一种中药组合物在制备治疗放射性肺损伤药物中的应用_3

文档序号:9359492阅读:来源:国知局
取液 过滤后,残渣弃去,滤液备用; (3) 连翘、炎麻黄、鱼腥草、大黄,用10倍量90%的乙醇提取2次,第一次3小时,第二 次2. 5小时,提取液合并过滤,回收乙醇,滤液备用; (4) 金银花、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天,加11倍量水煎煮至沸,加入炒苦 杏仁、煎煮2次,第一次1. 5小时,第二次1小时,提取液合并过滤,所得滤液与步骤(2)广 藿香提油后的滤液合并,浓缩成在60°C时测定相对密度为1. 10-1. 15的清膏,加乙醇,调节 至醇浓度为70%,冷藏放置24小时,过滤,回收乙醇至无醇味,得清膏备用; (5) 步骤(4)所得清膏与步骤(3)所得醇提液合并,浓缩至在60°C时测定相对密度为 I. 15-1. 20的清霄,喷雾干燥,得干霄粉,备用; (6)将步骤(5)所得干膏粉,步骤(2)所得挥发油及薄荷脑按常规方法制成丸剂,得药 丸905丸。
[0031] 实施例4: 原料药配方为: 连翘170克 金银花170克 炙麻黄57克 炒苦杏仁57克 石膏170克 板蓝根170克 绵马贯众170克 鱼腥草170克 广藿香57克大黄34克 红景天57克 薄荷脑5.0克 甘草57克 制备方法: (一) 提取工艺: (1) 按照上述处方量称取中药材,净选,酌情碎断; (2) 广藿香加6倍量水提取挥发油,提油时间4h,收集挥发油,出油率为0. 33 ±0. 05%, 提取液过滤后备用,残渣弃去; (3) 连翘、炎麻黄、鱼腥草、大黄,用8倍量70%的乙醇提取2次,第一次2小时,第二次 1. 5小时,提取液过滤,滤液合并,回收乙醇至无醇味,备用; (4) 金银花、炒苦杏仁、石膏、板蓝根、绵马贯众、甘草、红景天,加9倍量水煎煮至沸, 加入炒苦杏仁,煎煮2次,第一次1. 5小时,第二次1小时,提取液过滤,滤液合并同时加入 步骤(2)广藿香提油后的水溶液,浓缩成60°C测定相对密度为1. 10-1. 15清膏,加95%乙 醇,边加边搅拌,至醇浓度70%,冷藏放置24小时,过滤,滤液回收乙醇至无醇味,与醇提液 合并,浓缩至浓缩成60°C测定相对密度为1. 25-1. 35稠膏,备用; (二) 制剂工艺: (5) 制剂配方为:步骤(4)所得稠膏335. 5g 薄荷脑5g 步骤(2)所得广藿香油0.2ml 糖粉342. 5g 糊精514. Og (6) 制粒:将糖粉和糊精混合均匀,用稠膏作粘合剂制软材,14目筛网制粒,60- 65°C 烘干,10目筛网整粒; (7) 分装:筛出细粉适量,将薄荷脑、广藿香挥发油加入适量乙醇,溶解,喷入细粉中, 混合均匀,并与颗粒混合均匀,密闭半小时,装袋,即得,以上处方可制成颗粒l〇〇〇g。
[0032] 实验例: 为证实本发明中药组合物具有治疗放射性肺损伤的疗效,用按实施例1方法制得的胶 囊(以下称本发明药物),进行了以下药理试验研究: 资料与方法 一、材料与方法 1.实验动物及分组:健康、成年、SPF级、雌性、Wistar大鼠48只,体重180~200g,购自 湖北省实验动物研究中心(合格证号:SCXK (鄂)2008-0005),实验前在清洁动物房饲养7天 ,观察无异常者入组。将大鼠随机分为照射加本发明药物高剂量组(treated by high-dose LHQW with radiation, LHQWH组)、照射加本发明药物中剂量组(treated by middle-dose LHQW with radiation, LHQffM组)、单纯照射组(radiation only Group, R组)和空白对照 组(Blank Control Group, C组),每组各12只,并用苦味酸标记。
[0033] 2.主要试剂与药品:本发明中药组合物由石家庄以岭药业股份有限公司提供(生 产批号:130232);市售试剂:Trizol (invitrogen公司,美国),MMLV逆转录酶及dNTPs (T0Y0B0公司,日本),RnaseA酶抑制剂(Takara公司,大连),DNA聚合酶(TransGen公司,北 京),11-6和1陬-(1£115厶检测试剂盒(?印1〇16(*公司,美国) ;〇118〇(11\0-3(^111、11-6 及TNF-a引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
