计）。ECw为测量到 50%的最大活性时的（即在电流强度I的平均最大增加）时，有效浓度。
[0136]表1
[0137]
[013引在图I中，绘制了依赖于浓度的环状蛋白SEQID I至SEQID 7的活性。最大活 性W100 %表示。
[0139] 显示于表1和图1中的研究表明具有氨基酸序列SEQIDNO: 1至SEQIDNO: 6的环 肤在生物学上是有活性的，然而结构上显示出一定相似性的具有氨基酸序列SEQIDN0:7 的环肤是没有活性的。
[0140] 实施例3
[0141] 冻干物的制备
[0142] 对式I的环肤的稳定存储形式进行工业范围的开发。由此，将SEQIDNO: 1至SEQ IDN0:6的环肤，W及如沈QIDN0:7的环肤W0.Img/ml至lOOmg/ml的量溶解于纯水中， 并经由具有0. 2 ym的孔尺寸的过滤器过滤除去浊度、污染物和可能菌性（UnslcriiiUik'n).
[0143] 过滤后，将溶于纯水的环肤分装到玻璃或塑料的安飯中，并且W冷冻干燥（冻干） 的方式将其转变成稳定的粉末。
[0144] 因此获得了表2中所描述的冻干参数和图3中所描述的冻干周期。
[0145]表 2
[0147] 作为冷冻干燥的结果，得到具有氨基酸序列SEQIDNO: 1至SEQIDNO:6的环肤 的各个白色粉末。
[014引实施例4
[0149] 在室溫和冰箱中储存后对实施例2的冻干物的稳定性研究
[0150] 在工业规模上对氨基酸序列SEQIDNO: 1至SEQIDNO:6的环肤的冻干物的稳定 性进行研究。由此，将冻干物在2至8°C下储存长达24个月并且在25°CW及60%相对湿度 下储存长达6个月。稳定性在次期间的不同时间点被调查。特别地，对环肤的外观、含量W 及纯度进行了研究。对此采用了验室常用的分析程序，例如目测检查和反相HPLC。
[0151] 此外，在2至8°C储存24个月后，利用通过膜片错实验对生物活性进行测定。由 此，在"膜片错"技术的"全细胞"模式中对A549细胞的宏观电流进行推导，如在，，阿米洛 利敏感的钢离子通道巧化C)的电生理研究"中所描述的。
[0152] 表3中列出了分别在时间点T=0和6个月之后灯=6M)或24个月之后灯= 24M)，具有氨基酸序列SEQIDNO: 1至SEQIDNO: 6的环肤的各个冻干物的稳定性研究结 果。在此期间，外观没有改变。环肤含量W及纯度仅有小幅波动。
[0153]表 3
[01巧]具有氨基酸序列沈QIDNO: 1至沈QIDNO:6的环肤的各个冻干物由此在2至 8 °C稳定长达24个月，在25°C/60 %相对湿度稳定长达6个月。
[0156] 利用膜片错实验测量的生物活性显示，氨基酸序列SEQIDNO: 1至SEQIDNO:6 的环肤之一的各个冻干物，在2至8°C储存24个月后仍是完全有活性的。
[0157] 实施例5
[0158] 制备氨基酸序列SEQIDNO: 1至SEQIDNO:6的环肤的吸入前水溶液
[0159] 为预先制备氨基酸序列SEQIDNO: 1至SEQIDN0:6的环状蛋白的给药，将根据 实施例2在冷冻干燥期间得到的各个稳定白色粉末溶解到所定义体积的纯水中，W得到在 0.Img/ml至lOOmg/ml范围的浓度。然后将沈QIDN0:1至沈QIDN0:6的环状蛋白的所 得溶液转移至喷雾器的储存容器中。由此获得溶解于澄清溶液中的SEQIDNO: 1至SEQID NO:6的环肤。
[0160] 实施例6
[016。 吸入前氨基酸序列SEQIDNO: 1至SEQIDN0:6的环肤在溶解后制剂中有关稳定 性的研究
[0162] 由于实践原因，氨基酸序列SEQIDNO: 1至SEQIDNO:6的环肤的水溶液往往不 是在其制备为吸入剂型后直接使用。出于运个原因，示范性地研究了水溶液的稳定性。因 此，将即用溶液在2至8°C下存储于实验室常用的注射器中7天，，或将即用溶液在25°C下 存储于在喷雾器的容器中24小时。特别地，对SEQIDN0:1的环状蛋白的外观、含量及其 纯度进行了研究。因此所使用的方法是实验室常用的分析方法，例如目测检查，W及利用反 相HPLC的分析。
[016引表4中列出了具有氨基酸序列SEQIDNO: 1的环肤的水溶液稳定性的研究结果。 外观在所有期间内有没改变。环肤含量W及纯度仅有小幅波动。
[0164]表 4
[0166] 因此，吸入用氨基酸序列沈QIDNO: 1至沈QIDNO: 6的环肤的水溶液在2至8°C 下实验室常用注射器中可稳定7天，或在25°C下喷雾器的容器中可稳定至少24小时。
[0167] 实施例7
[0168] 在转变成气雾剂过程中氨基酸序列SEQIDNO: 1至SEQIDNO:6的环肤在溶解后 审IJ剂中有关稳定性的研究
