EQIDNO: 1的肤加入到电解液中。在化=-IOOmV记录下 对照条件下未进行任何预处理的细胞的总细胞电流、加入肤SEQIDNO: 1至SEQIDNO:7 的肤的细胞的总细胞电流W及WPNGaseF进行预处理的细胞的总细胞电流进行记录。表 7中示出了全细胞模式中利用片错试验的去糖基化实验结果，其中表明了去糖基化A549细 胞利用SEQIDNO: 1至SEQIDN0:7的肤对激活钢离子电流活化的作用。在化=-IOOmV 记录全细胞电流。电解液中SEQIDNO: 1至SEQIDNO:7的肤的浓度为240nM。
[0191]表 7
[0192]
[0193] 膜片错试验前WPNGaseF(处理）对细胞进行预处理减小氨基酸序列SEQID NO: 1至SEQIDN0:6的肤的能力从而增强了钢电流。在-IOOmV控制电位并且无需向电解 液加入肤的对照条件下，未经处理的细胞和没有WPNGaseF进行预处理的细胞中的钢电流 均为25. 4pA。未经处理的细胞中，在-IOOmV的控制电位下，向电解液加入氨基酸序列SEQ IDNO: 1至沈QIDNO:6的肤（终浓度240nM)形成超过1000 pA的显著钢离子电流。相比 之下，氨基酸序列SEQIDNO:7的肤显示无活性。
[0194] 实施例12
[0195] 使用猪的肺移植实验
[0196] 将脑死亡猪成成背邸位，并进行纵向胸骨切开术。将屯、包和两个胸膜腔都打开。结 扎上、下腔静脉。将内流导管通过右屯、室排出段上的荷包缝合的方式插入肺动脉。通过结扎 使上、下腔静脉中向内的血流得到闭合，将动脉夹紧来闭合向外的血流。然后通过内流导管 用顺行冲洗的冷等渗保存溶液（每公斤猪体重50ml，含有钟离子、钢离子、儀离子、巧离子、 氯离子、葡聚糖、葡萄糖、缓冲剂离子）保存肺。左屯、耳的切口导致血液外流。在此期间，用 50%的氧气进行肺换气，并且将碎冰放置在两个胸膜腔和纵隔膜中。
[0197] 移出技术是根据W下步骤整块切取屯、脏和食管：
[019引a)清除气管两侧桥接至胸腔的软组织。
[0199]b)横切两个经肺初带（非常深，难W暴露），然后分别横切VCI、下部胸降主动脉或 食管。
[0200] C)纯性分离剩余纵隔粘连。
[0201] d)在使用吻合器关闭气管前完成对供体肺的充气。
[0202] 移出后，将肺包裹在纱布中放置于填充有低钟葡聚糖细胞外溶液的隔热冰袋中， 并在4°C下储存18至24小时。溫度探针浸没在放置在冰箱中的容器中。
[0203] 对于离体肺调节，采用了EVLP技术（血管外肺灌注）。EVLP技术中，将供体肺放 置在累、通气机和过滤器构成的回路。EVLP技术，溫度可升高到37°C。在EVLP技术中，通 气机用于向肺部传递氧气。累用于对肺灌注含有人体白蛋白和营养的细胞外溶液。在EVLP 期间，可W定期对肺功能的关键指标进行评估。
[0204] 对于实验性猪肺移植实验，W2. 0升人体白蛋白溶液填装EVLP回路。运种细胞外 溶液具有最佳胶体渗透压。对回路进行脱气后，将其连接到肺部前在20°C下使填装物循环。 将肝素、头抱巧辛、甲泼尼龙添加到灌注液中。
[0205] 猪供体肺的处理W缝合漏斗形娃橡胶管与内置于左屯、房（LA)套囊缝合在一起开 始，W便用夹板将LA固定为开放状态并保持灌注回路封闭。
[0206] 利用连续5-0单纤丝线缝合将该管牢固地接合于LA套囊W提供可靠和有效的外 流途径。将相同类型的插管用于肺动脉（PA)的插管，根据需求修整至匹配PA尺寸。用500ml 的缓冲细胞外液进行表背逆行冲洗。将供体肺安装至EVLP回路中前，将气管打开并进行直 接支气管抽吸来清理呼吸道。将内切气管导管（尺寸8mmI.D.)插入气管并用厮带胶带固 定牢固。此后，将肺转移到EVLP回路单元。首先，将LA插管连接至回路并启动缓慢逆流W 对PA插管进行脱气。一旦脱气完成后，将PA插管连接到回路并在室溫下W启动150ml/min 的灌注液启动顺行流动。在接下来的30分钟内将灌注液的溫度逐渐升高至37°C。当达到 32-34°C的溫度时，通气机开始对供体猪肺进行机械通气并且逐渐增加灌注流速。
[0207] 启动EVLP气流向肺供应氧气并经由气体交换膜向流入灌流液（86%N2、6% 02、 8%C02)提供二氧化碳（W0.化/min的气体流开始并基于流入灌流液的pC02进行滴定） W保持35至45毫米隶柱范围的流入灌流液pC02。在肺被完全扩展后，将采用标准的单液 体雾化系统的单剂量AP301的（Img/kg在5ml的Aqua中）应用于由EVLP回路系统通气和 灌注的供体猪肺。
[020引 EVLP实验过程中，不对灌注进行评估。每小时测量并记录W下功能参数：
[0209] ?肺动脉流（PA巧：L/min
[0210] ?(平均值）肺动脉压（PAP):毫米隶柱
[0211] ?左屯、房压（LAP):毫米隶柱
