用于选择性杀死癌细胞的trail增强剂的制作方法

用于选择性杀死癌细胞的trail增强剂的制作方法
【专利说明】用于选择性杀死癌细胞的TRAIL増强剂
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2013年3月19日提交的美国临时申请序列号61/803, 177的优先 权的利益，将该申请以其整体通过引用结合于此。
[0003] 政府资助声明
[0004] 本发明在以由国立卫生研究所授予的HHSN27200700038C、AI077644、AI079436和 AI094348的政府资助下完成。美国政府具有本发明中的某些权利。
[0005] 背景
[0006] 细胞凋亡是细胞死亡的遗传学编程的且在生理学上重要的形式。其是保守的细胞 适应性机制，其通过维持健康成体组织中的细胞周转而在正常发育中具有重要作用。异常 细胞凋亡活性与自体免疫的发病和传染性疾病（包括持久的炎性疾病）相关（Gyrd-Hansen 等，Nat Rev Cancer 10(8)561-74)。逃避细胞凋亡已被鉴定为癌症的标志（Hanahan D.等， Cell 2000,100(1)，57-70)。因此，触发细胞凋亡过程对于杀死癌细胞并且使它们对不同的 治疗方案敏感可能是重要的（Ashkenazi，A.，Nat Rev Drug Discov 2008,7(12)，1001_12; Ashkenazi，A 等，J Clin Invest 1999,104(2)，155-62)。
[0007] 有前景的用于癌症疗法的候选之中，肿瘤坏死因子（TNF)相关的细胞凋亡诱导配 体（TRAIL)通过受体介导的机制启动细胞凋亡，也被称为外部细胞凋亡通路。与天然存在 的促细胞凋亡配体如TNF和Fax配体（FasL)相反，TRAIL注入小鼠中对组织和器官不引起 致死反应或可检测的毒性（Ashkenazi，A.，Nat Rev Drug Discov 2008, 7 (12)，1001-12 ; Ashkenazi，A 等，J Clin Invest 1999,104(2)，155-62 ;Walczak，H?等，Nat Med 1999， 5(2)，157-63)。此外，TRAIL对于杀死癌细胞的潜在重要性已经得到动物模型中的研究的 支持，证明该细胞因子具有对人肿瘤异种移植物的选择性毒性，但是对正常组织则没有。然 而，对TRAIL诱导的细胞凋亡的敏感性是限制TRAIL治疗的效力的关键因素，因为在不同的 恶性细胞中观察到敏感性谱（Lippa，M.S?等，Apoptosis 2007,12 (8)，1465)。此外，与正常 细胞类似，一些癌细胞也对TRAIL诱导的细胞凋亡具有抗性。
[0008] 对细胞凋亡的分子细节增加的理解表明，肿瘤细胞能够通过干扰外部或内部细胞 凋亡信号传导通路来获得对细胞凋亡的抗性。然而，如果通过能够克服抗细胞凋亡影响 的机制被触发，则大部分癌细胞保持承受细胞凋亡的能力。例如，抑制NF-kB活性显著 增加由细胞凋亡刺激物诱导的细胞凋亡（Beg. A.A.等，Science 1996,274(5288)，782-4; Wang，C.Y?等，Science 1996, 274 (5288)，784-7 ;Van Antwerp，D.J?等，Science 1996， 274 (5288)，787-9 ;Liu，Z.G?等，Cell 1996,87 (3)，565-76)。此外，在激活若干细胞内的非 细胞凋亡信号传导过程，包括JNK通路或内质网（ER)应激（其在真核细胞中被称为未折叠 蛋白反应（UPR))后，也发生细胞凋亡增强（Ron，D.等，Nat Rev Mol Cell Biol 2007,8 (7)， 519-29)。已经观察到，UPR激活剂如衣霉素（tunicamycin)、毒胡萝卜内酯（thapsigargin) 和RRR-a -生育酚醚连乙酸类似物（a -TEA)，使癌细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡敏感 (Jiang，C.C?等，Cancer Res 2007,67 (12)，5880 ;Chen，L.H?等，Carcinogenesis 2007， 28 (11)，2328-36 ;Tiwary，R?等，PLoS One 5 (7)，el 1865)。然而，这些试剂诱导 UPR 的组成 性和持续的激活。
