0. 5mL)对其进行激光 照射（980nm，0. 72W/cm2) 600s后水溶液温度趋于平稳，撤去激光器使其自然冷却至室温，期 间每30s对温度进行记录，根据文献（Nanoscale, 2014, 6, 3274)提供的公式对光热转换效 率进行计算，结果发现硫化铜蛋白纳米复合物和硒化铜蛋白纳米复合物的光热转换效率分 别为50%和48%，远高于文献报道，表明我们制备出高光热转换效率的铜基蛋白纳米复合 物。
[0062] 实施例九：
[0063] 参照实施例一制备出来的硫化铜蛋白纳米复合物和硒化铜蛋白纳米复合物，对其 体外光照稳定性进行考察，取0. lmmol/L的硫化铜和硒化铜蛋白纳米复合物，分别放置于7 个 2mL 的 EP 管中，对这 7 个样品进行 980nm(0. 72W/cm2)照射 0, 0. 5, 1. 0, 2. 0, 4. 0, 8. 0 和 15. Omin，对其紫外吸收的变化进行扫描。铜基蛋白纳米复合物在不同时间的光照下其紫外 吸收均未发生明显的变化，具有明显的光稳定特性，为后期的光热治疗奠定基础。
[0064] 实施例十：
[0065] 参照实施例一制备出来的硫化铜蛋白纳米复合物和硒化铜蛋白纳米复合物，对细 胞毒性进行考察。取对数生长期的4T1细胞铺96孔板，接种密度为6X103/mL，每孔100y1， 放入细胞培养箱恒温培养12小时，确定细胞贴壁后，倒掉培养液，用PBS洗1-2次，加入用 培养基配好的铜基白蛋白溶液，每孔100y1，以铜元素浓度给药，浓度梯度为〇. 02、0. 05、 0. 1、0. 2、0. 5mmol/L，每个浓度4个复孔。放入培养箱培养24小时后，更换培养液，光照组每 孔分别在1. 5W/cm2条件下，光照3分钟，放回培养箱中继续培养24小时，加10y1 5mg/mL 的MTT的PBS溶液，4小时后弃去培养液，加入200y1的DMS0,振荡10分钟，酶标仪490nm 处测定吸光度值。在光照条件下，铜基蛋白纳米复合物可对细胞产生有效的杀伤作用，其 ic50分另IJ为 20yM和 35yM〇
[0066] 实施例 ^^一 ：
[0067] 参照实施例一制备出来的硫化铜蛋白纳米复合物和硒化铜蛋白纳米复合物，对体 内组织分布考察：步骤如下：
[0068] (1)肿瘤模型的建立：培养4T1肿瘤细胞，将其消化制备成1X107个/mL细胞混悬 液，保证细胞分散均勾，在小鼠腹部第二对乳头上侧种瘤，每只小鼠皮下注射100 y 1，每天 观察肿瘤体积大小。肿瘤体积公式：肿瘤体积=(长X宽2)/2。
[0069] (2)尾静脉注射两种铜基蛋白纳米复合物（30.0 mmol/kg)至荷瘤小鼠体内，在注 射后24h取出小鼠的心，肝，脾，肺，肾和肿瘤，匀衆，并用2mL的硝酸对组织进行硝解，待组 织硝解完全之后取出100 y L稀释至10.0 mL过膜之后用ICP-AES对各组织中的铜元素进行 定量。ICP定量结果可知，在24h后两种蛋白纳米复合物只要在肿瘤部位富集，为后期的光 热治疗提供了指引。
[0070] 实施例十二：
[0071] 参照实施例一制备出来的硫化铜蛋白纳米复合物和硒化铜蛋白纳米复合物，对 体内抑瘤效果考察。采用实施例十一中步骤（1)建立肿瘤模型的方法构建小白鼠荷瘤 模型，待肿瘤体积至60mm 3时，按照以下设计给药：铜基蛋白纳米复合物单剂量注射浓度 30.0 mmol/kg，生理盐水组，分别光照和非光照组，共6组，每组5只，第0天给药，第2天进 行激光治疗（980nm，0. 72W/cm2,5分钟）。分别在第0、2、4、6、8、10、12、14天测量小鼠的体 重和肿瘤体积。注射生理盐水组，光热以及未光照条件下均对肿瘤的生长无影响，说明单独 光照不能对肿瘤产生抑制效果。而注射高剂量铜基蛋白纳米复合物未光照条件下发现未能 影响肿瘤的生长，说明单独的铜基蛋白纳米复合物不能抑制肿瘤的生长，而注射高剂量铜 基蛋白纳米复合物光照后肿瘤部位能迅速产生热损伤效果，且在观察时间内未出现复发现 象。
