[0032](2) 15mg 二氢卟吩 e6 溶于 7.5mL DMSO,加 EDC (24mg)和 NHS (14.4mg)活化 I 小时。称取28.3mg步骤(I)中所得的PEG化的透明质酸溶于DMF = H2O混合溶剂(1: lv/v, 3mL)，加入活化后的二氢卟吩e6溶液中，搅拌反应12小时(过夜)。反应液在透析袋中透析三天，冻干，得到二氢卟吩e6-透明质酸的结合物。
[0033](3)称取15mg步骤⑵中所得的二氢卟吩e6_透明质酸的结合物溶于水，加5mg单壁碳纳米角，用带探头的超声仪超声60?180min。所得分散液在5000rpm离心30min，除去大颗粒物质。再在14000rpm离心30min除去未结合的二氢卟吩e6_透明质酸，得最终产物碳纳米角/ 二氢卟吩e6_透明质酸复合物，其中，二氢卟吩e6质量分数为9.41 %，单壁碳纳米角质量分数为49.13%。
[0034]所得碳纳米角/ 二氢卟吩e6-透明质酸复合物可以在水、PBS及细胞培养基中均匀分散并稳定存在至少I个月以上。
[0035]制备实施例2
[0036]制备单层无卷曲石墨烯/ 二氢卟吩e6-透明质酸复合物
[0037]按照实施例1，不同之处是在步骤(3)将单壁碳纳米角换成单层无卷曲石墨烯。
[0038]测试实施例1
[0039]实验方法如下:
[0040](I)将实施例1所得碳纳米角/ 二氢卟吩e6_透明质酸复合物溶液用二次水配制成碳纳米角浓度为25.04 μ g mL 1的溶液，取I毫升于标本瓶中，在650nm激光(3W cm 2)照射下，用热像仪记录溶液的颜色变化，也即溶液的温度变化。
[0041]随着光照时间的增加，碳纳米角/ 二氢卟吩e6-透明质酸复合物溶液的温度也显著升高，并在5分钟内升高了约25°C。证实碳纳米角/ 二氢卟吩e6-透明质酸复合物溶液具有良好的光热效应。
[0042](2)以9，10-二苯基蒽丙酸为检测剂，用荧光方法检测碳纳米角/ 二氢卟吩e6_透明质酸复合物溶液在透明质酸酶作用及650nm激光(3W cm2)照射下产生单线态氧的能力。
[0043]在透明质酸酶作用及650nm激光(3W cm2)照射下，9，10-二苯基蒽丙酸的焚光减弱，证实碳纳米角/ 二氢卟吩e6-透明质酸复合物能产生单线态氧，具有光动力效应。
[0044]应用实施例1
[0045]制备实施例1制备的碳纳米角/ 二氢卟吩e6_透明质酸复合物作为光热及光动力治疗剂，其体外细胞测试方法如下:
[0046]分别配置二氢卟吩e6浓度为0.25,0.5、1.0、2.0、4μΜ的碳纳米角/ 二氢卟吩e6-透明质酸复合物溶液。小鼠黑色素瘤细胞(B16细胞)在96孔板(每孔14个细胞)中培养24小时后，加入所配制的系列浓度的碳纳米角/ 二氢卟吩e6-透明质酸复合物溶液，培养24小时，用650nm激光(3W cm 2)照射3?8min，再培养24小时，用噻唑蓝比色法测细胞存活率。
[0047]结果显示对细胞的杀死率可达70%?90%。证实碳纳米角/ 二氢卟吩e6_透明质酸复合物对小鼠黑色素瘤具有良好的杀死率。
[0048]应用实施例2
[0049]制备实施例1制备的碳纳米角/ 二氢卟吩e6_透明质酸复合物作为光热及光动力治疗剂，其体内裸鼠测试方法如下:
[0050]把小鼠黑色素瘤细胞(B16细胞)皮下移植到裸鼠体内，培养6?7天。静脉注射200 μ L碳纳米角/ 二氢卟吩e6-透明质酸复合物溶液到裸鼠体内，随后每天用650nm激光(3ff cm 2)照射肿瘤部位5分钟，持续照射7天。
[0051]结果显示:明显抑制肿瘤细胞的生长，并且肿瘤体积在以肉眼可见的速度减小。证实碳纳米角/ 二氢卟吩e6_透明质酸复合物可有效杀死裸鼠体内小鼠黑色素瘤细胞。
[0052]应用实施例3
[0053]将应用实施例1、2的方法应用于鼠鳞状细胞癌(SCC7)、人乳腺癌(MDA-MB-231)、人结肠癌(HCT 116)、人肺腺癌(A549)等癌细胞，相同条件下实验结果相近。在应用实施例1条件下，对细胞杀死率为70?90% ;在应用实施例2条件下，肿瘤生长受到明显抑制。
