使用丙烯酸 (AA)。已知AA断裂胶原小纤维之间的稳定的氢键，导致胶原支架的溶液化。该方案的详细 描述在实施例11中进一步被描述。图16示出了微流体芯片的横截面的图示和微流体芯片 本身的图片。图16A是包括在室中的神经元体以及可以生长到具有变化的高度的胶原支架 中的轴突的被隔室化的电微流体芯片的示意图。图16A是在6日之后在体外（DIV)没有任 何场的、在5微米高的胶原支架中发育的轴突的明视场放大10倍的图片。轴突显示出来自 胶原支架内的细胞体隔室的定向生长。图16C是在培养皿内的微流体芯片的照片。电连接 部在芯片的下部上可见。
[0187] 实施例7
[0188] 本实施例描述了使用交流电场引导在具有5微米的高度的微沟槽内的胶原支架 中的轴突生长。电极的表面形状不影响轴突生长。然而，3Vpp和150kHz的交变电流的施加 排斥在强电场区中的轴突生长并且使轴突改变方向并且在低电场区中生长。
[0189] 微流体芯片，例如在图16中示出的那些，结合共面电极和在已功能化的表面上的 生长的神经元共同使用，以解决交流电动力学力能够通过组合微通道几何约束和电场分布 来引导在胶原支架中的三个维度上的轴突生长的假设。为了解决这个假设，大鼠E-18海马 神经元的发育在电微流体芯片中被观察到，如上文在实施例5和6中描述的，所述实施例具 有变化的沟槽高度和电极几何构型。
[0190]当微沟槽高度（h)是5ym时，轴突生长被限制于单一平面，这是因为生长锥的空 间约束。在神经元在细胞储存器中接种24小时之后，轴突开始延伸进朝向电极的微通道 中。在这时，电场通过施加以3Vpp和150kHz的交变电流被激活。在对照芯片中，场保持不 被激活。细胞被每24小时成像以监视生长和活力。
[0191] 在体外的四日（4DIV)之内，在对照芯片中的轴突填充整个微通道 (600 ymX600 ym)，如在图17中示出的。在未激活的电极上的轴突生长之间或在对照区中 的轴突生长（箭头201)之间未能观察到生长速度上的差异，显示出电极的表面形状（h = 200nm)不影响生长。各个细胞从细胞储存器迀移到微通道中。因为高度限制，这些细胞最 可能是神经胶质细胞，这些细胞挤进窄的开口中，遵循来自发育的轴突的导向因子。
[0192] 在已激活的芯片的对照区（箭头201)中，轴突显示出与在未激活的芯片中近似相 同的生长速度和密度（见图17A)。然而，相反的是，电场区近似地没有轴突生长。轴突实际 上在第一电极之前转向并且跟随场线，直到到达较低场强的区（箭头202)。电极和平行的 轴突之间的距离是约5-10 ym。
[0193] 图17B示出了被评估为所施加的电压的函数的生长方向的改变。对于每个条件， 三个不同的样品，每个具有一个通道，的电场区被分析，使每个被测试的通道容纳最小50 个树突。在图中示出的角度分布代表在与电场相遇之前和之后的生长角度的相对的改变。 黑色线是针对每个电压的中间角度。使电极不被激活（0V)，神经突平行于通道生长（中间 值=0° )并且在生长方向上仅具有小的改变，其同样地发生于两侧（±10° )。生长方向 上的相似的偏离在使用lVpp被激活的场时也能被发现。然而，中间角度略微地漂移到负值 (-2.5° )，意味着远离电极。在该电压下的DEP力是最小的并且假定观察到的改变与交流 电动力学无关。2Vpp的施加导致平均值接近-70°的转向，且具有-50°至-85°的范围。 3Vpp导致高至-90°的最大的转向和与电极平行的生长，如在图17A中观察到的。在2-3Vpp 的范围内，在实施例2中描述的模型估计作用在生长锥上的66pN的最大DEP力。该力与导 致生长锥在主体中的转向的牵引力处于相同的数量级。因此，DEP可能是生长方向改变的原 因。最后，在电极上的4Vpp导致神经突的损伤并且没有角度偏差可以被测定（线在0° )。 这些发现与在实施例13中描述的在不同电压下的细胞活力测试是一致的。
[0194] 在某些情况下，各个轴突从侧部进入电场区中。这可能是在互相交叉的电极阵列 的边缘处的不均匀电场以及因此减少的DEP的结果。在某些实验中，直接地紧邻通道壁生 长的各个轴突的进入被观察到。可能的是，强的机械因子例如通道壁超过DEP效应并且允 许轴突生长到电场区中。对于5 y m高度，支架在通道中的存在或不存在导致相同的行为。 生长锥主要与已功能化的表面互相作用，代替与支架互相作用。因此，对于小的通道高度， 被支架填充的通道可以被视为等于被介质填充的高通道。