[0034] 3.照射方法:大鼠用10%的水合氯醛生理盐水(350mg ? kg-1)行腹腔注射麻醉 后,仰卧位,四肢展开固定于自制固定板上,充分暴露胸部,照射野大小为2. 8cmX 4. 2cm,总 剂量DT = 20Gy,SSD=IOO. Ocm。通过监视仪观察受照射大鼠,凡在照射期过程中出现扭动 者,剔除出组。
[0035] 4.动物处理:照射前3天开始灌胃,直至照射后第28天结束,共31天。LHQWH组: 灌胃本发明中药组合物药粉0. 84g ? kg-1体重,每日1次;LHQffM组:灌胃本发明中药组合 物药粉0. 42g ? kg 1体重,每日1次;C组及R组:灌胃生理盐水,每日1次。
[0036] 5.切片及HE染色:肺组织于10%的甲醛固定液中固定24h后,常规石蜡包埋、切 片、粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片,用光学显微镜(OLYMPUS 1X81,日本)行切片观察 及图像采集。
[0037] 6.肺泡灌洗液细胞计数:大鼠处死后解剖胸腔,结扎左主支气管,气管插管后用 PBS灌洗右肺,每次2mL,共3次,回收率约为90%。将肺泡灌洗液在4°C下 以1200r / min离心5 min,弃上清,重复洗2次,最后用4ml PBS重悬细胞并计数。
[0038] 7.血清中白介素-6 (IL-6)和肿瘤坏死因子-a (TNF-a )测定:大鼠麻醉后心脏 取血约4 mL,3000r/min,离心10min,取血清于_80°C保存。血清标本中IL-6及TNF-a的 检测按照ELISA试剂盒说明书进行操作。
[0039] 8. RT-PCR 法检测肺组织 IL-6 和 TNF- a mRNA 的表达:用 Iml Trizol 提取 50mg 肺组织总RNA,用紫外分光光度计测定RNA纯度(A260/A280=l. 6~1. 8)及浓度,取0. 5 ii g 总RNA按说明书行逆转录反应,30°C反应lOmin,42°C反应60min,70°C反应15min。取I ill 訂产物行?〇?,?〇?反应按941:预变性3.5111111,941:308,531:158,721:208,33个循环。 引物序列如表1。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后拍照观察结果。
[0040] 9?统计分析 运用SPSS 17.0统计软件进行分析,实验数据均以均数土标准差(X土S)表示,组间 比较采用组间t检验和方差分析,以P〈0. 05表示差异具有统计学意义,P〈0. 01表示差异 极具统计学意义。
[0041] 二、实验结果 1.大鼠一般情况 单纯照射组大鼠自照射后第3天出现精神萎靡、进食量与活动量减少、眼睛出现黄色 分泌物、大便干,第14天后照射局部出现脱毛,部分大鼠出现咳嗽症状,照射后第26天上述 症状开始逐渐减轻。而照射加本发明药物高、中剂量组大鼠精神状态较单纯照射组好,眼睛 分泌物、大便干硬等方面的发生率低、程度较轻、出现时间较晚、持续时间较短,至照射后第 18天,上述表现开始逐渐消失,无明显咳嗽症状。
[0042] 2.病理组织观察 照射加本发明药物高、中剂量组在照射后第1天仅见肺间质少量炎性细胞浸润,第14 天见肺间质轻到中度水肿及炎性细胞浸润等急性炎性改变,28天时炎症明显减轻,以及肺 间质增厚,肺泡结构轻微破坏。而单纯照射组自照射后第1天即见肺间质增厚,炎性细胞浸 润,第14天时炎性反应严重,表现为肺间质充血、出血、水肿,大量炎性细胞浸润,肺泡结构 破坏,第28天时炎症稍减轻,肺间质增厚,肺泡腔变小(如图1)。
[0043] 3.肺泡灌洗液细胞计数:照射后大鼠肺泡灌洗液细胞总数明显升高,与单纯照射 组相比,本发明药物高剂量组在照射后的各时间点肺泡灌洗液细胞总数均减低(如表2),其 中第14、28天差异具有显著地统计学意义(t =3. 237、3.431,P〈0.05)。本发明药物中剂量 组的肺泡灌洗液细胞总数与单纯照射组比较有所减低,但照射后第14天差异无统计学意 义(t=l. 710, P >0.05),而照射后的第28天两者比较差异显著(t =2. 658, P〈0.05)。
[0044] 表2.本发明中药组合物作用下放射性肺损伤大鼠肺泡灌洗液细胞计数 (X土S,X 104/ml)
注:LHQWH 组与 R 组比较:t =3. 237, #P〈0.05; t =3. 431,〈0.05. LHQffM 组与 R 组比较:t =L 710, >0.05; t =2.658, 〈0.0
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