[0072] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技 术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和 变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物，其特征在于：包括硫化铜 蛋白纳米复合物和硒化铜蛋白纳米复合物，所述复合物均以蛋白为骨架，包裹硫化铜和硒 化铜纳米复合物的铜基纳米结构，所述复合物的直径为5~30nm。2. 根据权利要求1具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物，其特征在于： 所述蛋白为人血清白蛋白，所述铜基纳米结构的铜源是乙酸铜、硝酸铜。3. 根据权利要求1具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物，其特征在于： 所述复合物中铜元素含量为〇. 01-0. 5mmol/L。4. 一种具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物的制备方法，其特征在于： 包括以下步骤： (1) 配置浓度为10~lOOmg/mL的蛋白溶液和浓度为1~50mmol/L的铜源溶液，将蛋 白溶液和铜源溶液按体积比5:1混合，搅拌均匀，得到混合溶液； (2) 用PH调节溶液调节步骤（1)中的混合溶液的PH值至8. 0~13. 0 ; (3) 往混合溶液中加入硫源或硒源溶液进行反应，混合溶液中铜元素与硫或者硒元素 之间的比值为1:2~1:8 ;反应温度为37°C~55°C，反应时间为2~12h，水浴搅拌至反应 结束； (4) 取出反应后的溶液，用5000~100000截留分子量透析袋透析24-48h，得到透析后 的纳米复合物； (5) 使用截留分子量为10-200kD的超滤管对透析后的纳米复合物进行超滤纯化，得到 铜基蛋白纳米复合物。5. 根据权利要求4具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物的制备方法，其 特征在于：步骤（2)中的PH调节溶液为2mol/L的NaOH溶液。6. 根据权利要求4具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物的制备方法，其 特征在于：步骤⑶中的硫源是Na2S ? 9H20,硒源是K2SeO3，所述硫源和硒源溶液的浓度为 0?lmol/L 〇7. 根据权利要求4具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物的制备方法，其 特征在于：步骤（5)中透析以去离子水为接受介质，透析液更换次数为6-8次。8. 根据权利要求4具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物的制备方法，其 特征在于：步骤（5)中超滤转速为2000~5000r/min，超滤次数至少10次。9. 根据权利要求1所述的具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物作为肿 瘤靶向光热治疗药物的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物及其制备方法和应用，通过控制蛋白浓度、铜盐浓度、反应溶液pH、反应时间和反应温度，诱导无机铜基纳米复合物的生长，合成出以人血白蛋白为骨架、包裹硫化铜或硒化铜纳米复合物的铜基纳米结构，该具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物具有分散性好、光稳定性好、光热转换效率高以及体内肿瘤靶向性良好等特性，可用于光热治疗，实现肿瘤高效热消除。
【IPC分类】A61K47/42, A61P35/00, A61K33/34, A61K9/14, A61K41/00
【公开号】CN105106958
【申请号】CN201510566206
【发明人】陈华兵, 杨涛, 邓益斌, 汪勇, 柯亨特, 郭正清, 何慧, 杨红, 邹烨璘, 计双双, 汪巧莉
【申请人】苏州大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月8日