[0195] 实施例8
[0196] 本实施例描述了将交流电场用于增强在胶原支架中的轴突生长速度的用途。本实 施例表明轴突生长的化学促进和无接触促进。
[0197] 漏斗状电极被用于研究在信号和接地的电极的附近的轴突的电动力学约束的影 响，如在图18A中示出的。白色虚线标记在对照区中（箭头205)和在漏斗区中（蓝色箭 头）发育的轴突的生长锥。轴突被在图18A中追踪（箭头205)以表明漏斗效应。图18A是 在具有漏斗状设计（4DIV，100kHz，3V pp)的电极的5微米厚的被胶原填充的微通道中的轴 突发育的图像。在漏斗电极之间的轴突（箭头206)比在未激活的电极上方的轴突（对照， 箭头205)更快地生长。插图示出了在电极207的弯曲的部分内的轴突的漏斗引导，追踪了 各个轴突以强调漏斗效应。此外，与不被约束的轴突相比的生长速度的增加被观察到。为 了量化该效应，正在发育的轴突的长度被测量。图18B示出了对于在不同的被施加的电压 下在6DIV之后的在漏斗区和对照芯片（无电极）中的延伸长度。图18B是在同一个场下 在6DIV之后的神经突延伸长度的图。把轴突约束在漏斗内显著地增强它们在2-3V下如相 对于在2D表面（玻璃）上的或在未激活的电极（0V)上方的5mm厚的凝胶中的轴突的生长 速度。（*#，p〈〇.〇〇l;#，p〈〇.〇l)。没有显著的差异在对照、未激活的电极和lVpp(llv = 450 ym)之间被观察到。电压增加至2Vpp导致延伸长度变为l2v=680 ym的显著的升高。 在具有3Vpp的甚至更强的场中，延伸长度（l3v=960ym)是对照的两倍多。除了轴突的空 间约束之外，生长速度的增加被观察到。假设，生长锥需要更少的用于环境探测的时间，因 为交流电运动力把有效的探测区域限制于1-D线。
[0198] 实施例9
[0199] 本实施例描述了将AC场用于减慢在具有10微米的高度的微沟槽内的胶原支架中 的轴突生长的用途。电学力和机械力的组合被用于减慢轴突生长。
[0200] 沟槽高度被增加至h = 10 y m并且神经元被接种在微流体芯片中。在神经元在细 胞储存器中接种24小时之后，轴突开始延伸到朝向电极的微通道中。在此时，电场被激活 并且在lVpp至3Vpp之间的不同的电势被以恒定的150kHz的频率施加。没有电极或具有 未激活的电极的对照芯片被使用。
[0201] 荧光图像在6DIV之后通过荧光成像被获得，如在图19上示出的。
[0202] 支架的存在把已功能化的表面上生长速度提高了近似30%。把150kHz的lVpp施 加于电极不具有对长出的显著的影响。然而，2Vpp和3Vpp分别把轴突的长度显著地减少 32%和48%。对于生长促进的一个潜在的解释是作为支架填充方案的结果的平行于生长方 向的胶原纤维的对准。被对准的胶原纤维提供促进轴突生长的轨道状的机械导向因子，可 以根据所花费的时间的减少决定哪个路径/因子被采用。
[0203] 基于所提出的模型的模拟预测对于150kHz的lVpp，DEP力仅10pN。因此，在生长 锥上所施加的力被其他的导向因子例如基板刚性容易地超过。这可以解释为什么没有对延 伸长度的影响在低的电压被观察到。相反地，较高的电压（2-3Vpp)产生延伸长度的显著的 减少。一个可能的解释将是生长锥的空间约束，其可能已经使生长锥被向上并且远离电极 朝向通道顶部推动，导致微通道的物理约束和电场的排斥效应之间的竞争，从而导致延伸 长度的减少。
[0204] 图19A是在6DIV(100kHz，3Vp p)之后在10mm厚的被胶原填充的微通道中的轴突发 育的图像。在电极上方的轴突生长（箭头211)比远离电极的那些轴突生长（箭头210)短。 图19B是对于同一个场在各种场强度下在6DIV之后的神经突延伸长度的图。在胶原中的轴 突生长随着增加的电压减少，并且可以比在2D表面（玻璃）上的生长慢。（*#，p〈0. 001 ; **，p〈0. 01 ;*，p〈0. 1)。
