空间梯度，其在电场作用下产生总体流体流动。时间平均后的速度（u ETE)是
[0130]
[0131]
[0132] 其中，H m是介质粘度，k是介质热导率，（r, 9 )是力在其处被评价的极坐标，t^ 是给定为tm= e m/。m的介质弛豫时间，a = -〇. 4% K 1且0 = 2% K i。因子n不在我 们对于我们的介质电导率应用的频率的范围内变化并且具有_〇. 022的恒定值。
[0133] 对ACEO和ETE速度求和以给出总体的净EHD速度<uEHD>，其在稳定状态通过椭球 摩擦系数（ellipsoidal friction factor)转化为作用在生长锥上的力（FRHn)〇
[0136] 第三个力是DEP力。使用与Castellarnau相同的方法，对于在共面的电极配置中 的扁椭球体，我们外推出作用在生长锥上的第n阶DEP力且表示为：
[0134]
[0135]
[0137]
[0138]
[0139] 其中，d是电极之间的距离（在我们的设置中d = 15ym)，A是去极化因子沿着椭 球的三个轴线中的任何一个轴线的一个分量，和分别是i层的内隔室和外隔室的复 介电常数并且n是多极子的阶数。Clausius-Mossotti因子（CMF)捕获力的频率依赖性并 且在图10中针对宽的频率范围以及针对几个介质电导率进行了表示。每个层的介电性质 根据肌动蛋白、神经元细胞质和膜的文献信息获取。因为场强度在生长锥维度内剧烈变化， 所以高至n = 4的Clausius-Mossotti因子的高阶矩（图10B)，如由Jones和Washizu引 入的（1994)高阶矩，被考虑。我们发现，这些高阶的多极子对总体的DEP力的贡献远远小 于（大约10 5倍更小的）经典的偶极子的贡献。这些较高阶的力，如我们的结果和文献已 经示出的，排斥物体并且因此对增加DEP力有贡献，并且因此与我们的发现是一致的，即， 在我们的操作条件DEP力大于EHD力。此外，该模型不把由于生长锥与玻璃表面紧邻而导 致的DEP力中的偏差考虑在内。然而，Lynch等人测量附接于玻璃表面的红血球的DEP力 并且发现该力与经典的核-壳隔离的颗粒模型十分一致。因此，在我们的系统中可以对于 生长锥假定相同的行为。
[0140] 因为所有的力都是频率和电压相关的，所以所产生的EHD和DEP力的相对大小在 频率和电压幅度的范围内进行了绘制（图10B)并且这些力的绝对值在图11上进行了绘 制。DEP力和EDH流动二者配合作用，以排斥生长锥远离电极。所得到的模型提供关于被施 加在生长锥上的力的趋势和力的大小的量级的可靠的信息。EHD力在200kHz-lMHz的整个 频率范围具有几乎恒定的响应，而DEP力的大小具有很强的频率相关性（图3SB)。我们发 现，在低电压（大约<2.70V PP)下，DEP力大于EHD力，在其中加热是最小的。在频率方面， EHD在高于大约250kHz的频率成为更显著的，因为生长锥的CMF(以及因此产生的DEP力） 的大小在f>l〇〇kHz时减少。
[0141] 检查轴突堵塞数据（图1D)，我们发现，较低的频率（f〈250kHz)导致最小的轴 突长度，并且此时DEP/EHD比率是最大的（图3b)。相似地，模型示出了在较高的频率 (f>250kHz)的DEP力的大小的减少，同时在实验中观察到，当升高频率时，增加的轴突长 度一一以及因此产生的较小的电动力学效应。此外，模型示出了 DEP/EHD比率随着在给定频 率下的电压增加而减少，而实验显示出在除了 100kHz之外的所有频率，随着电压的增加， 轴突长度增加。有趣的是，该最低的频率可能对应于DEP/EHD与频率的关系图中的峰（图 9B)，其中DEP力在很大的电压范围内比EHD更大。因此，定量的轴突长度数据中的趋势（图 1D)与发育的轴突通过其被DEP力作用的机制是非常一致的。使用该模型和参数的值，发 现，被施加在生长上的最大的DEP力是大约66pN(图11)，其与由体外脊髓连合的神经元轴 突的生长锥施加的拉力和由Netrin-1施加以导致生长锥吸引的力在同一个数量级。
