ato 或 EGFP)、 15 y g 的 psPAX2、和 10 y g 的 pVSVg(Addgene)的 Plus 试齐lj (LifeTechnologies)车专染。在 6小时之后，介质被除去并且被由10%FBS和1%BSA补充的DMEM代替。在60小时之后， 上层清液被除去并且被在4°C以3000rpm离心持续10分钟。该上层清液通过0. 45 y m低蛋 白键合过滤器（Millipore)过滤。为了实现病毒颗粒的300倍浓度，已过滤的慢病毒属被 在4°C以24,000rpm超速离心（Sorvall)持续2小时并且然后在4°C下在由1%BSA补充的 D10中再悬浮一整夜。等分部分被在_80°C储存，直到神经元转导。
[0239] 图像获取。
[0240] 图像使用装配有被冷却的CO)摄像机LaVision ImagerQE(LaVision)和自动平 台Ludl MAC 5000(Ludl)的Axiovert 200M(Zeiss)被获取。显微镜被Metamorph软件 (Molecular Devices)控制并且图像使用ImageJ和Matlab (The Mathworks)软件被分析。 图像的集合使用用于Fiji的ImageJ插件被联接在一起。
[0241] 图像分析以量化神经元的数量。
[0242] 神经元体在所联接的图像上使用ImageJ插件MOSAIC进行计数。
[0243] 图像分析以量化偏向角、生长速度和神经元的轴突高度。
[0244] 神经突对准和长度的量化被如下地进行：含有一个具有胶原支架的通道的三个样 品的图像通过使用Matlab (Math Works)对每个条件进行分析和量化。一个样品含有最少 50个树突。反射强度的门限值被定义为能将神经突与背景区分开。通过对每个树突的长轴 拟合一个椭圆，神经突与主通道方向的角度被测定。树突的平行于对准方向的取向对应于 0°的角度。神经突的角度分布基于取向角度的相对频率（被分类为180个角度的分组） 并且通过对高斯半高全宽（FWHM)的拟合被测定。初始的轨线的偏离被定义，使得在沿着 神经突的评价点处的角度具有与前一个50微米（5倍于生长锥直径）相比的多于10%改 变。偏离然后被记录为是那些初始轨线与角度之间的相对的差异。每个神经突的长度从其 在被胶原填充的微通道的开始处的起始点至其端部进行测量。沿着其路线的方向的改变通 过沿着每个延伸部的整个的长度进行跟踪被考虑在内。孤立并且被清楚地隔离的延伸部被 测量，仅为了排除与其他的延伸部的混淆的可能性。生长速度然后通过把相对的测量到的 长度除以那些测量之间的时间变化被评价。3-D形式的轴突高度通过荧光性的共焦图像组 件在Matlab中的后处理被测定。脚本容纳高斯滤波器以减少噪声并且以测定轴突的中心。 折线图包含在通道中的各个切片中所检测到的中心。
[0245] 统计分析。
[0246] 对于轴突阻塞分析，差异通过来自两个独立的实验的不成对的学生的t检验被解 决，其中每个实验条件被复制地进行。对于所有的分析：*P值〈〇. 05 ;**p值〈0. 01 ;***p值 〈0.001。
[0247] 实施例13
[0248] 本实施例描述了在高强度交流电场的细胞活力和约束在电极内发育轴突的方法。
[0249] 在高强度交流电场的细胞活力。
[0250] 把神经元暴露于高强度（E>105V/m)交流电场可能导致对轴突发育的损害。为了解 决该问题，细胞和神经突的外观在实验期间使用明视场显微镜在每个24h中被监视。此外， 对暴露于不同电压之后的细胞存活使用钙黄绿素AM(体外生成）染色进行了研究。钙黄绿 素AM在活细胞中通过酶促反应成为荧光性的。
[0251] 图23A示出了在暴露于0-4Vpp四日之后的有活力的（荧光性的）细胞的数量。 没有显著的差异在对照、2Vpp和3Vpp之间被观察到。仅细胞的一部分在4Vpp下存活。图 23A是在不同电压下的活细胞的平均数量的图。图23B示出了在3Vpp的活细胞培养。图 23C示出了在4Vpp几乎没有互相连接的圆形的发白的神经元。图23D示出了在对照通道中 的健康的神经突。图23E示出了在4Vpp的圆形的并且不规则的神经突。细胞储存器的明 视场图像示出了在3Vpp的健康的细胞培养（图23B)，与在4Vpp的不健康的培养（发白的 并且圆形的细胞，几乎没有互相连接）（图23C)形成对比。相同的观察可以对于在微通道 中的轴突做出。与来自对照通道的有活力的轴突（图23D)相比，使用4Vpp施加电势的电 极附近生长的轴突在数量上较少并且显示出了圆形的并且不规则的生长。
[0252] 根据在实施例2中描述的模型，电流体动力效应包括介质的加热对于大于3Vpp的 电压变得更相关。这与细胞活力实验的观察是一致的。在某些实验中，然而，细胞体在几日 之后团聚。假定这归因于细胞粘附分子（PDL和层粘连蛋白）的降解或不充分的沉积并且 与电场效应无关。
[0253] 所得出的结论是，交流电动力学对细胞活力的影响对于中等电压是最小的，前提 是没有介质的过度的加热发生的话。
[0254] 约束在电极内发育轴突。
[0255]当神经元被夹在电极本身之间时，轴突在电场的附近发育，被限制在电极的边缘 之间，如在图24上示出的。
[0256] 虽然本发明的多个实施方案已经在本文中被描述和图示，但是本领域的技术人员 将容易地设想多种其他的用于执行各个功能和/或获得在本文中描述的结果和/或优点 中的一个或多个结果和/或优点的手段和/或结构，并且这样的变化和/或修改中的每个 都被视为在本发明的范围内。更一般地，本领域的技术人员将容易地意识到，本文描述的 所有的参数、尺寸、材料和配置都表示是示例性的并且实际的参数、尺寸、材料和/或配置 将取决于本发明的教导内容所应用于的一个或多个具体的应用。本领域的技术人员将意识 到，或能够仅仅使用例行实验而断定，本文所描述的发明的具体实施方案的许多等效物。因 此将理解，上文的实施方案仅以例子的方式提供并且在所附的权利要求和其等效物的范围 内，本发明能以不同于所具体描述和要求保护的内容的方式被实践。本发明涉及本文描述 的每个单独的特征、系统、产品、材料、试剂盒和/或方法。此外，两个或多于两个这样的特 征、系统、产品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合，如果这样的特征、系统、产品、材料、试 剂盒和/或方法不是相互矛盾的话，也被包括在本发明的范围内。
