中 在第一滴后5分钟给予第二滴。在第二次处理后几分钟，用30G针头对右眼前房进行插管， 所述针头在关闭的旋塞后，连接到无菌汉克斯（Hanks)平衡盐溶液的升高的胆存器上，其 中液面比视平线高59英寸（相当于IlOmmHg的静水压力）。在第二次处理后五分钟（施 用局部麻醉剂后15分钟），打开旋塞，并且通过球的膨胀可W直接目测到压力的上升。从 所述研究中排除遭受虹膜或角膜损伤的动物（超出单一进入点）。在诱导压力上升后六分 钟，通过关闭旋塞和移除插管来终止缺血性损伤。用兽用组织粘合剂来密封进针伤口并且 允许动物从麻醉中恢复，之后再返回笼子。
[0217] 在缺血性损伤后屯天，通过C〇2吸入将动物处死并且在近端视神经完好无损的情 况下解剖眼球。移除前房，并将眼睛在4%多聚甲醒/PBS中固定30分钟，随后在30%薦糖 中解育过夜。将经过固定的眼睛剪去另外的结缔组织并且沿着矢状平面切割W产生用于 包埋的平面，并且用组织粘合剂将暴露的视网膜边缘附接到巩膜上。将眼睛用强度增加的 JB-4包埋介质（乙二醇甲基丙締酸醋；GMA)浸透，随后在4°C下包埋于JB-4中用于矢状切 片。将视神经与它们成对的视网膜共同包埋用于横向切片。穿过或接近视神经头W2ym 的厚度将经过包埋的组织切片，并且收集在载玻片上用于进一步分析。
[0218] 对于视网膜的组织学分析，将切片用1 %甲苯胺蓝在无水乙醇中染色40秒，并且 盖上盖玻片用于显微镜检查。使用cellSensDimension软件在具有载物台的OlympusBX61 直立显微镜上，使用20X物镜和169nm/像素的分辨率来捕捉图像，并且使用所述软件的多 图像对准程序将图像拼合在一起。从整个视网膜上随机选择五个位置，避开极度弯曲或极 度组织学破裂的区域，并且如下评估视网膜层的厚度：神经节细胞（G化；接近视网膜表面 处于选定位置的中屯、的100ym区域中的层中的大的圆形细胞核的计数），内网层（IPL;从 神经节细胞层的细胞核到内核层细胞核的距离），内核层（I化)，外网层（0PL;从I化的细 胞核到外核层细胞核的距离），外核层（ONL)，W及总视网膜厚度（TR;从神经纤维层上方的 视网膜表面到边缘的距离）。由于由死后人工视网膜剥离造成的可能损伤，所W超出 的光感受器外部片段不被包括在测量之中。将缺血性眼睛的距离和计数归一化为初试 对侧眼的平均值并且通过学生t-检验进行比较。
[0219] 如上用甲苯胺蓝对视神经染色，并且在56nm/像素的分辨率下用60x油镜成像，并 且使用所述软件的多图像对准能力将图像拼合在一起。五个区域（各IOOym2)选自未定 向的视神经-在任意四个象限中的每个的一个区域加上一个居中定位区-并且对通过甲苯 胺蓝染成粉红色的视神经进行计数。考虑到包埋过程中的可能的倾斜，横跨垂直轴线（最 长和最短）测量视神经切片，并且密度按比例缩放，W假定沿着短轴的圆。通过使用按比例 缩放的密度和由短轴预测的圆形面积来评估视神经总数，其数值相当于使用未按比例缩放 的密度和由两个轴线定义的楠圆的面积。 阳220] 结果 阳221] 实例的结果在图2至图4中示出，如W下进一步描述。 阳222] 在图2中，通过组织学分析评估来自经受一段时间的高IOP(对视网膜的缺血伤 害）的眼睛的视网膜层的厚度。比较经受高IOP的眼睛与来自同一动物的健康对侧眼的相 同视网膜层之间的相同视网膜层的厚度，所述对侧眼未接受高IOP的缺血伤害。视网膜变 薄的程度在经受高IOP的眼睛的内视网膜（包括其中存在视网膜神经节细胞的Ga,W及 IPL)中更显著，并且通过使用漠莫尼定或化合物A的治疗阻止了运种变薄。