[0142] 应当被理解，该AC电动力学建模是非限制性的假设，但是却提供了对根据高强度 AC电场驱动轴突生长的抑制的可能的过程的理解。可选择的机制可以在细胞内起作用，例 如通过通过场产生的肌动蛋白极化，并且是用于未来的研究的有效的途径。
[0143] 图9A是在我们的分析中使用的生长锥模型的示意图。图9B是在生长锥上的DEP 力和EHD力之间的被建模的比率。
[0144] 图10示出了生长锥模型的被模拟的Clausius-Mossotti因子。图10A示出了用 于多个介质电导率的第一阶（偶极子）模型并且图10B示出了第一阶DEP力和用于在神经 元介质电导率上增加多个多极子的第n阶力之间的比率。插图折线图表示生长锥的CMF的 第n阶多极子的详细视图。高阶DEP力比第一阶力小几个数量级。
[0145] 图11示出了在本研究中使用的整个频率范围和电压范围的介电电泳力（FDEP)和 电流体动力（FEHD)的被模拟的值。EHD力在整个频率具有几乎恒定的响应，而DEP力的大 小在200kHz-lMHz范围中具有很强的频率相关性，这是与实验地观察到的趋势一致的。
[0146] 实施例3
[0147] 本实施例描述了使用本发明中对轴突伸长的动态控制，通过由允许或防止轴突经 过的一对电极'门'组成的轴突-锁定系统来创建轴突-二极管。
[0148] 电动力学轴突阻挡的动态的本质被利用以形成轴突的单向的生长，并且因此形成 轴突二极管。轴突二极管使用在锁定中类似于门作用的电极的两个集合以允许轴突仅从 一侧生长跨越（图2A)。装置是三微室芯片，被布置为等边三角形，使每个微室具有与6个 用于溶液转移的井（图12)接口连接的各自的入口和出口储存器（图2B)。每个微室经过 仅轴突可以在其中生长的微通道（高度~3微米）连接于另一个微室。每个微通道具有 通过把电极的两个集合（接地-AC-接地）放置在微通道的每个端部处而形成的两个轴突 '门'（图2B)。为了创建轴突二极管，连接每对微室的门以动态的方式打开和关闭。当其 AC电压被关闭时，门被打开并且轴突自由地生长超出电极。当AC信号被接通时，门被关闭 并且轴突不能够行进跨越门。被施加以关闭门的AC信号的参数被设置为f = 100kHz和V =3VPp，因为发现这些参数在阻挡神经突长出上是有效的（图ID)。
[0149] 我们通过首先把神经元装板在三个微室中的每个中，使门初始地被关闭（AC电压 被施加），证明二极管的功能性（图2Ci)。在24小时之后，在微通道中的两个门中的一个 被打开（AC电压被切断），允许来自一个微室，被称为'上游'微室，的轴突把轴突延伸入微 通道中（图2Ci-ii)，而在相对的"下游"微室中的轴突保持被关闭的门阻挡。神经元连接 的方向性由哪个门被首先打开定义，使轴突仅沿从上游微室至下游微室的方向通过。一旦 轴突已经延伸超出开放的门，那么两个门的状态被逆转：最初开放的门被关闭并且在之前 关闭的门被打开（图2C-iii)。在这样操作时，在微通道中的上游轴突将延伸超出第二门 并且建立与下游神经元集群的连接。因为第一门现在被关闭，所以来自下游微室的轴突不 能够迀移至上游微室并且将被俘获在微通道中或保持在下游微室中。最后，两个门被关闭 以防止任何另外的轴突迀移经过微通道（图2Civ)。从上游微室至下游微室的轴突长度（n =12)在该过程期间被测量（图13)。可以看到，只要场被启动，轴突就不通过被激活的电 极。此外，生长锥不从被激活的电极返回（生长锥中间位置的标准偏差随着时间消失）。当 门被打开时，轴突生长过程以42±7微米/日的速率继续，与在通道的中部中观察到的生长 速率（72±10微米/日）相比，这慢了很多（41%的相对误差）。这可以被解释为，直到这 时，生长锥才访问（explore)在之前因为电场而不可到达的表面。最后，一旦门被加电，下 游轴突就停留在上游门的前方，而不经过该门。电动力学轴突堵塞的这种特定的空间-时 间应用被称为"轴突-锁定系统"。
[0150] 图2C示出了轴突二极管的侧视示意图并且图2B和12是轴突二极管芯片的图像， 其中示出了三个微室和电极。