[0205] 实施例10
[0206] 本实施例描述了将AC场用于推动轴突在具有50微米的高度的胶原支架的深度中 生长的用途，使得轴突延伸在多个维度上发生（例如，xy平面、yz平面、xz平面）。
[0207] 为了仿真三维生长环境，微沟槽高度被增加至50 y m，被胶原支架填充。假设，在这 样的支架中的轴突生长随着电场在胶原中的延伸而在深度上偏转。在神经元接种在细胞储 存器中约24小时之后，神经突开始延伸进朝向电极的被支架填充的微通道中。在此时，电 场被激活并且在lVpp至3Vpp之间的不同的电势被以恒定的150kHz的频率施加。没有电 极或具有未激活的电极的对照芯片被使用。
[0208] 图20A示出了在已激活的电极（3Vpp，150kHz)和6DIV之后的在50 y m高的被胶 原填充的通道中的轴突生长的示意性的并且共焦的图像。共焦的图像示出了沿着图20A中 的红线横穿被支架填充的微通道的荧光性的轴突的侧视图。因为没有暴露于场（顶部）， 所以轴突的大多数靠近通道的玻璃底部生长。越过已激活的电极生长的轴突（底部）在z 方向上偏转。使用共焦显微镜观察轴突偏转并且在支架内量化。图20B示出了来自由共焦 显微镜产生的3D图像的图像处理和侧视图重构的输出。侧视图共焦图像示出了沿着图20A 中的虚线横穿通道的未激活电极（顶部）和已激活电极（底部）的轴突。在没有电场的情 况下，轴突沿着通道的高度统计分布。在施加场时，靠近于电极的轴突生长进行z跃变（实 线）。场区中的轴突的最低高度由水平虚线表示。图20C示出了对于对照和从lVpp至3Vpp 的不同电压的第一轴突的平均高度（***，P〈〇.〇〇l ;**，P〈〇.〇l)。对照使用没有电极的或具 有未激活的场的通道进行。没有高度的显著的差异在没有电极的、具有未激活的电极的或 使用150kHz的lVpp的通道中的生长之间被观察到。对于在2-3Vpp之间的被施加的电压， 在靠近于电极的轴突的z方向上的生长存在显著的升高。对于2Vpp，在电极上的最低的轴 突升高至3Vpp下的7±1.5iim至10±2iim的平均高度。
[0209] 还要注意的是，轴突的升高比在电场区之后的掉落发生得更迅速。此外，在经过场 之后的靠近于通道底部存在更少的轴突生长。似乎是，轴突被电运动力迅速地向上排斥并 且在经过高场区之后再次地本身被统计学地取向。电运动力向上地并且远离电极的边缘作 用，使轴突进行在强电场区上的'跃变'。
[0210] 实施例11
[0211] 本实施例描述了使用AC场使第一神经突的集群和第二神经突的集群在三维基质 内重叠而不形成第一集群和第二集群中的神经突之间的神经连接的方法。
[0212] 为了例证在实施例6-10中描述的这些单元操作可以如何被用于各种应用，用于 创建可调节的轴突交叉的方法被创建。在上文的实施例中描述的停止、漏斗引导和推动功 能性被组合以创建轴突交叉。芯片设计被在图21A中示出并且由以下组成：
[0213] 1-被隔室化并且流体地隔离的神经元的被荧光地染色的两个分别的集群；
[0214] 2-把轴突束朝向芯片的活动部分集中的微流体集中沟槽；
[0215] 3-漏斗形状电极，每对用于一个沟槽；以及
[0216] 4-重叠区。
[0217] 活动地带或重叠区是引导和推动电极和在其中轴突可以被向上推动的局部的50 微米高的微沟槽的组合。在该装置中，胶原被选择性地注射在沟槽中并且被从细胞体被在 其处接种的微通道中除去。为了促进在通道方向的轴突生长，发现，保持神经元隔室（在图 21A上的左侧）和不具有神经元的隔室（右侧）之间的流体静力压力（HP)差异把轴突生 长增加至少30% (轴突连接于没有HP的其他的隔室耗费8至9日，相对于具有HP的5至 6日）。图21A是轴突桥接装置的被联接的透射图片（X20的放大）。两个被流体地隔离 的神经元集群被装板并且在微通道中分别地染色。被隔室化的沟槽允许轴突朝向在插图中 被增强的桥接区发育和汇聚。其由在实际的无接触的重叠区之前汇聚轴突束的漏斗电极组 成。刻度条指示100微米。
