烈振荡20min，离屯、后除去中间层的变性蛋白质，重复数次至中间层无 蛋白质析出为止，然后析出下层多糖溶液，置于透析袋中，透析72h，不断换水，W除去低聚 糖等小分子杂质，然后进行浓缩，最终冷冻干燥为多糖粉末。
[0062]多糖经过去蛋白、除杂后，用d地20将鳄鱼血多糖配制成多糖溶液，使用分离纯化 系统（AKTA系统）过Se地adexG-200葡聚糖凝胶柱进行进一步分离，上样前用d地2〇首先 平衡柱子，经上样针上样后系统自动使用d地2〇进行多糖的洗脱，系统根据分子量大小不同 在不同的洗脱体积处出峰，收集出峰位置相应洗脱管中的多糖溶液，并合并统一峰型下的 多糖。
[0063] 如图1所示，鳄鱼血多糖的粗提取物经过Se地adexG-200分子筛分离纯化后分 别在5. 6、11. 4、17. 3洗脱体积处出现最高峰，从而分离得到=种不同分子量大小的多糖组 分，分别记为：ABPSI、ABPSII、ABPSIII。
[0064] 实施例2鳄鱼血多糖的不同组分对人乳腺癌细胞增殖的影响 阳0化]实验方法为MTT比色法：检测原理为活细胞线粒体中的班巧酸脱氨酶能使外源性M1T还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲琐（Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。 二甲基亚讽值MS0)能溶解细胞中的甲琐，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收 值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，甲琐结晶形成的量与细胞数成正比。该 方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验 W及肿瘤放射敏感性测定等。
[0066] 方法步骤如下：
[0067] (1)细胞复苏及培养
[0068] 将冻存的人乳腺癌细胞从液氮中取出，立即投入37°C水浴锅中使细胞融化。生物 安全柜中将细胞悬液吸到装有适量培养基的离屯、管中，800rpm/min离屯、5分钟；弃上清液， 用ImL培养基悬浮细胞，吸到装有适量培养基的细胞培养皿中，将细胞置于37°C、5%C〇2、 饱和湿度的条件下培养。待细胞达到80% -90%接触汇合时进行传代，0. 2%膜酶消化成单 细胞悬液，800巧m/min离屯、5分钟；弃上清，加l-2mL培养基悬浮细胞，将细胞传到2-3个 装有适量培养基的培养皿中，继续培养。 W例 似MTT法测定药物对细胞生长的抑制作用
[0070] 将处于对数生长期的贴壁细胞经膜蛋白酶消化后，分散成单个细胞，并使其悬浮 在相应细胞培养基中。将细胞接种于96孔培养板上，每孔lOOiiL细胞悬液，3000cells/ 孔。将上述96孔培养板置于37°C，二氧化碳巧％ )培养箱中过夜培养24小时，使细胞贴 壁。
[0071] 待24小时后细胞完全贴壁后，弃去培养液，试验组分别加入含有不同浓度的 ABPSI、ABPSII、ABPSIII的细胞培养液，并设置不加药物只加相应药物溶剂的对照孔（鳄鱼 血多糖溶剂为d地2〇)，同时设置只加培养基不含细胞的调零孔。每组设6个平行孔，然后将 96孔板置于37°C，二氧化碳巧％ )培养箱中培养48小时。 阳07引 48小时后，每孔加入25yLMTT(浓度为5mg/血)，继续解育地。然后将培养液轻 轻吸出，每孔加入150yLDMS0作溶剂溶解，溶解后用酶标仪测定570nm处的吸光度。 阳〇7引 做数据分析 阳074] 计算细胞的存活率和抑制率，并计算药物对细胞的半数抑制浓度IC50。存活率％ =(实验组0D值-调零孔0D值）/ (阴性模型组0D值-调零孔0D值）X100% ;抑制率％ =(1-存活率）X100%。用GraphpadPrism5软件进行IC50值的计算；测定结果见表1。 [00巧]表1鳄鱼血多糖不同组分对乳腺癌细胞的抑制作用（IC50值）
[0076]
[0077]从表1中可W看出，在低浓度时鳄鱼血多糖即对人乳腺癌细胞有明显的抑制增殖 的作用。
[007引如图2-4所示，为实施例2中检测的不同浓度不同组分的鳄鱼血多糖药物对多种 不同的人乳腺癌细胞的生长的抑制作用曲线图，从图中可W得出浓度与对人乳腺癌细胞的 生长在低浓度时即呈现明显的抑制作用，随着鳄鱼血多糖浓度的增大，对人乳腺癌细胞的 抑制作用逐渐增强，且呈现明显的浓度依赖性。
[00巧]实施例3鳄鱼血多糖的不同组分对人乳腺癌细胞迁移的影响
[0080] 方法步骤如下：
[0081] (1)细胞复苏及培养