[0151] 图2C示出了轴突-锁定系统的示意图（左）和相位图像（右），其中生长锥由 所定位的白色的箭头指出。通道的中部被白色点强调。罗马数字描述以下内容：（i)两个 门都被关闭，使得没有轴突进入微通道；（ii)左门被打开，并且唯一的一个轴突从左进入； (iii)左门被关闭并且右门被打开；（iv)在第一轴突完全经过且超出门之后两个门都被关 闭。图13是从上游微室（蓝色）和下游微室（红色）迀移的轴突的测量长度以及左门和 右门的激活计时的图。
[0152] 实施例4
[0153] 本实施例描述了由三个轴突_锁定分隔的神经元的三个集群组成的神经回路的 形成，以演示功能性的工程神经网络的组装。动作电位记录演示AC电动力学效应不损害轴 突，并且Ca 2+成像演示了突触的连接的单向的本质。
[0154] 使用轴突-锁定系统，演示了功能性的轴突二极管的构建。轴突二极管已经被在 体外形成和使用以模仿在体内的神经元路径引导的方向性。方向性对于再生轴突以在周围 神经损伤之后和在发育期间创建合适的连接是至关重要的。几乎没有体外系统能够创建方 向性的连接。交流电动力学效应具有可再配置能力的优点，因为电场可以根据意愿被启动 和关闭。因此，动态地锁定或释放正在发育的轴突的生长的能力对于神经元网络的创建具 有使人激动的潜力。特别地，在神经引导导管中的轴突的选择性的生长可以改进轴突朝着 它们的目标的导向并且防止轴突的误萌芽和不合适的神经支配。
[0155] 为了使用多个轴突二极管产生神经网络，电极门被动态地打开和关闭以引导轴突 使得室'A'在一个方向与室'B'连接，并且室'B'在一个方向与室'C'连接，而室'C'不在 任一个方向连接于室'A'（图6A)。
[0156] 我们首先检查通过活动的门的轴突的功能性以验证交流电场不损伤轴突的产生 和传送动作电位（AP)的能力。为了进行动作电位测量，我们将门电极重新设想为刺激和记 录电极以监视在通过二极管的轴突中的AP传播。电极的第一集合被作为刺激电极使用并 且第二集合被作为记录电极使用。
[0157] 图14A示出了来自已经通过轴突-锁定中的一个轴突-锁定的轴突的集合的动作 电位读数。当每个刺激脉冲被施加时，沿着通过整个的二极管的轴突另外记录AP，确定轴 突-锁定系统不干扰AP产生或传播。
[0158] 方向性的网络的突触是否是激活的随后被确定。Oregon Green BAPTA 1被作为着 色剂使用以可视化当动作电位被KC1添加剂诱发时诱出的Ca++通量。KC1刺激通过选择性 地加压另一个外储存器被限制到单个微室（图15)。当KC1被加入到室'A'时，去极化被在 所有的三个室中观察到（图14B，左），而向室'B'加入KC1仅诱出在室'B'和'C'中的Ca ++ 振荡（图14B，中），并且向室'C'加入KC1仅产生在室'C'中的振荡（图14B，右）。这些 结果表明室'A'被连接于室'B'并且被连接于室'C'（图14B，左），并且还表明功能性的 突触能够把来自起源于室'A'中的神经元的信号通过室B转移至在室'C'中的那些信号。 此外，以下的观察，即刺激室'B'产生在室'C'中的Ca ++振荡（图14B，中）但是刺激室'C' 不产生在室'B'中的Ca++振荡（图14B，右），表明两个室被轴突二极管定向连接。总体上， 这些结果表明在我们的轴突-锁定系统中创建海马神经元的被定向连接的网络的能力。
[0159] 图3是由轴突-锁定系统配置的12日体外神经元网络的荧光性的假彩色图像。平 面箭头表示二极管的方向。图14A示出了动作电位记录，示出了刺激信号（黑色）和下游 被记录的信号（有颜色的）。图14A是当依次地刺激神经元的每个子集群（由+KC1表示） 时的Oregon Green BAPTA 1-染色的神经元的假彩色的焚光图像。刻度条是50微米。
[0160] 图15示出了通过使用差异性的流体静压力的流动的隔室化。通过放置在被连接 于每个微室的入口和出口储存器中的液体的体积产生压力。因此，可能的是，通过放置正确 的液体体积，把流动从一个微室导向至另一个微室，并且因此包含了仅向仅神经元的一个 集群的局部应用化学物。图15A-B分别是当流动不被限制和当流动被限制时的三个微室的 荧光图像。箭头指示通量的方向以及被添加到入口 /出口中的液体的体积和量。通过把10 微摩尔的荧光素和1微摩尔的荧光性的聚苯乙烯注射在一个储存器中将流动可视化。
