根据本发明的一个实施方案的神经网络；
[0030] 图4图示了根据本发明的各种实施方案的电系统；
[0031] 图5A-B图示了根据本发明的某些实施方案的用于改变神经突生长的装置；
[0032] 图6图示了根据本发明的各种实施方案的神经突生长；
[0033] 图7图示了根据本发明的一个实施方案的神经突生长；
[0034] 图8A-B图示了根据本发明的一个实施方案的装置部件的特征；
[0035] 图9A-B图示了根据本发明的一个实施方案的模型的特征；
[0036] 图10A-B图示了根据本发明的一个实施方案的模型的特征；
[0037] 图11A-B图示了根据本发明的一个实施方案的模型的特征；
[0038] 图12图示了根据本发明的各种实施方案的用于形成神经连接的装置；
[0039] 图13图示了根据本发明的某些实施方案的神经突的生长；
[0040] 图14A-B图示了根据本发明的一个实施方案的动作电位记录和荧光图像；
[0041] 图15A-B图示了根据本发明的某些实施方案的装置部件的特征。
[0042] 图16A-C图示了根据本发明的某些实施方案的用于改变神经突生长的装置；
[0043] 图17A-B图示了大体上涉及改变神经突的取向的本发明的某些实施方案；
[0044] 图18A-B图示了大体上涉及指引在某个区中的神经突生长以及加速神经突伸长 的本发明的某些实施方案；
[0045] 图19A-B图示了大体上涉及减慢神经突伸长的本发明的某些实施方案；
[0046] 图20A-C图示了大体上涉及改变神经突的取向的本发明的某些实施方案；
[0047] 图21A-G图示了根据本发明的一个实施方案的用于引导神经突的装置；
[0048] 图22A-D图示了根据本发明的某些实施方案的使用支架填充通道的方法；
[0049] 图23A-E图示了根据本发明的一个实施方案的对于各种电压的细胞活力和在各 种电压的细胞的图像的图；
[0050] 图24图示了根据本发明的某些实施方案的在电极对之间的区中的神经突生长。
[0051] 详细描述
[0052] 本发明大体上涉及一个或多个神经元的神经长出。用于改变神经突生长的系统和 方法被总体描述。在某些实施方案中，系统（例如微流体性的系统）可以包括具有神经突 (例如轴突）的神经元和能够产生物理导向因子（例如电运动力）的部件。物理导向因子 可以被用于改变神经突的生长并且可以在时间上和在空间上是动态的，使得神经突生长能 够以空间和/或时间的方式被改变。在某些例子中，部件可以是电极并且物理导向因子可 以是由电场（例如交变电流电场）产生的电运动力。在某些情况下，系统可以包括多于一 个神经元，每个神经元包括一个神经突。在某些这样的情况下，一个或多个物理导向因子可 以被用于形成神经突之间的单向的连接。这些系统可以非常好地适合于在神经突生长、神 经信号传递和形成面向工程的神经网络的定量研究中的应用，但是这些系统也可以在其他 的应用中使用。
[0053] 在活体生物中的神经突生长通过导向因子被指引，导向因子的表达同时在空间上 和时间上变化，以形成功能性的神经连接。现有的用于研究神经突生长和/或形成神经连 接的系统和方法使用静态的几何构型，并且不能够动态地改变在神经突上应用的导向因 子。此外，这些系统和方法中的许多不能够被容易地扩展以由跨越很大的距离的大量的神 经突形成神经网络。
[0054] 已经发现，在本发明的某些实施方案的背景下，对神经突生长和面向可扩展的神 经网络的形成的空间和时间控制可以使用动态的物理导向因子（例如电动力的现象）被实 现。神经突生长的动态控制开启了多种应用，所述应用的范围从发育生物学（例如发育神 经科学）到再生性的装置（例如用于周围神经损伤的设备）。