[0218] 没有任何场或HP，轴突生长明显是各向同性的，具有朝向保持初始的方向的倾向 (荧光定量示出了在初始的通道的同一个方向的78± 12%的生长速率），如在图21B中示出 的。图21B示出了没有任何来自微通道的场或流体静力压力的重叠区的荧光性的被联接的 图片（放大X20)。刻度条指示100微米。轴突生长被朝向外部沟槽引导并且位于所有的 毗邻的沟槽中。在这种情况下，来自两个集群的神经突在重叠区处重叠，但是神经突形成神 经连接并且也在所有的通道中突出。相反地，当场被激活并且HP被保持时，如在图21C中 示出的，重叠区清楚地汇聚轴突的束，允许它们重叠而不形成神经连接，在其他的通道中萌 芽，并且增加它们的在同一个方向内的生长。图21C示出了具有已激活的场和流体静力压 力的桥接区的荧光性的被联接的图片（放大X20)。刻度条指示100微米。轴突的高度的 肌束震颤被在重叠区的出口处观察到。每种情况（1和2各自地）的邻接矩阵由(；和(： 2给 出。
[0219
[0220] 可选择地，神经连接可以使用两个相对的集群被制造。相对的神经元的两个集 群被在轴突桥接装置中双向连接，如在图7D-E中示出的。为了构建神经连接，场被激活 (150kHz和4Vpp)并且在输出垂直储存器中将HP保持为低。每种情况（1和2各自地）的 邻接矩阵由CJPC 2给出。
[0221]
[0222] 实施例12
[0223] 本实施例描述了在实施例6-13中使用的材料和方法。
[0224] 电动力学装置的微制造。
[0225] 微流体芯片在标准显微镜载玻片（25X75X 1. 1mm，Sigma)上制造。10/100nm Ti/ Au双层使用电子束沉积被沉积在标准显微镜载玻片（25X75X 1. 1mm，Sigma)上。然后使 用标准光刻并且在250mL H20+200mLHCl+100mL HN02中湿蚀刻持续4分钟来构建该层。后 续地，在HCL:水（2:1)中进行第二湿蚀刻10分钟以除去其余的钛。
[0226] 微通道包括两个类型的部件：用于细胞注射的高通道（100微米）和用于轴突生长 的浅通道（在5-50微米高度上）。它们从结合薄的（SU-82007)和厚的（SU8-2050)抗蚀剂 使用二步光刻工艺制造的SU-8(Mic r〇Chem)母版模塑。微通道然后使用已脱气的并且已固 化的PDMS (与固化剂，Sylgard 184, Dow Corning，的质量比率为9:1)被模塑。微沟槽在暴 露于空气等离子体（2分钟）之后被在双目镜下手动地对准并且浸没在甲醇中（5分钟）。 已组装的芯片在l〇〇°C被持续固化30分钟。在初始的模塑之后，塑料母版被制造以用于装 置的进一步的复制。PDMS模具然后使用立体显微镜（M80, Leica)被手动地对准至电极并 且在暴露于空气等离子体2分钟之后被粘合在玻璃基板上。已组装的芯片在80°C被持续固 化30分钟。
[0227]多个微流体芯片被以这种方式构建。为了评价AC场对在胶原支架中的轴突生长 的影响，二隔室芯片被制造，其具有被平面阵列（长度：600微米；宽度：600微米；高度：5 至50微米）分隔的矩形微通道（长度：4000微米；宽度：500微米；高度：100微米）。轴突 桥接芯片是四隔室芯片，由被连接于被放置在正方形中的四个内储存器（长度：1〇〇〇微米， 高度：100微米）的5_打孔的入口和出口储存器制成。每个储存器通过微通道（长度：500 微米；宽度：50微米；高度：5微米）连接于另一个储存器。
[0228] 表面处理和包覆。
[0229] 为了清洁玻璃基板（具有电极），玻璃基板被在7X清洁剂（MP Biomedicals)中 煮沸持续lh，在去离子水中漂洗持续10s，使用丙酮、异丙醇和去离子水清洁并且最后在烘 箱中在20(TC烘烤持续2h。在烘烤之后，基板被等离子体清洁并且被粘合于PDMS微流体。 通道被聚D-赖氨酸（0. lmg/ml，Sigma)填充并且被在37°C持续培育至少20小时。为了 除去游离的TOL，通道被使用去离子水洗涤两次而不清空主通道。接着，通道被层粘连蛋白 (20 y g/ml，Sigma)填充并且被在37°C持续培育2小时。层粘连蛋白被吸出并且通道被使 用平板培养基（DMEM+10% FBS+1% PS+1% L-谷氨酰胺）从一侧至另一侧洗涤3次。以这 种方式被功能化的芯片在细胞接种之前以37°C持续储存最长2小时。海马神经元培养基是 含有2mM谷氨酰胺和100U/ml盘尼西林/链霉素的neurobasal_B27。