[0161] 实施例5
[0162] 本实施例描述了在实验中使用的材料和方法。
[0163] 电动力学装置的微制造和用于神经元装板的制备。
[0164] 微流体芯片在150mm的玻璃晶片上制造。在标准的光刻步骤之后，利用电子束沉 积一个10/100nm的Ti/Au双层并且在丙酮中剥离（lift-off)以暴露电极。然后对晶片 进行管芯切割以获得单独的芯片。微通道包括两个类型的部件：用于细胞注射的高通道 (100ym)和用于轴突生长的浅通道（高度为3ym)。它们由结合薄的（SU-82005)和厚的 (SU8-2050)抗蚀剂使用两步光刻工艺制造的SU-8(Micr 〇Chem)母版模塑。微通道然后使用 已脱气并且已固化的PDMS(与固化剂的质量比9:l，Sylgard 184,道康宁）被模塑。塑料 母版然后被用作用于最终的PDMS复制的未来的模具。微沟槽在暴露于空气等离子体（2分 钟）并且在甲醇中浸没（5分钟）之后，在双目镜下手动对准。已组装的芯片被在KKTC固 化持续30分钟。
[0165] 两个不同的微流体芯片被以这种方式构建。第一个（图1)是由被微沟槽的阵 列（长度：450 ym;宽度：5ym;高度：3ym)分隔的矩形的微通道（长度：4000 ym;宽度： 500 ym ;高度：100 ym)制造的二隔室芯片。第二芯片（图4)是由被连接于被放置在等边 三角形中的三个微室（直径：500 ym，高度：100ym)的5-mm打孔的入口和出口储存器制造 的三隔室芯片。每个储存器经过微通道（长度：450 ym ;宽度：50 ym ;高度：3 ym)被连接于 另一个储存器。微通道被〇. lmg/mL的聚1-赖氨酸（Sigma Aldrich)在培育器中包覆持续 24小时。通道然后被使用去离子（DI)水漂洗3次并且使用20 y g/mL的层粘连蛋白（Sigma Aldrich)包覆持续2小时。通道被使用去离子水再次地洗涤3次并且使用含有2mM谷氨 酰胺和l〇〇U/ml盘尼西林/链霉素（海马神经元培养基）的Neur 〇basal-B27洗涤和填充 3次。微流体芯片被放置在培育器中直到使用。
[0166] 解剖和细胞培养。
[0167] 所有的动物相关的工作都被麻省理工学院动物保护委员会和比较医学分会（MIT Committee of Animal Care and Division of Comparative Medicine)批准并且遵守协 会、州和联邦对动物福利的指南。海马神经元从E18Sprague Dawley大鼠（Charles River Laboratories)获取，并且在被10mM HEPES，pH 7. 3缓冲的冰冷却的Hank's平衡盐溶液 (HBSS)中溶解。组织通过在2ml的含有20U/ml的木瓜蛋白酶（Worthington Biochem.)、 ImM EDTA和ImM L-半胱氨酸的被HEPES缓冲的HBSS中培育30分钟而被溶解。然后，组织 被8ml的海马神经元培养基漂洗三次。细胞被在lml的海马神经元培养基中温和地磨碎， 使用血球计计数，并且被流进该装置中。细胞被保持在37°C，5%的C02。
[0168] 在装置中的神经元接种。
[0169] 在接种之前，微流体芯片的储存器被清空，而不从微通道除去介质。对于每个入口 储存器，4 yL的高密度（>8 106个细胞/mL)已离解的神经元溶液被放置为邻近微通道的入 口。芯片被返回至培育器持续5分钟以使神经元附着在被包覆的玻璃上并且接种过程被重 复3次以实现高的细胞密度。在结束时，输入和输出储存器迅速地被海马神经元培养基填 充并且芯片被返回至培育器。
[0170] 神经元转染。
[0171] 在装板之后24小时，神经元被使用微管蛋白-GFP杆状病毒（Tubulin-GFP Bacmam 2. 0病毒，Life Technologies)转染，其比率为对于104个细胞使用2 y L的病毒，如被分布 器指示的。细胞然后在16小时的培育之后被在荧光中成像。
[0172] 图像获取。