[0054]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.靶向光双重治疗的碳纳米复合物，是由水溶性二氢卟吩e6-透明质酸形成的结合物与单壁碳纳米角或单层无卷曲石墨稀构成的π-π共轭复合物； 其中，二氢卟吩e6的质量分数为I?35.00%，单壁碳纳米角或单层无卷曲石墨稀的质量分数为30?60%。2.如权利要求1所述的靶向光双重治疗的碳纳米复合物，其特征在于:二氢卟吩e6的质量分数为5?25.00%，单壁碳纳米角或单层无卷曲石墨稀的质量分数为40?50%。3.如权利要求1所述的靶向光双重治疗的碳纳米复合物，其特征在于:二氢卟吩e6质量分数为9.41 %，单壁碳纳米角质量分数为49.13 %。4.权利要求1、2或3所述的靶向光双重治疗的碳纳米复合物的制备方法，包括如下步骤: (1)将透明质酸溶于PH7.4的磷酸缓冲液，随后加EDC和NHS进行活化，活化后再加两端带氨基的PEG，搅拌，完成反应后透析，冻干； (2)将二氢卟吩e6溶于DMSO，加EDC和NHS活化，取步骤(I)的所得物溶于DMF= H2O混合溶剂后加入到活化后的二氢卟吩e6溶液中，搅拌，完成反应后透析，冻干，得到水溶性二氢卟吩e6_透明质酸形成的结合物； (3)取步骤(2)中所得的结合物溶于水，加入单壁碳纳米角或单层无卷曲石墨烯，超声分散后进行两次离心处理，即得最终产物。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于:在步骤(I)中，所述的活化时间为10?30分钟；所述搅拌的时间为8?16小时；所述透析在透析袋中进行，透析时间为2?4天。6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于:在步骤(2)中，所述的活化时间为0.5?2小时；所述搅拌的时间为8?16小时；所述透析在透析袋中进行，透析时间为2?4天；所述DMFiH2O混合溶剂的比例为I?10: lv/v。7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于:在步骤(3)中，所述两次离心处理中，第一次的离心机转速为5000?lOOOOrpm，第二次的离心机转速为10000?20000rpm，每次尚心处理时间为20?60分钟。8.一种药物组合物，包含权利要求1、2或3所述的靶向光双重治疗的碳纳米复合物和至少一种药学上可接受的载体或溶媒。9.权利要求1、2或3所述的靶向光双重治疗的碳纳米复合物在制备抗肿瘤药物方面的应用，所述瘤药包括黑色素瘤、鳞状细胞癌、乳腺癌、人结肠癌和人肺腺癌。10.权利要求8所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物方面的应用，所述瘤药包括黑色素瘤、鳞状细胞癌、乳腺癌、人结肠癌和人肺腺癌。
【专利摘要】本发明的靶向光双重治疗的碳纳米复合物，是由水溶性二氢卟吩e6-透明质酸形成的结合物与单壁碳纳米角或单层无卷曲石墨烯构成的π-π共轭复合物；其中，二氢卟吩e6的质量分数为1～35.00％，单壁碳纳米角或单层无卷曲石墨烯的质量分数为30～60％。该复合物同时有光热、光动力和靶向的多重治疗作用，增强对癌细胞的杀伤效率。该复合物还具有酶响应性，在透明质酸酶作用下可释放光动力试剂二氢卟吩e6。
【IPC分类】A61P35/00, A61K47/48, A61K41/00
【公开号】CN105106955
【申请号】CN201510378051
【发明人】沈星灿, 蒋邦平, 胡兰芳, 董配, 施祖进
【申请人】广西师范大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年6月30日