005mg/ml 至5. 0mg/ml)在无血清细胞培养基中进行处理。对照组为无血清细胞培养基。然后，在药 物处理后12小时，使用CCK测定确定细胞毒性。
[0073] 结果，当柳氮磺吡啶的浓度升高至5mg/ml (0. 5%，w/v)时，柳氮磺吡啶透明质酸 复合物滴眼剂显示出70%或更高的细胞生存力（图2)。
[0074] 实施例3.柳氮磺吡啶-诱明质酸复合物滴眼剂减轻角腊结腊炎的效果
[0075]使用大鼠（) (Sprague Dawley，300g，雄性）作为动物，并使用由于使用 NaOH而由化学药物引起的角膜损伤模型（碱烧伤）。将3mm的纸盘浸于0.1 N NaOH溶液 (50ul)中，然后将角膜用纸盘覆盖30秒以引起角膜被损伤。角膜中的炎症反应通过对 F4/80抗原进行苏木精伊红染色和免疫染色来确定。对角膜水肿的分析使用角膜上皮和角 膜基质的比值来进行。
[0076] 在对角膜造成损伤后，分别每日两次地施用实施例1中制备的经增溶柳氮磺吡啶 和柳氮磺吡啶-透明质酸滴眼剂。向对照组施用〇. 1 %透明质酸。
[0077] 在对角膜造成损伤后3天，取出眼球并制备石蜡块以制作组织切片，对作为巨噬 细胞标志物的F4/80抗原进行苏木精伊红染色和免疫染色。结果，在对照组中观察到角膜 水肿并且炎性细胞穿透进入角膜中。在施用柳氮磺吡啶-透明质酸复合物滴眼剂的组中， 水肿和炎性细胞的数目有所降低。此外，与相同浓度的不与透明质酸混合的柳氮磺吡啶溶 液剂相比，柳氮磺吡啶-透明质酸复合物滴眼剂在减轻炎症和水肿方面更有效（图3)。 [0078] 定量结果显示正常角膜上皮与基质的比值为4. 6±1，并且在引起角膜炎症后 升高至10±2. 5。在施用柳氮磺吡啶-透明质酸复合物滴眼剂的实验组的情况下，施用 0. 05mg/ml柳氮磺吡啶-透明质酸复合物滴眼剂（0. 005% )的组为7. 6± 1. 8,注射0.1 mg/ ml (0.01 % )的组为5. 6± 1.4,因此，确定角膜水肿得以减轻。另外，施用0. lmg/ml柳氮磺 吡啶溶液剂（0. 01% )的实验组为7. 1±2. 1。结果，与相同浓度的不与透明质酸混合的柳 氮磺吡啶溶液剂相比，柳氮磺吡啶-透明质酸复合物滴眼剂在减轻角膜水肿方面具有更优 异的效果（图4)。
[0079] 针对角膜中存在的巨噬细胞（F4/80阳性细胞）的数目来进行对炎性细胞的分 析。结果，在引起角膜炎症后，巨噬细胞的数目为31.5±4. 9。在施用不含0. lmg/ml透 明质酸（0.01% )之柳氮磺吡啶溶液剂的组中，巨噬细胞的数目为21. 3±5. 5,并且在施 用0. lmg/ml柳氮磺吡啶-透明质酸复合物滴眼剂（0. 01 % )的组中，巨噬细胞的数目为 16. 2±3. 3(图 5)。
[0080] 实施例4.柳氮磺吡啶-诱明质酸复合物滴眼剂减轻干燥件角腊结腊炎的炎症的 效果
[0081] 至于对干燥性角膜结膜炎的测试，制备患有干眼的动物模型，并使用大鼠（Sd大 鼠）作为动物。通过每日两次地施用含有1 %硫酸阿托品和〇. 1 %苯扎氯胺的洗眼水，持续 2周来进行干燥性角膜结膜炎的诱发。
[0082] 从施用1 %硫酸阿托品和0. 1 %苯扎氯胺后1周开始，每日两次地以洗眼水方式施 用柳氮磺吡啶-透明质酸复合物（〇. lmg/ml)，持续1周。使用0. 1%透明质酸和0. 05 %环 孢素滴眼剂作为比较药物。
[0083] 通过用2%荧光素溶液染色角膜上皮的损伤部分来进行对患有干燥性角膜结膜炎 之动物模型中角膜上皮的损伤的确定（图6)。角膜的炎症通过对角膜进行冷冻切片并用苏 木精和伊红染色角膜来确定（图8)。
[0084] 在引起干燥性角膜结膜炎（干眼）的角膜中，通过用荧光素染色角膜上皮细胞来 确定由干眼引起的对角膜上皮的损伤（图6)。正常的角膜上皮细胞不被荧光素染料染色， 而只有损伤部分或不存在角膜上皮的角膜部分被染色（染成黄色的区域）。在用荧光素染 料染色后，将染色区域与整个角膜区域的比值以百分比（％)表示。对照组（非药物处理 组）中的大部分角膜表面被染色，并且染色区域与整个角膜区域的比值为76±6. 5%。使用 透明质酸（〇. 1%)的组为54±7. 4%，并且使用环孢素（0.05%)的组为29±4. 2%。使用 柳氮磺吡啶-透明质酸复合物（0.01%)的组为37±5.7%，并由此观察到角膜表面上的荧 光染色显著降低（图6和图7)。因此，观察到柳氮磺吡啶-透明质酸复合物（0.01%)有 效地减轻对角膜上皮细胞的损伤并保护角膜上皮细胞。