[0173] 图像使用装配有被冷却的CO)摄像机La Vision ImagerQE (La Vision)和自动化 平台Ludl MAC 5000(Ludl)的Axiovert 200M(Zeiss)被获取。显微镜被Metamorph软件 (Molecular Devices)控制并且图像使用ImageJ和Matlab (The Mathworks)软件被分析。
[0174] 用于把AC电信号施加到培育器中的体外平台。
[0175] AC信号通过被放置在培育器内侧的定制的平台被施加于微电极。微流体芯片被对 准并且被插入被联接于Arduino自制的印刷电路板组件的无插拔力（ZIF)连接器中。无插 拔力连接器用作芯片的机械保持器和电保持器。组件主要由3个板组成，主Arduino板、直 接数字合成（DDS)产生的AC信号板和路由板。DDS板（基于DDS-60子板，Midnight Design Solution)能够产生在0-60MHz和围内的AC信号。路由板（使用模拟器件公司 的ADG333ABR开关，以及德州仪器公司的74HC595移位寄存器）能够把AC信号重路由并且 保持至一个或多个电极。Raspberry Pi小型计算机通过USB被连接于Arduino,控制整个 组件。web服务器被安装在Rasberry Pi上，使得用于每个电极的频率和电压可以通过web 浏览器被实时地远程地改变。电信号被选择性地发送至每个电极，具体通过由电开关和移 位寄存器组成的自制的arduino板。闭合开关的命令被web服务器正在其上持续地运行的 Rasberry Pi发送至arduino。arduino板和ZIF连接器二者最终都被放置在培育器中。
[0176] 轴突长度测量。
[0177] 所有的沟槽都被在落射荧光下拍照并且轴突的长度使用Matlab被测量。成像算 法包括首先增强对比度和亮度，然后二进制化图像（门限值针对每个图像手动优化），然后 应用霍夫变换并且最终测量通道边缘和轴突的端部之间的缝隙。对于每个电压和频率，我 们把被标准化的轴突长度定义为观察到的轴突长度（在图6上AL)和通道的边缘与第一电 极之间的距离（在图6上DCE)之间的比率。对于轴突-锁定系统，轴突长度使用与上文相 同的算法被测量。当生长锥被电极隐藏时，该位置被假定为是电极自身的中部，具有电极宽 度的误差。
[0178] 神经元网络刺激。
[0179] 神经元被Oregon green BAPTA1 (Life Technologies)染色持续1小时并且使用 介质洗涤。为了仅刺激一个子集群，20yL的90mM KC1溶液仅被注射在一个微室的入口中。 神经元的另一个集群的储存器中的每个被50 yL的介质填充，从而创建室之间的压力差以 防止KC1从被注射的微室流出。这种流体流动隔室化的细节在补充性信息中给出。
[0180] 动作电位记录。
[0181] 动作电位通过微电极本身被记录在轴突-锁定三角形芯片中。来自同一个微通道 的微电极通过ZIF模块被连接，作为刺激电极并且作为记录电极。脉冲发生器（TTi)被联 接于换流器（Isolator-10, Axon Instruments)然后联接于刺激电极。记录电极被联接于 锁定放大器（1〇4倍增益，IS0-80, World Precision Instruments)并且被联接于PC示波 器（PicoScope，PC示波器软件）。信号然后被输出到Matlab中并且被在时间上同步化。
[0182] 统计分析。
[0183] 对于轴突阻塞分析，差异通过来自两个独立的实验的不成对的学生的t检验被解 决，其中每个实验条件被复制地进行。对于所有的分析：*P值〈〇. 05 ;**p值〈0. 01 ;***p值 〈0.001。
[0184] 实施例6
[0185] 本实施例描述了在含有电极的微流体装置（例如电微流体芯片）中的三维胶原基 质（例如胶原支架）的选择性的图案化。
[0186] 胶原被在微流体通道和/或其他的微流体结构内侧选择性地图案化，而没有对于 额外的图案化通道或另外的设备的需要。取决于微流体通道的高度，方法基于毛细管流动 平衡以使用胶原灌注微流体芯片的被定义的区域。简单描述，胶原在整个微流体芯片内流 动并且在某些微通道中排除胶原，为了芯片中的流动平衡，所述某些微通道仅...