[0223] 类似地在图3中，相对于媒介物，由化合物A提供的保护百分比较大，并且略大于 漠莫尼定的效果。在图4中，与由漠莫尼定保护的约80%的RGC相比，100%的经受缺血伤 害的RGC得到化合物A的保护。
[0224] 所述结果表明化合物A对视网膜神经节细胞具有保护性。 阳扣引实例2-化合物合成
[0226] 2'，3'-异亚丙基-N6-环己基腺巧：将6-氯腺巧化58g)与环己胺巧g)在乙醇 (20ml)中的溶液回流加热6小时，然后冷却至室溫。使反应混合物在真空中浓缩并且用水 巧Oml)和乙酸乙醋（300ml)稀释所得残余物。将有机层分离并且用乙酸乙醋（2X50ml) 萃取水层。用水（IX30ml)洗涂合并的有机层，在硫酸钢上干燥，在真空中浓缩并且在真空 下干燥，得到呈白色固体的N6-环己基腺巧（2. 600g)。用丙酬（30ml)稀释N6-环己基腺巧 (2.6g)，并且向所得的溶液加入2, 2-二甲氧基丙烷（12ml)，然后是D-精脑横酸（3.01邑)， 并且允许混合物在室溫下揽拌18小时。使所述反应混合物在真空中浓缩并且用乙酸乙醋 (150ml)稀释所得的残余物，然后使用饱和Na肥〇3水溶液中和至抑8.0。分离有机层，在 硫酸钢上干燥，在真空中浓缩。在使用MeOH-CHzClz(4:96)作为洗脱液的硅胶柱上将所述 残余物纯化两次，得到2'，3'-异亚丙基-N6-环己基腺巧（3. 16g)。古NMR(CDCIs) : 5 1. 2 3-1. 47 (m, 9H)，1. 38 (S, 3H)，1. 64 (S, 3H)，1. 79-1. 81 (m, 1H)，2. 04-2. 06 (m, 1H)，3. 80 化J= 12Hz, 1H)，3. 96 化J= 12Hz, 1H)，4. 53 (S, 1H)，5. 09-5. 16 (m, 2H)，5. 80-5. 92 (m, 2H)，7. 79 ( S, 1H)，8. 24 (S, 1H)，8. 22-8. 38 (m, 1H)。 阳227] N6-环己基腺巧-5'-0-硝酸盐（化合物巧：在-25°C(CCI4-CO2浴用于冷却）下， 将乙酸酢化ml)缓慢加入揽拌的硝酸溶液（2g，63% )中，并且将反应溫度保持在-7. 5°C至〇°C下，再持续1小时。缓慢加入2' ,3'-异亚丙基-N6-环己基腺巧（1.Og)在乙酸酢 (3ml)中的溶液。允许所得反应物在0°C至-5°C下揽拌2小时，并且将所述混合物缓慢倒 入水性Na肥〇3(40ml)和乙酸乙醋（150血）的冰冷溶液中，并且允许它揽拌5分钟。分离 有机层，并且用水洗涂，在硫酸钢上干燥，并且在真空中浓缩。用TFA(ISmL)与水（4mL)的 混合物稀释残余物，并且允许混合物在室溫下揽拌30分钟。在真空中浓缩混合物，并且 将所得残余物用水（IOmL)稀释并且在真空中浓缩。用乙酸乙醋稀释所获得的残余物并 且用饱和碳酸氨钢水溶液洗涂，并且使有机层在硫酸钢上干燥并且在真空中浓缩。在使 用乙酸乙醋己烧（从40:60至20:80的梯度）的硅胶柱上纯化残余物，得到N6-环己基腺 巧-5' -0-硝酸盐（0. 150克）。电NMR值MSO-De) : 5 1.08-1. 13 (m, 1H), 1.27-1.41 (m，4H), 1. 57-1. 83 (m. 6H)，4. 12-4. 17 (m, 2H)，4. 30-4. 33 (m, 1H)，5. 48 (d,J= 5. 4Hz, 1H)，5. 60 (d,J =5. 7Hz,IH)，5. 90 (d,J= 4. 8Hz,IH)，7. 59 (d,J= 8.IHz,IH)，8. 