[0085] 作为用于确定具有干燥性角膜结膜炎（干眼）之角膜中炎性细胞的苏木精-伊红 染色的结果，在干眼的角膜中观察到多核的球形多核细胞（图8)。在干燥性角膜结膜炎模 型中，将抑制炎性细胞进行角膜穿透的效果表示为各个实验组与对照组（非药物处理组） 的比值。炎症减轻效果在透明质酸组（〇. 1% )中为〇. 76±0. 1，在环孢素（0. 05% )组中为 0. 35±0. 07,在柳氮磺吡啶-透明质酸复合物（0. 01% )组中为0. 48±0. 09(图9)。作为 动物测试的结果，经确定，柳氮磺吡啶-透明质酸复合物（0.01% )有效地抑制干燥性角膜 结膜炎的炎症。
[0086] 这些实施例的结果表明：柳氮磺吡啶-透明质酸复合物滴眼剂有效地减轻角膜炎 症，并且比单独施用柳氮磺吡啶更有效。
[0087] 根据该结果，本发明的柳氮磺吡啶-透明质酸复合物滴眼剂可有效地用于治疗眼 球（特别是前段或外段）的炎症。
【主权项】
1. 用于治疗眼部炎性疾病的滴眼剂组合物，所述组合物包含： 亲水性柳氮磺吡啶；和 透明质酸。2. 权利要求1所述的组合物，其中所述亲水性柳氮磺吡啶包含聚乙二醇化柳氮磺吡 啶。3. 权利要求1所述的组合物，其中所述亲水性柳氮磺P比啶的浓度为0. 005% (w/v)至 0. 1 % (w/v) 〇4. 权利要求1所述的组合物，其中所述透明质酸的浓度为0.01% (w/v)至0.5% (w/ v) 〇5. 权利要求1所述的组合物，其还包含含溶液载体。6. 权利要求5所述的组合物，其中所述含溶液载体是选自蒸馏水、磷酸盐缓冲溶液、平 衡盐溶液和盐水溶液中的一种或更多种可药用载体。7. 权利要求1所述的组合物，其还包含选自盐酸、氯化钠和氯化钾中的一种或更多种 可药用盐。8. 权利要求1所述的组合物，其中所述眼部炎性疾病包括前段和外段的炎性疾病。9. 权利要求8所述的组合物，其中所述眼部炎性疾病包括角膜炎、结膜炎、角膜结膜 炎、干眼综合征、睑缘炎、巩膜炎、巩膜外层炎、虹膜炎、虹膜睫状体炎、葡萄膜炎或术后炎 症。10. 权利要求8所述的组合物，其中所述眼部炎性疾病包括：干眼相关炎性疾病，其包 括干燥性角膜结膜炎或与其相关的眼部炎症、由缺乏眼泪引起的眼部炎症或与干眼综合征 相关的角膜结膜炎上皮损伤；非感染性角膜结膜炎，其包括由外部损伤产生的角膜结膜炎、 变应性角膜结膜炎、具有充血伴随水肿和血管病的急性或慢性非感染性角膜结膜炎、前段 的非感染性炎性疾病或眼手术后角膜结膜炎；或者感染性角膜结膜炎，其包括病毒性角膜 结膜炎、细菌性角膜结膜炎、真菌性角膜结膜炎、衣原体性角膜结膜炎、立克次体性角膜结 膜炎或寄生物性角膜结膜炎。11. 权利要求1所述的用于治疗眼部炎性疾病的滴眼剂组合物的制备方法，所述方法 包括： (a) 使柳氮磺吡啶亲水化的步骤；以及 (b) 向亲水化柳氮磺吡啶中添加透明质酸并使透明质酸与所述亲水化柳氮磺吡啶混合 的步骤。12. 权利要求11所述的制备方法，其中步骤（a)包括使所述柳氮磺吡啶聚乙二醇化的 步骤。13. 权利要求12所述的制备方法，其中所述使柳氮磺吡啶聚乙二醇化的步骤包括将所 述柳氮磺吡啶添加至含有聚乙二醇的平衡盐溶液中的步骤。14. 权利要求11所述的制备方法，其中步骤（a)包括将所述亲水化柳氮磺吡啶的浓度 调整至0.005% (w/v)至0.1 % (w/v)的步骤。15. 权利要求11所述的制备方法，其中步骤（b)包括将透明质酸的浓度调整至0. 01 % (w/v)至 0.5% (w/v)的步骤。16. 治疗眼部炎性疾病的方法，所述方法包括：
【专利摘要】本发明涉及用于治疗眼部炎性疾病的包含亲水性柳氮磺吡啶和透明质酸的组合物及其制备方法。此外，本发明还涉及用于治疗眼部炎性疾病的方法，其包括用于向个体施用治疗有效量的亲水性柳氮磺吡啶和透明质酸的步骤。
【IPC分类】A61P27/02, A61K31/728, A61K31/655, A61K47/36, A61P27/12, A61K47/48
【公开号】CN105142670
【申请号】CN201480021005
【发明人】朱天基, 崔俊燮
【申请人】加图立大学校产学协力团
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2014年3月6日
【公告号】WO2014142469A2, WO2014142469A3