[021引?肺血管阻力（PVR= [PAP-LA門X80/PA巧：dynes/sec/cm-5[021引 ?平均值，峰值和平衡气道压（mAwP、peakAwP、platAwP) :c恤20
[0214].动态顺应性（mL/cm肥0)
[021引 ?灌流液气体分析-流入（PA)和流出（PV)P02，PC02和抑值。
[0216] 结果
[0217] 运项研究在模拟肺移植的体外系统中评估了具有氨基酸序列SEQIDNO: 1的肤对 肺功能的作用。如图2A和图2B所示，研究结果表明在吸入应用后动态肺顺应性和动静脉 氧分压差Ap〇2均在使用具有氨基酸序列SEQIDNO: 1的肤治疗的肺部中得到改善。
[021引SEQIDNO:7的肤的肺部应用对肺功能没有提供改善作用。
【主权项】
1. 一种式x^gqretpegaeakpwy-X2(I)的环肽，其为不含添加剂和/或稳定剂的冻干物 的形式，其中 &包含具有1至4个残基的氨基酸（序列），所述氨基酸包括天然氨基酸或非天然氨 基酸，和 父2包含天然氨基酸，并且其中 乂:包含在左侧位置1的N-末端氨基酸，而X2包含在最终右侧位置的C-末端氨基酸。2. 根据权利要求1所述的冻干物，其中在式I中的Xi选自氨基酸（序列）C(Cys)、 KSP(Lys-Ser-Pro)、K(Lys)、鸟氨酸、4-氨基丁酸、0 -丙氨酸。3. 根据权利要求1或2中任一项所述的冻干物，其中在式I中的X2选自C(Cys)、 D(Asp)、G(Gly)和E(Glu)的组。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的冻干物，其中式I的环状化合物选自以下氨基 酸序列的肽： -SEQIDNO:1 环（CGQRETPEGAEAKPWYC) 其中二硫键形成于两个末端半胱氨酸残基之间； -SEQIDNO:2 环（KSPGQRETPEGAEAKPWYE) 其中酰胺键形成于连接到N末端赖氨酸残基的e-碳原子的氨基基团和连接到C末端 谷氨酸残基的Y-碳原子的侧链羧基基团之间； -SEQIDNO:3 环（KGQRETPEGAEAKPWYG) 其中酰胺键形成于连接到N末端赖氨酸残基侧链的e-碳原子的氨基基团和C末端甘 氨酸残基的羧基基团之间； -SEQIDNO:4 环（鸟氨酸-GQRETPEGAEAKPWYG) 其中酰胺键形成于连接到N末端鸟氨酸残基侧链的S-碳原子的氨基基团和C末端甘 氨酸残基的羧基基团之间； -SEQIDNO:5 环（4-氨基丁酸-GQRETPEGAEAKPWYD) 其中酰胺键形成于N-末端4-氨基丁酸残基的氨基基团和连接到C-末端天冬氨酸残 基的(6-碳原子的侧链羧基基团之间；和 -SEQIDNO:6 环（P-丙氨酸-GQRETPEGAEAKPWYE) 其中酰胺键形成于N-末端(6-丙氨酸（3-氨基丙酸）残基的氨基基团和连接到C-末 端谷氨酸残基的Y-碳原子的侧链羧基基团之间。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的冻干物，其中式I的环状化合物是盐的形式。6. 根据权利要求1至5任一项所述冻干物在制备适用于喷涂的气雾剂中的应用，所述 气雾剂特别是没有添加剂和/或稳定剂的气雾剂。7. 根据权利要求6所述的应用，其中式I的肽存在于水溶液，特别是没有添加剂和/或 稳定剂的水溶液中，其中XjPX2如权利要求1至5中任一项所定义。8. 根据权利要求6或7任一项所述的应用，其中气雾剂中待喷雾的粒子尺寸为直径 < 5ym〇9. 根据权利要求8所述的应用，其中所述粒子尺寸为直径< 5ym。10. 根据权利要求6至9任一项所述的应用，其特征在于由冻干物所制备的所述气雾剂 以吸入的形式用于改善/调节肺功能。11. 一种调节/改善肺功能的体外方法，其特征在于以水溶性气雾剂对供体肺进行离 体喷涂，特别地所述水溶性气雾剂由根据权利要求1至5的冻干物在无需添加剂和/或稳 定剂的条件下而制成。
【专利摘要】不含添加剂和/或稳定剂的冻干物形式的式(I)X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2的环肽及其应用。其中X1包含具有1至4个残基的氨基酸(序列)，所述氨基酸包括天然氨基酸或非天然氨基酸，而X2包含天然氨基酸，并且其中X1含有在左侧位置1中的N-末端氨基酸，而X2含有在右侧最终位置的C-末端氨基酸。
【IPC分类】A61K9/00, A61K38/19, A61P11/00
【公开号】CN105188734
【申请号】CN201480023380
【发明人】B·费希尔, R·鲁卡斯
【申请人】阿佩普蒂科研究和开发有限责任公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2014年4月18日
【公告号】CA2907693A1, EP2988768A1, US20160083431, WO2014173842A1