[0055] 用于使用动态的物理导向因子改变神经突（例如轴突、树突）的装置的一个实施 例在图1A中示出。如在图1A中例证性地示出的，装置10可以容纳包括一个或多个神经 突20的位于室25中的神经元15。装置可以包括室25,其能够容纳活细胞并且促进细胞生 长，神经突可以在其中生长的通道30,和能够产生物理导向因子的电极35。在某些实施方 案中，室和通道可以被配置为使得神经元细胞体16被约束于室，同时一个或多个神经突可 以生长到通道30中。在一个实施例中，通道可以具有小于神经元细胞体但大于神经突的平 均尺寸的尺寸（例如高度、宽度、横截面积）。通道的尺寸，在某些例子中，也可以限制占据 通道的神经突的数量和神经突的方向性。例如，通道的横截面积可以允许单个神经突占据 通道。在其它的例子中，通道的横截面积可以允许多个神经突（例如神经突的集群）占据 通道。在某些实施方案中，通道可以起作用以通过把神经突生长约束至一个维度而限制神 经突的方向性。例如，如在图1B-1D上示出的，把室25连接于第二室25-2的通道30的宽 度防止神经突改变取向。因此，进入通道30的正在生长的神经突将朝向室25-2伸长。在 其他的实施方案中，通道可以允许多维度的生长，例如方向和平面的改变。在某些例子中， 神经突和神经元细胞体可以在通道30中生长。
[0056] 在某些实施方案中，电极35中的一个或多个可以交叉通道30的至少一部分。在 某些情况下，一个或多个电极可以交叉所有的通道，而在其他的情况下，一个或多个电极可 能不交叉所有的通道。在某些实施方案中，电极相对于通道的取向（例如夹角）影响神经 突生长在物理导向因子存在时如何被改变。例如，在其中物理导向因子是力的实施方案中， 电极的取向可以决定力的方向。在一个实施例中，当电极垂直于通道（即90°夹角）时，如 在图1A中示出的，平行于通道的力可以被产生。应当理解，电极不施加对神经突生长的物 理阻挡并且可以被用于产生非接触的（即无接触的）物理导向因子。
[0057] 在某些实施方案中，一个或多个电极可以与一个或多个通道的至少一部分对准和 重叠。在某些情况下，一个或多个电极的整个的长度可以与一个通道对准和重叠，而在其他 的情况下，一个或多个电极的长度的一部分可以不与通道对准和/或重叠。在某些实施方 案中，电极相对于通道的取向（例如一个或多个电极与通道平行对准和重叠）影响神经突 生长在物理导向因子存在时如何改变。例如，在某些实施方案中，电极的取向可以把神经突 生长约束于特定的区、路径和/或平面。
[0058] 在某些实施方案中，电场36 (例如，交变电流电场、直流电电场）在两个电极（即 电极对）之间产生，如在图1A中示出的。电场可以产生一个或多个可以改变神经突的生长 的物理导向因子（例如电动力的现象、焦耳加热）。在某些实施方案中，物理导向因子可以 被集中至特定的附近位置处（例如，在电极之间、邻近电极）。例如，物理导向因子的产生可 能要求电场高于某个强度（例如lOOV/m)。物理导向因子不可能在低于电场门限强度的区 域中产生。
[0059] 改变装置10中的神经突生长的一个实施例在图1B-1D中示出。如例证性地在图 1B中示出的，装置10可以容纳位于能够容纳活细胞并且促进细胞生长的室25中且具有第 一神经突20-1和第二神经突20-2的神经元15。电极35交叉通道30的一部分。图1B示 出了生长期之后在装置10中的神经突20-1和20-2的生长的示意性表示。在生长期期间， 神经突20-1和20-2分别地生长到通道30-1和30-2中，并且朝向室25-2伸长。在某些实 施方案中，在电极35A和35B之间施加电压，以产生防止神经突20-1经过电极35B伸长的 物理导向因子。神经突20-2在物理导向因子不存在时可以伸长至室25-2,如在图1B中示 出的。