[0082] 将冻存的人乳腺癌细胞从液氮中取出，立即投入37°C水浴锅中使细胞融化。生物 安全柜中将细胞悬液吸到装有适量培养基的离屯、管中，800rpm/min离屯、5分钟；弃上清液， 用ImL培养基悬浮细胞，吸到装有适量培养基的细胞培养皿中，将细胞置于37°C、5%C〇2、 饱和湿度的条件下培养。待细胞达到80% -90%接触汇合时进行传代，0. 2%膜酶消化成单 细胞悬液，800巧m/min离屯、5分钟；弃上清，加l-2mL培养基悬浮细胞，将细胞传到2-3个 装有适量培养基的培养皿中，继续培养。 阳〇8引 似细胞铺板
[0084]先用marker笔和直尺在24孔板的板底，均匀得划横线，横穿过孔，每孔两条横 线，间距0. 2-0. 5cm。将处于对数生长期的贴壁细胞经膜蛋白酶消化后，分散成单个细胞， 并使其悬浮在相应细胞培养基中。将细胞接种于24孔培养板上，每孔500yL细胞悬液， 500000cells/孔。将上述24孔培养板置于37°C，二氧化碳巧％)培养箱中过夜培养24小 时，使细胞贴壁。
[00化]待24小时细胞完全贴壁长满后，用20yL枪头垂至于板底的横线划痕，枪头要垂 直，不能倾斜。PBS清洗3次后，试验组分别加入含有不同浓度的ABPSI、ABPSII、ABPSIII 的细胞无血清培养基，空白对照组加入同等体积的无血清培养基。分别在化，2地，4化时于 倒置巧光显微镜下观察并拍照记录。
[0086] 做数据分析
[0087] 用GraphpadPrism5软件进行迁移抑制率的计算。
[0088] 如图5-13所示（图5-13中的图像均为Y迁移率-X时间曲线，分别表示0、1、 2ymolS个不同浓度的用药量及用药时间对迁移率的影响），展示了S种鳄鱼血多糖对S 种不同的人乳腺癌细胞迁移运动的抑制作用，图示中显示作用4化后=种鳄鱼血多糖均有 不同程度的抑制乳腺癌细胞迁移的作用。
[0089] 其中，如图5-7所示，为S种鳄鱼血多糖成分对MDA-MB-231细胞迁移抑制作用的 迁移抑制率，可w从图中看出，多糖成分浓度越高，对癌症细胞的抑制迁移作用越明显。
[0090] 如图8-10所示，S种鳄鱼血多糖成分对MCF-7细胞迁移抑制作用的迁移抑制率， 可W从图中看出，多糖成分浓度越高，对癌症细胞的抑制迁移作用越明显。
[0091] 如图11-13所示，S种鳄鱼血多糖成分对SUM159细胞迁移抑制作用的迁移抑制 率，可W从图中看出，多糖成分浓度越高，对癌症细胞的抑制迁移作用越明显。
[0092] W上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用W限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 鳄鱼血多糖在制备乳腺癌治疗药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用是在制备抑制乳腺癌生长或转 移的治疗药物中的应用。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述鳄鱼血多糖为从鳄鱼血血粉中分离 纯化后所得的含至少一种多糖组分的混合物。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述鳄鱼血多糖包含1~3种多糖组分。5. 根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于：治疗乳腺癌的所述药物包含鳄 鱼血多糖和药学上可接受的酸、碱、盐、水合物或酯及其他辅料。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物可制备成片剂、胶囊、口服液体 制剂、乳液和注射液中的至少一种。
【专利摘要】本发明为鳄鱼血多糖在乳腺癌治疗中的应用，所述鳄鱼血多糖为首次从鳄鱼血血粉中提纯的多糖成分，同时所述鳄鱼血多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等都有着密切的关系，具有抗病毒、抗肿瘤与免疫调节作用；同时，所述鳄鱼血多糖成分在药学上可与酸、碱、盐、水合物或酯；以及其他辅料结合制备成片剂、胶囊、口服液体制剂、乳液、注射液或它们的组合，作为治疗癌症或肿瘤药物使用，具有明显提高抗肿瘤功能，并有效地控制肿瘤细胞的生长，更加有利于抗肿瘤活性的研究。
【IPC分类】A61P35/00, A61K35/58
【公开号】CN105147732
【申请号】CN201510702642
【发明人】欧阳俊
【申请人】北京百生康生物科技有限公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年10月26日