[0009] 细菌代谢物在对于对于正常发育和包括癌症在内的多种慢性疾病的发病机制是 必需的炎症介导的过程中起重要作用。炎症典型地作为通过依赖于受体的机制的对特定细 菌产物的先天免疫反应引发，其中转录因子NF-kB的诱导对于活化的细胞中的免疫系统 的激活和细胞凋亡的控制是所需的。例如，在存在革兰氏阴性菌的情况下，NF-kB激活初 始地响应于细菌脂多糖（LPS)(其是Toll样受体4(TLR4)的激动剂）被诱导，这导致编码 促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-a (TNF)和白细胞介素-l(IL-l)的NF-kB调节的基因 的表达。在接合TNF或IL-1受体后，另外轮次的NF-kB激活放大该LPS诱导的炎性反应。 依赖于NF-kB的过程，与其他信号传导通路呼应地，上调促细胞凋亡癌症免疫监视效应物 的表达，该效应物包括TNF相关的细胞凋亡诱导配体（TRAIL)，其是一种细胞凋亡性细胞死 亡所必需的介体（尤其是在癌细胞中）。虽然LPS诱导的炎性反应导致促细胞凋亡的细胞 因子如TNF和TRAIL的释放，但是接收这些死亡信号的癌细胞仍然可以由于NF-kB信号传 导对细胞凋亡的抑制作用而存活。
[0010] 概述
[0011] 本发明在多个实施方案中涉及在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡、捕获（arrest)细胞 分裂或抑制细胞增殖或它们的任意组合的方法。相对于正常细胞，肿瘤坏死因子相关的细 胞凋亡诱导配体（TRAIL)优先诱导癌细胞中的细胞凋亡；然而，肿瘤细胞可以形成TRAIL抗 性。这里我们证实：在存在细菌性酰基高丝氨酸内酯（AHL)类似物或产生AHL的细菌的情 况下，通过TRAIL诱导的细胞凋亡和AHL介导的由NF-kB信号传导调节的炎症的抑制的组 合作用，该抗性可以被克服。此发现揭示了之前未被认识的细菌和宿主免疫监视之间的共 生联系。
[0012] 在多个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的 式（I)的N-酰基高丝氨酸内酯（AHL)类似物化合物：
[0013]
[0014] 其中R是约9至约15个碳原子的直链烷基、烯基或炔基，所述烷基、烯基或炔基具 有一个或多个二氮杂环丙烯基（diazirenyl group)，任选地在所述烷基、烯基或炔基上的 4以上的位置处具有一个或多个羰基，并且还任选地被叠氮基、羟基或卤素（卤代基，halo) 取代；或其药用盐；和，任选地，药用赋形剂。例如，该AHL化合物可以是式（II)的化合物，
[0015]
[0016] 其中R1是约7至13个碳原子的直链烷基、烯基或炔基，所述烷基、烯基或炔基任 选地具有以下各项中的一个或多个：
[0017] (a)二氮杂环丙烯基；
[0018] (b) -个或多个羰基；
[0019] (c)或，一个或多个独立地选择的叠氮基、羟基或卤素基团。
[0020] 例如，式（I)的化合物可以是所述化合物关于在氮原子与内酯环的结合位置处的 手性中心的（S)-对映异构体。
[0021 ] 在多个实施方案中，本发明提供一种治疗患者的肿瘤的方法，所述方法包括向所 述患者施用有效量的如上所述的式（I)的N-酰基高丝氨酸内酯（AHL)类似物化合物。任 选地，还可以施用有效量的肿瘤调制剂如TRAIL多肽。
[0022] 在多个实施方案中，本发明提供一种用于在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡、捕获细胞 分裂或抑制细胞增殖的方法，所述方法包括将细胞与有效量的N-酰基高丝氨酸内酯（AHL) 化合物以及任选地有效量的肿瘤调制剂如TRAIL多肽接触，其中所述AHL化合物具有如上 所述的式（I)。