[0257] 不定冠词"一（a)"和"一个（an)"，如本文在说明书中和在权利要求中使用的，除 非清楚地指示相反的意思，否则应当被理解为意指"至少一个"。
[0258] 短语"和/或"，如本文在说明书中和在权利要求中使用的，应当被理解为意指如 此被结合的元素的"一个或二个"，即，在某些情况下结合地存在并且在其他的情况下分离 地存在的元素。除非清楚地指示相反的意思，否则，除了被"和/或"条目特别地指代的元 素之外，其他的元素可以可选择地存在，而不管其与那些被特别地指代的元素相关还是不 相关。因此，作为一个非限制性的实施例，对"A和/或B"的引用，在与开放的语言例如"包 括"共同地使用时，可以在一个实施方案中指代有A没有B (可选择地包括除了 B的元素）； 在另一个实施方案中，指代有B没有A (可选择地包括除了 A的元素）；在又一个实施方案 中，指代A和B二者（可选择地包括其他的元素）；等等。
[0259] 如本文在说明书中和在权利要求中使用的，"或"应当被理解为具有与如上文定义 的"和/或"相同的意思。例如，当分隔列表中的条目时，"或"或"和/或"应当被解释为是 包括性的，即，包括至少一个，而且包括多个元素或元素列表中的多于一个元素，以及，可选 择地，包括另外的未列出的条目。除非术语清楚地指示相反的意思，否则，例如"…中的仅 一个"或"…中的唯一一个"，或，当"由…组成"在权利要求中使用时，都将指代包括多个元 素或元素列表中的唯--个元素。通常，术语"或"，如本文使用的，当被排他性的术语例如 "任一个"、"…中的一个"、中的仅一个"或"…中的唯一一个"引导时，应当仅被解释为 表示排他性的替代形式（即"一个或另一个而不是两个"）。"实质上由…组成"，当在权利 要求中使用时，应当具有其在专利法领域中使用的一般含义。
[0260] 如本文在说明书中和在权利要求中使用的，短语"至少一个"，在用于一个或多个 元素的列表时，应当被理解为指代选自来自元素列表中的任何一个或多个元素的至少一个 元素，但是不一定包括在元素列表内具体列出的每个元素中的至少一个和每个元素，并且 不排除元素列表中的元素的任何组合。该定义还允许不同于短语"至少一个"指代的元素 列表内所具体标识的元素的元素可以可选地存在，无论其与那些被特别标识的元素相关还 是不相关。因此，作为一个非限制性的实施例，"A和B中的至少一个"（或，等效地，"A或B 中的至少一个"、或，等效地"A和/或B中的至少一个"）在一个实施方案中可以指代至少 一个，可选地包括多于一个A，没有B存在（并且可选择地包括除了 B的元素）；在另一个 实施方案中，指代至少一个，可选地包括多于一个B，没有A存在（并且可选择地包括除了 A的元素）；在又一个实施方案中，指代至少一个，可选地包括多于一个A，并且至少一个，可 选地包括多于一个B (并且可选择地包括其他的元素）；等等。
[0261] 在权利要求中，以及在上文的说明书中，所有的过渡短语例如"包括"、"包含"、"承 载"、"具有"、"含有"、"涉及"、"保持"、和类似的短语将被理解为是开放的，即，被理解为意指 包括但不限于。仅过渡短语"由…组成"和"实质上由…组成"应当分别是封闭的或半封闭 的过渡短语，如在美国专利局专利审查程序办公手册的2111. 03节中提出的。
【主权项】
1. 一种方法，包括： 提供包括一个或多个神经突的神经元； 提供交变电流电场；以及 使用所述交变电流电场定向引导一个或多个神经突的伸长。2. 一种方法，包括： 使用交变电流电场定向引导神经突的伸长。3. 一种方法，包括： 使用由两个或多于两个电极产生的场影响神经突的生长，其中，所述电极之间的中心 到中心间距小于或等于约200微米。4. 一种方法，包括： 使用在神经突的附近的具有大于或等于约lOOV/m的强度的电场在多个方向影响所述 神经突的生长。5. -种方法，包括： 提供包括神经突的神经元； 提供物理导向因子，其中，所述物理导向因子能够可逆地阻止所述神经突的生长；以及 使用所述物理导向因子控制所述神经突的生长。6. 一种方法，包括： 允许神经突在第一取向上的生长；以及 把非机械致动的物理导向因子应用于所述神经突，由此影响所述神经突，使得所述神 经突的生长在第二取向上发生。7. 一种方法，包括： 提供多于一个神经元，其中，每个神经元包括一个或多个神经突； 提供电场； 独立于另外的神经突控制一个神经突；以及 由所述多于一个神经元形成神经网络。8. -种产品，包括： 能够容纳活细胞并且促进细胞生长的室； 通道，其中，所述通道被连接于所述室，其中，所述通道具有小于或等于约20微米的高 度和/或宽度；以及 多个电极对，其中，一个电极对包括具有小于或等于约200微米的中心到中心间距的 两个电极，并且 其中，所述多个电极对与所述通道交叉。9. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，包括形成单向的神经元连接。10. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，包括形成轴突二极管。11. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述电场是可再配置的。12. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，包括在两个维度中引导神经突伸长。13. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，包括在三个维度中引导神经突伸长。14. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，包括抑制向通道的生长，其中，所述通 道中的所述电场的强度小于lOOV/m。15. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，包括通过改变所述电场引导所述神经 关的生长。16. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述电场是交变电流电场。17. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述电场的强度大于或等于约 100V/m〇18. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述电场的频率大于或等于约 IOOHz〇19. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，影响神经突的生长包括阻止神经 关生长。20. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述场通过电极之间具有小于或 等于约200微米的中心到中心间距的两个或多于两个电极产生。21. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，定向引导伸长包括定向引导在三 维支架内的神经突伸长。22. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述支架是凝胶基质。23. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述支架包含胶原。24. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，影响神经突的生长包括在实质上 相同的条件下相对于在所述场不存在时的神经突伸长加速神经突伸长。25. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，影响神经突的生长包括可逆地阻 止在第一取向上的神经突伸长并且允许在第二取向上的神经突伸长。26. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述第二取向处于相对于垂直于 所产生的电场的电极的轴线的大于或等于90度的角。27. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述第一取向在xy平面中并且 所述第二取向在yz或xz平面中。28. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述物理导向因子是非机械致动 的导向因子。29. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述神经元选自由以下组成的 组：海马神经元、背根神经节神经元、以及视网膜神经节神经元。30. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述电场是非均匀的。31. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述第一通道包括三维支架。32. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述支架是凝胶基质。33. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述支架包含胶原。34. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述通道的高度小于或等于约 20微米。35. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述通道的高度小于或等于约 10微米。36. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述电极对包括两个平行的电 极。37. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述中心到中心间距小于或等于 约100微米。38. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述中心到中心间距小于或等于 约50微米。39. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述活细胞是神经元。40. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述活细胞选自由以下组成的 组：海马神经元、背根神经节神经元、和视网膜神经节神经元。41. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述多个电极对不被容纳在所述 三维支架内。42. 一种方法，包括： 使用导向因子使第一神经突与第二神经突重叠。43. 一种方法，包括： 引导神经突的生长使其与第二神经突重叠。44. 一种方法，包括： 在三维支架内，使用电场定向引导第一神经突和第二神经突的伸长以形成在第一神经 突的集群和第二神经突的集群之间的神经网络。45. -种方法，包括： 在三维支架内，使用电场加速神经突伸长。46. 一种产品，包括： 连接于第一通道的第一室； 与所述第一通道的至少一部分对准的第一电极对，其中，所述第一电极对的一部分与 所述第一室的至少一部分重叠； 连接于第二通道的第二室；以及 与所述第二通道的至少一部分对准的第二电极对，其中，所述第二电极对的一部分与 所述第二室的至少一部分重叠，其中，所述第一通道和所述第二通道在具有大于约10微米 的高度的重叠区处交叉。47. -种产品，包括： 连接于第一室和第二室的第一通道；以及 与所述第一通道的至少一部分对准的第一电极对，其中，所述第一电极对的一部分与 所述第一室的至少一部分重叠，并且其中，所述第一电极对之间的中心到中心间距小于或 等于约200微米。48. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，包括与所述第一通道对准的第二电极 对。49. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述第一电极对实质上平行于所 述第一通道。50. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述第二电极对实质上平行于所 述第二通道。51. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述第二电极对实质上垂直于所 述第一电极对。52. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述第一通道和/或所述第二通 道具有小于或等于约10微米的高度。53. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述重叠区的高度小于或等于约 500微米。54. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述第一电极对的一部分与所述 第二室的至少一部分重叠。55. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述第二电极对的一部分与所述 第二室的至少一部分重叠。56. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述第二电极对之间的中心到中 心间距小于或等于约200微米。57. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，包括施加电场。58. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，包括活细胞。59. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述活细胞选自由以下组成的 组：海马神经元、背根神经节神经元、以及视网膜神经节神经元。60. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述第一通道和/或所述第二通 道包括三维支架。61. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述支架是凝胶基质。62. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述支架包含胶原。63. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述第一电极和所述第二电极之 间的中心到中心间距小于或等于约200微米。64. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述电场是交变电场。65. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述电场的强度大于或等于约 100V/m〇66. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述电场的频率大于或等于约 IOOHz〇67. 根据前述权利要求中的任一项所述的产品，其中，所述第一室和所述第二室被调整 和布置为容纳活细胞并且促进细胞生长。68. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述重叠在三维支架内发生。69. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述第一神经突起源于与所述第 二神经突不同的神经元。70. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述第二神经突起源于与所述神 经突不同的神经元。71. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，引导生长包括施加导向因子。72. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述导向因子是物理导向因子。73. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述导向因子是电场。74. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述电场是交变电流电场。75. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述第一神经突中的小于10% 的第一神经突在所述第一神经突和所述第二神经突重叠处与所述第二神经突形成神经连 接。76. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，神经突与所述第二神经突重叠而 不形成神经连接。77. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述神经突起源于选自由以下组 成的组的神经元：海马神经元、背根神经节神经元、以及视网膜神经节神经元。78. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述支架是凝胶基质。79. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述支架包含胶原。80. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述电场是非均匀的。81. 根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述神经突是轴突。
【专利摘要】总体描述了用于改变神经突生长的系统和方法。在某些实施方案中，系统可以包括包含神经突的神经元和能够产生物理导向因子的电极。物理导向因子可以被用于改变神经突的生长并且在时间上和在空间上可以是动态的，使得神经突生长能以空间方式和/或时间方式改变。神经突生长的动态控制可以被用于形成方向性的神经连接、交叉部和/或重叠。系统包括能够容纳活细胞并且促进细胞生长的室；通道，其中通道被连接于室，其中通道具有小于或等于约20微米的高度和/或宽度；以及交叉通道的至少一个电极对，其具有小于或等于约200微米的中心到中心电极间距，并且其中的多个电极对交叉通道。
【IPC分类】C12M1/00, B82Y15/00, A61N1/32, C12M1/42, B01L3/00, B03C5/00, G01N33/50, C12N5/0793, A61N1/20, C12M3/00, C12N13/00
【公开号】CN105025980
【申请号】CN201480012316
【发明人】乔尔·沃尔德曼, 蒂博·霍尼格, 大卫·佩拉德
【申请人】麻省理工学院, 国家科学研究中心
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年1月14日
【公告号】CA2897195A1, EP2943248A1, US20140199745, US20140199746, WO2014110559A1