[0230] 胶原支架的选择性图案化。
[0231]胶原（10mg/ml，Gibco)在冰上与缓冲溶液（在 2XPBS 中 250mM HEPES，pH 7. 4， 外加2M NaOH)混合持续1分钟。胶原与缓冲剂的比率取决于期望的最终的胶原浓度但是 接近于1:1。在移液入芯片中之前，胶原溶液在冰上被培育10-30分钟以控制纤维厚度。
[0232] 首先，已粘合的芯片被聚d-赖氨酸和层粘连蛋白功能化以允许神经元胞体在细 胞储存器中的附着。第二，整个微流体通道被胶原I型溶液经过支架入口填充并且被在 37°C培育至直到完全的凝胶化。然后乙酸（0.2M，pH 3. 5)被移液入细胞储存器中以使胶原 不稳定。为了防止蚀刻时酸进入微流体通道中，流体静力压力通过把细胞介质移液入入口 中被施加。在37°C下蚀刻30分钟之后，已脱离稳定的支架经过细胞出口被小心地吸出。为 了除去酸和残留物，通道被缓冲的细胞介质冲洗三次。图22示出了用于毛细管填充22-1 和微流体图案化22-2的准则的图示。图22A示出了具有介质储存器（虚线），细胞和支架 储存器（100 ym)和微通道（50 ym)的电微流体芯片。图22B图示了结构被胶原填充和完 全凝胶化之后的电微流体芯片。图22C图示了酸蚀刻细胞储存器之后的电微流体芯片，在 酸蚀刻的同时，微通道被来自被支架填充的储存器的流体静力压力的施加保护。图22D图 示了在已脱离稳定的支架被吸出并且过度的酸和其余部分被缓冲溶液除去之后的电微流 体芯片。图22E是该过程的时间变化图像，并且在时间上可得到500 ym/分钟的蚀刻速率。 作为结果，支架仅保持在电极通道中和保持在介质储存器中，同时细胞储存器是空的并且 可用于细胞的接种。
[0233] 解剖和细胞培养。
[0234] 所有的动物相关的工作都被批准并且遵守协会、州和联邦对于动物福利的指南。 海马神经元从 E18 Sprague Dawley 大鼠（Charles River Laboratories)获得，并且在被 10mM HEPES，pH 7. 3缓冲的冰冷却的Hank's平衡盐溶液（HBSS)中溶解。组织通过在2ml 的含有20U/ml的木瓜蛋白酶（Worthington Biochem.)、lmM EDTA和ImM L-半脫氨酸的被 HEPES缓冲的HBSS中培育30分钟而被溶解。然后，组织被8ml的海马神经元培养基漂洗三 次。细胞被在lml的海马神经元培养基中温和地磨碎，使用血球计计数，并且被以35, 000 个细胞/mm2的密度装板。细胞被保持在37°C，5 % CO 2。细胞介质每3日被更新50 %。为 了保持流体静力压力，神经元隔室的储存器每日被介质系统性地填充并且其他的被清空， 而不干燥储存器表面。
[0235] 在装置中的神经元接种。
[0236] 在接种之前，微流体芯片的储存器被清空，而不从微通道除去介质。对于每个入口 /出口储存器，6 y L的平板培养基被放置在出口中并且紧随其后，4 y L的高密度（>8 106个 细胞/mL)收获的神经元溶液被放置在入口储存器处。芯片被返回至培育器持续5分钟以 使神经元附着在被包覆的玻璃上并且接种过程被重复3次。在结束时，输入和输出储存器 迅速地被海马神经元培养基填充并且芯片被返回至培育器并且插入体外平台中以施加如 在实施例5中描述的AC场。
[0237] 神经元转染。
[0238] 对于每个荧光性的慢病毒属，tdTomato或EGFP在CMV启动子之后并且在土拨鼠 肝炎转录后调节元件（WPRE)之前被在慢病毒转移质粒中克隆并且被在Stbl3细胞中扩增。 为了产生病毒，3百万低传代（小于10)HEK293FT细胞（Life Technologies)在转染前一天 在T-225烧瓶中接种在被10% FBS(Hyclone)补充的DMEM中。细胞被在OptiMEM中使用 100 y L 的 Lipofectamine 2000 和 200 y L 的具有 20 y g 的转移质粒（tdTom