[0023] 在多个实施方案中，本发明提供合成可用于实施本发明的方法的本发明的AHL类 似物的方法。
[0024] 在多个实施方案中，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括在容器中的本发明 的化合物，如化合物（S)-(3_N 2)，其任选地被溶解在药用液体介质中；所述试剂盒任选地还 包括在第二容器中的肿瘤调制剂，如TRAIL，其任选地被溶解在药用液体介质中；所述试剂 盒还任选地包括用药或存储信息或两者。
[0025] 附图简述
[0026] 图1 :C12在哺乳动物细胞中诱导UPR。（A和B).对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa) (P. a.)、鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium) (S. t.)和金黄色葡萄球菌（S. aureus) (S. a.)的 巨噬细胞应答性的比较。显示了在用细菌处理后在细胞提取物中的XBP1的RT-PCR测定（A) 与p38、其磷酸化形式（p_p38)以及磷酸化形式的PERK(p-PERK)和eIF2a (p-eIF2a)的蛋 白质印迹分析（B)。（C)将巨噬细胞用铜绿假单胞菌野生型（wt)或Iasi突变体（A Iasi) 进行刺激，并且制备细胞提取物（总RNA或总蛋白质）并且如在（A和B)中那样进行分析。 (D和E)显示了自用化合物（C12)，即（S)-对映异构体，或用（R)-对映异构体（C12R)，或水 解产物（C12h)处理后的巨噬细胞制备的总RNA中的XBP1或肌动蛋白的RT-PCR测定。（F) 总RNA自接种媒介物（vehicle)㈠或（C12)后的小鼠的肺制备并且如在⑶中那样进行 分析。（G)化合物（C12)、（C12R)和（C12h)的化学结构。化合物（C12)是下式的化合物的 (S)-对映异构体：
[0027]
[0028] 图2 :C12通过调节鞘酯代谢（medabolism)诱导UPR。（A和B)如所示的在存在 或不存在CHX(A)或D-MAPP(B)的情况下自用C12、Tm或Tg处理的巨噬细胞制备的总RNA 中的XBP1的RT-PCR测定。（C)蛋白质印迹分析显示D-MAPP对（C12)诱导的eIF2a的磷 酸化（p-eIF2a)和p38的磷酸化（p-p38)的作用；用于肌动蛋白的蛋白印迹是加载对照。 (D)在存在或不存在D-MAPP的情况下用LPS刺激巨噬细胞，并且制备总蛋白质提取物并且 通过蛋白质印迹分析P-P38以及iKBa的表达。（E)RT-PCR测定（上图）或蛋白质印迹 (下图）监测自在用（C12)、鞘氨醇（Sph)或二甲基鞘氨醇（DMS)处理后的巨噬细胞制备的 样品中的XBP1或eIF2 a或P-P38的水平。（F)如所示的，TLC测定监测用DMSO(对映异构 体）或C12处理后的巨噬细胞中的 3H-Sph代谢。在左边指示标准鞘脂的位置。Cer，神经 酰胺；Sph，鞘氨醇；S1P，1-磷酸鞘氨醇；SM，鞘磷脂。
[0029] 图3 :癌性和非癌性细胞对由TNF、C12或C12和TNF的组合诱导的细胞凋亡的敏 感性。如所示的，将细胞与TNF、（C12)或TNF和（C12)的组合孵育，并且通过蛋白质印迹确 定PARP(-种细胞凋亡标志）的裂解。（A和B)用对照载体（载体（Vector))和表达Bcl-2 或CLARP的载体转染的乳腺癌MCF-7细胞。（C)HeLa细胞系。（D)正常人支气管上皮细胞 (MBE) 〇
[0030] 图4 :C12使肺癌细胞系A549对TRAIL敏感。（A)在含有TRAIL(50ng/ml)、化合物 (C12) (1 yM)、化合物（C12R) (25yM)或TRAIL(T)与（C12)或（C12R)的指定组合的培养基 中温育24小时后，考察细胞的生存力。在右侧显示（C12)及其立体异构体（C12R)的化学 结构。⑶在含有TRML(50ng/ml)和指定剂量的C12的培养基中温育24小时后，考察细胞 的生存力。根据基于XTT的毒理学测定试剂盒（Sigma)，作为存活细胞的线粒体活性的函 数，确定在所述处理后剩余的存活细胞，并且将其显示为存活的未处理细胞的百分比。