16 (s,IH)，8. 29 (s,IH)。 阳扣引 N6-(外型-2-降冰片基）腺巧-5'-0-硝酸盐（化合物巧：2'，3'-异亚丙基-N6-外 型-降冰片基腺巧在2'，3'-异亚丙基-N6-环己基腺巧的程序之后制备并且用于后续反 应。在-25°C(CCI4-CO2浴用于冷却）下，将乙酸酢（6ml)缓慢地加入揽拌的硝酸溶液（2g， 63%)中，并且将反应溫度维持在-7. 5°C至0°C下，再持续1小时。缓慢加入2'，3'-异亚 丙基-N6-外型-降冰片基腺巧（1. 2g)在乙酸酢（3ml)中的溶液。允许混合物在(TC至-5°C 下揽拌40分钟，并且将所述混合物缓慢倒入水性NaHC〇3冰冷溶液（40ml)中。W二氯甲烧萃 取所述溶液。分离有机层，并且用盐水洗涂，在硫酸钢上干燥，并且在真空下浓缩。在使用乙 酸乙醋-己烧（1:1)的硅胶柱上纯化残余物，得到所希望的产物（〇.245g)W及起始化合物 (1.Og)。将硝基产物（〇.245g)在TFA(ISmL)与水巧血）的混合物中稀释，并且允许混合物 在室溫下揽拌30分钟。在真空下对它进行浓缩并且用水（IOmL)稀释，并且在真空中浓缩。 用乙酸乙醋稀释所得残余物，并且用饱和碳酸氨钢水溶液洗涂。使有机层在硫酸钢上干燥， 并且在真空中浓缩。将残余物从乙酸乙醋与己烧的混合物中再结晶，得到N6-外型-2-降 冰片基腺巧-5' -O-硝酸盐（0. 123 克）。古NMROMSO-De) : 5 1. 03-1. 21 (m，3H)，1. 40-1. 5 6(m, 3H)，1. 58-1. 64 (m. 4H)，3. 94 (bs, 1H)，4. 13-4. 17 (m, 1H)，4. 30 (bs, 1H)，4. 66-4. 87 (m, 3 H)，5. 49 (d,J= 5. 4Hz, 1H)，5. 62 (d,J= 5. 4Hz, 1H)，5. 91 (d,J= 4.8Hz, 1H)，7. 60 (d,J= 6.6Hz,IH)，8. 20 (s,IH)，8. 31 (s,IH)。 阳229] 2-氯-N6-环己基腺巧：将2,6-二氯腺巧（I.Og)与环己胺（0. 926g)在乙醇 (30ml)中的混合物回流加热6小时，然后冷却至室溫。在真空下浓缩所述混合物。在使 用MeOH-CH2Cl2(l:6至1:5)的硅胶柱上纯化残余物。使合并部分浓缩并且在真空下干 燥，得到呈白色固体的2-氯-N6-环己基腺巧（2. 600g)。古NMROMSO-De) :51. 12-1.2 1 (m, 2H)，1. 33-1. 43 (m, 3H)，1. 63-1.86(m,6H)，3. 57-3. 62 (m, 1H)，3. 66-3. 69 (m, 1H)，3. 97(d，J= 3Hz，lH)，4. 16(d，J= 3. 3Hz，lH)，4. 54(d，J= 5. 4Hz，lH)，5. 08-5. ，5. 24(d，J= 4. 8Hz，lH)，5. 51(d，J= 5. 7Hz，lH)，5. 85(d，J= 5. 7Hz，lH)，8. 26(d，J=8. 4Hz, 1H)，8. 41(s,IH)。