[0060] 改变神经突生长的另一个实施例在图1E中进行了图示。如在图1E中示出的，装 置100可以容纳位于能够容纳活细胞并且促进细胞生长的室125-1中的具有多个神经突 (例如，120-1、120-2、120-3、120-4)的神经元115。在某些实施方案中，装置可以包括电极。 在某些实施方案中，一个或多个电极的至少一部分可以与通道重叠。例如，如在图1E中图 示的，两个电极对，电极对135和电极对136,的一部分可以与室重叠。在某些实施方案中， 由电极产生的物理导向因子可以指引一个或多个神经突（例如，120-1、120-2、120-3)从神 经元伸长到电极对之间的区。在某些例子中，电极的至少部分可以与通道130的至少一部 分重叠并对准。例如，如在图1E中图示的，电极135A和136A与通道130的一部分对准并 重叠。在某些实施方案中，所述一个或多个电极可以实质上平行于通道的壁。在某些例子 中，电极的一部分可以实质上平行于通道的壁。在生长期期间，神经突120-1、120-2、120-3、 和120-4生长到通道130中并且朝向室125-2伸长。在某些实施方案中，电压被施加于电 极135A和136A，以产生把生长（例如伸长）约束在电极135A和136A之间的区内并且防止 神经突120-U120-2和120-3在被通道130界定的整个区内生长的物理导向因子。神经突 120-4在物理导向因子不存在时可以在电极135A和136A之间的区的外部的区中生长。 [0061] 在某些实施方案中，被约束在电极之间的神经突可以具有与在实质上相同的条件 (培养环境、温度、压力、湿度等等）下的不被约束在电极之间的神经突相比的增强的（例如 加速的）生长（例如伸长）。在某些这样的实施方案中，平行于电极对的至少一部分（例如 与通道对准并且重叠的部分）测量的神经突的长度可以大于在电极对的外侧（即不被约束 在电极对内）但是在实质上相同的条件下培养的神经突的长度。不希望被理论限制，相信， 神经突生长被增强，因为被物理导向因子（例如电场）导致的力限制神经突的生长锥的有 效的探测区域。与其有效探测区域不被限制的神经突相比，区域的减少减少了被花费在探 测环境的时间总量。在某些实施方案中，神经突伸长可以使用电场在三维支架内加速。在 某些这样的实施方案中，用于产生场的电极可以不被容纳在支架内。
[0062] 在某些实施方案中，神经突的生长的改变可以是可再配置的，如在图1C-D中图示 的。图1C示出了包括具有在通道30中生长的神经突的多个神经元的装置10的图像。电 极35在通道30-3交叉通道30并且产生在通道30-3中的物理导向因子。在某些实施方案 中，在通道30-3中生长的神经突被防止伸长经过电极35B朝向室25-2,如由空心箭头指示 的。在不交叉电极的通道30-4中生长的神经突可以朝向室25-2伸长，如由实心箭头指示 的。在某些实施方案中，关闭电压消除物理导向因子，这可以逆转神经突生长的改变。如在 图1D中示出的，在物理导向因子消除之后，在通道30-3中的神经突可以朝向室25-2伸长， 如由实心箭头指示的。
[0063] 如本文描述的，神经突生长可以使用物理导向因子被改变。改变神经突生长可以 涉及改变神经突的一个或多个生长特性。例如，神经突长度和取向二者都可以被改变。在某 些例子中，实质上神经突生长的所有的特性都可以被改变。神经突特性的非限制性的示例 包括生长速率、神经突长度、取向（例如方向）、位置（例如平面、尺寸）和生长锥特性（例 如，肌动蛋白极化）。其他的生长特性也是可能的。通常，任何合适的生长特性都可以被改 变。