[0169] 由于蛋白质和肤在一些情况下相当不稳定，对转变为气雾剂过程中氨基酸序列 SEQIDNO: 1至SEQIDN0:6的环肤在溶解后的制剂中是否保持稳定进行了研究。对此，将 环肤如实施例4中所描述溶解于水中。将环肤的水溶液填充到喷雾器的储存容器后，将其 转化成气雾剂。为此使用了，，网式"喷雾器。将从喷雾器传递出的气雾剂收集在如图4所 示的冷阱中。利用膜片错方法确定所收集的气雾剂的生物活性。由此，在"膜片错"技术 的"全细胞"模式中对A549细胞的宏观电流进行推导，如在，，阿米洛利敏感的钢离子通道 巧化c)的电生理研究"中所描述的。
[0170] 利用反相HPLC/MS来确定压缩气雾剂的化学稳定性。
[0171] 示例性地显示了在转变成气雾剂的过程中氨基酸序列SEQIDNO: 1的环肤在溶解 后的制剂中保持了其生物稳定性W及化学稳定性。
[0172] 实施例8
[0173] 氨基酸序列SEQIDNO: 1至SEQIDNO:6的环肤的气雾剂的理化性质
[0174] 利用将水溶液转变为气雾剂的喷雾器，还可将氨基酸序列SEQIDNO: 1至SEQID NO: 6的环肤的水溶液转变为气雾剂。该气雾剂可WW有关平均液滴尺寸和气雾剂液滴的尺 寸分布为特征。对此，采用了药典中所描述的传统的方法。该分析方法，在具体构成中使用 多级冲击器、，，下一代冲击器"。由此，经由一系列筛板输送气雾剂，其中随着各个板的层 次，孔的直径逐渐减少且孔的数量逐渐增加。在另一个分析方法（激光衍射测试）中，利用 激光来确定液滴尺寸。在运些测试过程中确定了 2个重要参数，一方面是所有液滴的平均 直径，另一方面是直径《5ym的液滴量。在文献中直径被描述为一种限制，据此吸入的气 雾剂粒子实际上到达肺中。
[0175] 已经广泛知晓的是实践中只有一部分所生成的气雾剂对患者具有生物利用度。因 此，为确定对患者具有生物利用度的气雾剂的量，利用呼吸模拟器进行了试验。为研究粒子 尺寸并实施呼吸呼吸模拟器，采用了来自氨基酸序列SEQIDNO: 1的环肤的水溶液的气雾 剂。利用不同喷雾器类型W产生气雾剂。喷雾器A和B被称为，，网式喷雾器"。
[0176] 气雾剂中直径《5ym的液滴的量在所有喷雾器中为至少50%，见表5和图5,其 中表示并显示了生成于3个不同的喷雾器的氨基酸序列SEQIDNO: 1的环肤的气雾剂的特 征。
[0177]表 5
[0179] 此外，可证明由喷雾器产生的氨基酸序列SEQIDNO: 1的环肤的水溶液的气雾剂 的主要部分对于吸入具有生物有效性，如W，，吸入过滤器"处的环状蛋白的定量验证所绘 制的图6所示。无生物利用度的气雾剂部分明显较少（图6)。
[0180] 实施例9
[01引]肠胃外给药后血液中的氨基酸序列SEQIDNO: 1至SEQIDNO:6的环肤的证明[018引在狗和大鼠中对肠胃外给药后血液中的氨基酸序列SEQIDNO: 1至SEQIDN0:6 的环肤进行示例性证明。对此示范性地，将氨基酸序列SEQIDNO: 1的环肤的水溶液W推 注的方式静脉给药至实验动物（25mg/kg体重）。在施用到静脉终止后立刻收集血液，并利 用常规实验室反相HPLC/MS来测定氨基酸序列SEQIDN0:1的环状蛋白的浓度。结果列在 表6中，其中表示了施用于静脉后氨基酸序列SEQIDN0:1的环肤的血浆浓度。
[0183]表6
[0185] 实施例10
[0186] 作为气雾剂吸入后在肺组织中的氨基酸序列沈Q ID NO: I至沈Q ID NO:6的环肤 的证明
[0187] 在大鼠的肺组织中对氨基酸序列SEQIDNO: 1至SEQIDNO: 6的环肤进行示例性 证明。对此，示范性地，W喷雾器从氨基酸序列SEQIDNO: 1的环肤的水溶液制备气雾剂。 气雾剂被实验动物吸入（72mg/kg体重）。在气雾剂吸入终止之后，对实验动物的肺组织W 及血液进行检验。利用反相HPLC/MS对氨基酸序列SEQIDNO: 1的环肤的浓度进行测定。 示范性地，总共吸入72mg/kg体重后，可在肺组织中检测到1. 2yg/g浓度的氨基酸序列SEQ IDNO: 1的环肤。相比之下，在血液中检测不到氨基酸序列SEQIDNO: 1的环肤可W达到 0. 1Jig/ml的检测限。
[018引实施例11
[0189] 氨基酸序列SEQIDNO: 1至SEQIDNO:7的肤对去糖基化细胞表面的作用
[0190] 全细胞实验中，将A549细胞与100个单位的酶叩NGaseF"(肤-N4- (N-乙酷 基-0-D-葡糖）天冬酷胺酷胺酶巧培养1-5分钟后立即进行膜片错测量，并且在将具有 培养细胞的盖玻片在转移到Iml容积的腔室之前W外部溶液对其进行漂洗。在对照记录 之后，将240nM的氨基酸序列S