[0230] 2-氯-2'，3' -异亚丙基-N6-环己基腺巧：用丙酬（30ml)稀释2-氯-N6-环己 基腺巧（0. 5g)，并且向所述混合物中加入2, 2-二甲氧基丙烷（2. 04g)，随后是D-精脑横 酸（CSA，0.272g)。允许所得反应混合物在室溫下揽拌2小时。加入另外的CSA(0.2g)并 且揽拌2小时。将所述混合物在真空中浓缩并且用乙酸乙醋稀释所得残余物，然后使用 浓NaHC〇3水溶液中和至抑8.0。将所述有机层分离，在硫酸钢上干燥，在真空下浓缩，得 到 2-氯-2'，3'-异亚丙基-N6-环己基腺巧（0.378g)。古NMR(CDCIs):81.23-1. 30(m ，3H)，1. 36-1. 44 (m, 1田，1. 63(S,3H)，1. 68-1. 79 (m, 5H)，2. 04-2. 08 (m, 2H)，3. 81 化J= 5Hz, 1H), 3. 99化J= 12. 9Hz, 1H)，4. 51(s, 1H), 5. 11化J= 5. 7Hz, 1H), 5. 15-5. 18(m, 1H), 5. 75 化s,IH)，5. 78 (d,J= 4.甜z,IH)，5. 96 化s,IH)，7. 76 (s,IH)。 阳231] 2-氯-N6-环己基腺巧-5' -0-硫酸钢盐（化合物G):将2-氯-2'，3'-异亚丙 基-N6-环己基腺巧（0. 540g)溶解在DMF化ml)中并且将其缓慢加入=氧化硫（0. 302g)在DMF(3ml)中的溶液中。在室溫下将所述混合物揽拌过夜。在旋转蒸发器（ratavaporator) 上将它浓缩并且用水（8ml)稀释所述残余物。用化OH(0.IN)将所述水溶液缓慢中和至抑 7.0。在乙酸乙醋中萃取它并且然后将所述水层浓缩。将所获得的白色固体照原样用于下 一步。经保护的硫酸钢盐用TFA-水（16:4ml)的混合物处理，并且揽拌30分钟。将所述反 应混合物浓缩，并且将所述残余物从丙酬结晶，得到2-氯-N6-环己基腺巧-5'-0-硫酸钢 盐（0. 150邑）。古NMR值MSO-De) : 5 1. 10-1. 13(m, 1H), 1.25-1.41(m，4H)，1.57-1.83(m.6H), 3. 72-4. 08 (m, 4H)，4. 47 (s,IH)，5. 81 (s,IH)，8. 14 (d,J= 6.OHz,IH)，8. 43 (s,IH)。 阳23引 2-氯-N6-环己基腺巧-5' -O-硝酸盐（化合物H):在硝化W及TFA脱保护反应 后，由2-氯-2'，3' -异亚丙基-N6-环己基腺巧制备2-氯-N6-环己基腺巧-5' -0-硝酸 盐。电NMR(CDCIs) : 5 1.06-1. 42 (m，4H), 1.64-1. 88 (m，5H), 4.08 (bs, 1H), 4.21(S,1H), 4. 3 0 (d,J= 4. 2Hz,IH)，4. 41 (s,IH)，4. 83-4. 88 (m, 2H)，5. 57 (d,J= 5. 4Hz,IH)，5. 70 (d,J= 4. 5Hz,IH)，5. 90 (d,J= 5.IHz,IH)，8. 26 (d,J= 8. 7Hz,IH)，8. 38 (s,IH)。 阳扣引 合成化合物A 阳234] N6-环戊基腺巧（化合物I):将6-氯腺巧（43g)与环戊胺巧当量）在乙醇（50当 量）中的溶液回流加热3小时，然后冷却至室溫。将所得反应混合物在真空中浓缩并且用 水（400ml)和乙酸乙醋（400ml)稀释所得残余物。将有机层分离并且将水层萃取到乙酸乙 醋（2X400ml)中。用水（2X200ml)洗涂合并的有机层，在硫酸钢上干燥，在真空中浓缩并 且在真空下干燥，W得到固体，将所述固体悬浮在Me0H(400mL)中，过滤并且干燥，W得到 N6-环戊基腺巧（43.Sg)。