[0064] 在某些实施方案中，术语因子或导向因子具有本领域的技术人员已知的一般含 义。因子可以指可以被神经元细胞体或神经突接收到并且被该神经元细胞体或神经突翻译 为关于一个或多个生长特性的指令的信号（化学物、力等等）。导向因子可以指在被神经元 细胞体或神经突翻译为关于一个或多个生长特性的指令之后，根据在实质上相同的条件但 是不存在该因子的情况下的所述生长特性的正态统计分布改变一个或多个生长特性、并且 允许所述生长特性被改变或控制的因子。在某些例子中，引导或影响神经突生长可以涉及 改变一个或多个生长特性在延长的时间时期内的正态统计分布（例如，至少约一个小时、 至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约1日、至少约2日、至少约4日、至少 约一周）。
[0065] 在某些实施方案中，物理导向因子具有本领域的技术人员已知的一般含义。例如， 在某些实施方案中，物理导向因子是非化学信号，其可以被神经突接收到并且被该神经突 翻译为关于一个或多个生长特性的指令。物理导向因子的非限制性的示例包括电动力现象 (例如，介电电泳、电渗透、电热效应）、能量（例如热能）、机械力（例如被流体流动产生的、 与结构阻挡物的相互作用）、非机械致动的力、光学因子及其组合。应当理解，虽然物理导向 因子可以不涉及化学物种对神经突的直接应用，物理导向因子可以产生化学物种和/或使 化学物种改变神经突生长。在某些实施方案中，非机械致动的力可以指不起源于一个或多 个机械致动元件或不由一个或多个机械致动元件（例如机械致动以自旋的粒子）产生的非 接触力。在某些实施方案中，物理导向因子可以起源于不直接接触神经突和/或用作对神 经突生长的物理阻挡的一个或多个元件或由其产生。
[0066] 物理导向因子用于改变神经突生长的方式可以取决于多种因素，例如围绕神经突 的几何约束（例如，结构阻挡物）、哪些生长特性被影响、其他的导向因子的存在、物理导向 因子的强度、物理导向因子的空间性质和/或时间性质，等等。在其中存在多于一个神经突 的实施方案中，物理导向因子用于改变神经突生长的方式可以不同于另一个神经突和/或 对于一个神经突的生长改变的结果可以不同于另一个神经突。在某些情况下，该方式和结 果可以是实质上相同的。因此，神经突生长改变的结果可以根据实施方案变化。
[0067] 例如，在某些实施方案中，改变神经突生长可以涉及影响神经突的生长，使得至少 一个生长特性不同于神经突的自然生长特性。在某些实施方案中，改变神经突生长可以导 致对一个或多个生长特性的控制（例如神经突长度、生长方向、生长速度）。在一个实施例 中，物理导向因子可以决定神经突的生长速率并且可以可逆地抑制或阻止生长，例如，如在 图1A-B中图示的。在另一个实施例中，如在图1E中图示的，物理导向因子可以增强（例 如加速）神经突的生长速率。在某些实施方案中，物理导向因子的对生长速率的影响可以 通过比较在物理导向因子存在时所生长的神经突的延伸长度与在实质上相同的条件下且 物理导向因子不存在时所生长的神经突的延伸长度的比较而进行量化。例如，在其中物理 导向因子抑制或阻止生长的实施方案中，在物理导向因子（例如非接触的物理导向因子） 的存在下所生长的神经突的延伸长度与在物理导向因子不存在时所生长的神经突的延伸 长度的比率小于或等于约1: 1，小于或等于约〇. 8:1，小于或等于约0. 6:1，小于或等于约 0. 5:1，小于或等于约0. 4:1，小于或等于约0. 2:1，或小于或等于约0. 1:1。
[0068] 在其中物理导向因子增强生长的实施方案中，在物理导向因子（例如非接触的物 理导向因子）存在时所生长的神经突的延伸长度与在物理导向因子不存在时所生长的神 经突的延伸长度的比率可以大于或等于约1:1，大于或等于约1.2:1，大于或等于约1.3:1， 大于或等于约1:5，大于或等于约1. 8:1，大于或等于约2:1，大于或等于约3:1，大于或等于 约4:1，大于或等于约5:1，大于或等于约6:1，大于或等于约7:1，或大