[02对 2'，3'-异亚丙基-N6-环戊基腺巧：用丙酬（75当量）稀释N6-环戊基腺巧（43g)， 并且向所得溶液中加入2, 2-二甲氧基丙烷巧当量），随后是D-精脑横酸（1当量），并且 允许所得反应物在室溫下揽拌3小时。使所得反应混合物在真空中浓缩并且用乙酸乙醋稀 释所得残余物，然后使用浓NaHC03水溶液中和至pH7. 0。将所述有机层分离，在硫酸钢上 干燥，在真空中浓缩并且在真空下干燥，W得到固体，将所述固体悬浮在己烧（250mL)中， 过滤，用己烧洗涂，并且在真空下干燥，W得到2' ,3'-异亚丙基-N6-环戊基腺巧（43g)。
[0236] 2'，3'-异亚丙基-N6-环戊基腺巧-5'-硝酸盐：在-10°C(乙腊-C〇2浴用于冷却） 下，经4小时的时间段将乙酸酢（22当量）缓慢加入经过揽拌的硝酸溶液巧当量，63% ) 中，并且在加入期间将反应溫度保持在-5°C至5°C下。将所得溶液冷却至-20°C，并且缓慢 加入2'，3' -异亚丙基-N6-环戊基腺巧（18. 250克，0.048mol)在乙酸酢（37血，8当量） 中的溶液。允许所得反应物在-15°C至-5°C下揽拌1小时，并且将所得反应混合物缓慢倒 入水性Na肥〇3(168克，在800血水中）与乙酸乙醋（350血）的冰冷溶液中，并且允许所得 溶液揽拌5分钟。将有机层分离并且使用乙酸乙醋（350mL)萃取所述水层。用水洗涂合并 的有机层，并且在硫酸钢上干燥，在真空中浓缩并且在使用70%乙酸乙醋-己烧作为洗脱 液的硅胶上使用快速柱层析进行纯化，W得到2'，3'-异亚丙基-N6-环戊基腺巧-5'-硝 酸盐（14. 9g)。
[0237] 化合物A:用TFA(20血）与水巧血）的混合物稀释2'，3'-异亚丙基-N6-环戊基 腺巧-5'-硝酸盐（4.Sg)，并且允许所得反应物在室溫下揽拌30分钟。将所得反应混合 物在真空中浓缩并且用水（IOml)稀释所得残余物，然后在真空中浓缩。用乙酸乙醋稀释 所得残余物并且用饱和碳酸氨钢水溶液洗涂，并且使所述有机层在硫酸钢上干燥，并且在 真空中浓缩，W得到白色固体残余物，将所述残余物在真空下干燥，然后从冷乙醇再结晶， W得到化合物A(3. 1 克）。Ih-NMR值MSO-de) : 5 1. 49-1. 58 (m, 4H)，1. 66-1. 72 (m, 2H)，1. 89 -1. 94 (m, 2H)，4. 12-4. 17 (m, 1H)，4. 28-4. 33 (m, 1H)，4. 48 (bs, 1H)，4. 65-4. 87 (m, 3H)，5. 5(d ，J= 5.IHz, 1H)，5. 63 化J= 5. 7Hz, 1H)，5. 91 化J= 5.IHz, 1H)，7, 75 化J= 7.甜Z, 1H) ，8. 17 (bs, 1H)，8. 30 (S, 1H);MS(ES+) :m/z381. 35 (M+1) ;Ci品。啡〇6的分析计算值：C, 47. 37 ;H, 5. 30 ;N, 22. 10 ;实验值：C, 47. 49 ;H, 5. 12,N, 21. 96。 阳扣引合成化合物B 阳239] 2-氯-N6-环戊基腺巧-用乙醇巧O当量）稀释2'，3'，5' -S乙酷氧基-2,6-二 氯腺巧（1. 5g)和环戊胺（8当量），并且将所得溶液回流加热约15小时，然后冷却至室溫 并且在真空中浓缩，W得到粗制残余物，将所述残余物用乙酸乙醋与水的混合物稀释并且 转移至分液漏斗。使所述有机层分离，在硫酸钢上干燥并且在真空中浓缩，W得到粗制残余 物，将所述残余物在硅胶（8%MeOH-二氯甲烧作为洗脱液）上使用快速柱层析纯化，W得到 2-氯-妒-环戊基腺巧（0. 948g)。MSm/z370. 32[M+田 \
[0240] 2'，3' -异亚丙基-2-氯-N6-环戊基腺巧：用丙酬（15血）稀释2-氯-N6-环戊