[0031] 图5 :C12使肺癌细胞系A549对TRAIL诱导的细胞凋亡敏感。将细胞用TRAIL、 (C12)或TRAIL和（C12)的组合处理指定的时间，并且通过蛋白质印迹分析考察细胞提取 物的细胞凋亡标志（裂解形式的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶_3 或PARP)、应激反应（磷酸化形式的eIF2 a、P38或JNK)和肌动蛋白（加载对照）。
[0032] 图6 :在存在C12的情况下原代人B细胞对TRAIL有抗性。（A)将细胞用TRAIL(T)、 (C12)、毒胡萝卜内酯（thapsigargin) (Tg)或如所示的组合处理。根据基于XTT的毒理学 测定试剂盒（Sigma)，作为存活细胞的线粒体活性的函数确定在24-小时处理后剩余的存 活细胞，并且将其显示为存活的未处理细胞的百分比。（B)将细胞用TRAIL、（C12)、毒胡萝 卜内酯（Tg)或如指定的组合处理6小时。通过蛋白质印迹考察细胞提取物的作为细胞凋 亡标志的PARP的裂解或作为加载对照的肌动蛋白。
[0033] 图7 :癌性和非癌性细胞对TRAIL和（C12)的组合的敏感性。将正常人支气管上 皮（NHBE)和癌性人HeLa细胞用TRAIL和指定剂量的（C12)温育，并且通过XTT测定确定 相对于未处理对照的细胞生存力。
[0034] 图8 : (C12)的安全性和促细胞凋亡活性。将细胞用TRAIL、（C12)、 bormetazomid(Bor)或如所示的TRAIL和（C12)或Bor的组合温育，并且确定细胞生存力 (上图）或PARP的裂解（下图）。（A)肺癌细胞系A549。（B)来自正常供体的原代人肝细 胞。
[0035] 图9 :对癌性细胞对于TRAIL的敏感性的（C12)介导和化合物#15介导的作用的比 较。（A)在含有TRAIL(25ng/ml)和指定剂量的（C12)或其类似物（#15)(见表1)的培养基中 温育24小时后，考察A549细胞的生存力。（B)将A549细胞用TRAIL、衣霉素（tunicamycin) (Tu)、毒胡萝卜内酯（Tg)、化合物#15、（C12)或如所示的组合处理。通过蛋白质印迹考察 细胞提取物的作为细胞凋亡标志的PARP的裂解或作为加载对照的肌动蛋白。
[0036] 图10 :类似物的生物学活性。（A)将肺癌A549细胞用（C12)或如所示的其类似物 (化合物13,16和17,见表1)处理，并且通过蛋白质印迹考察细胞提取物的磷酸化形式的 eIF2 a或P38和作为加载对照的肌动蛋白。（B)将A549细胞用TRAIL、化合物、（C12)或如 所示的组合处理，并且也如在（A)中所示的那样制备细胞提取物（6小时处理）并通过蛋白 质印迹考察作为细胞凋亡标志的PARP的裂解。
[0037] 图11.产生（C12)的细菌或（C12)在癌细胞中促进细胞因子介导的细胞凋亡。a) 该研究中考察的AHL的化学结构。b)如所示的，在有或没有铜绿假单胞菌（Bac)野生型 (wt)或Iasi突变体菌株（A Iasi)的情况下，在存在或不存在TNF或TRAIL的情况下温育 肺癌细胞。2h后，制备细胞溶解产物并且通过免疫印迹法利用对PARP或作为加载对照的 肌动蛋白特异性的抗体进行分析。c)将肺细胞不处理（空白（Mock))或在存在指定剂量 的（C12)的情况下用TNF或TRAIL处理6h;如在b)中那样分析细胞样品。d)对于TRAIL、 (C12)或它们的组合的肺细胞应答性的比较。在用如所示的刺激物处理后制备的细胞提取 物中的PARP、IkBa、磷酸化形式的p38(p_p38)和肌动蛋白的蛋白质印迹分析。
[0038] 图12. (C12)促进TRAIL介导的癌细胞杀伤。a)、c)用TRAIL、（C12)或如所示的两 者的组合处理3小时的癌细胞或正常细胞中的PARP裂解的蛋白质印迹分析。b)、d)监测在 含有TRAIL和指定剂量的（C12)的培养基中培养18小时的癌细胞和正常细胞的生存力的 基于XTT的测定。在对照样品（未处理的细胞）中以及在用单独的TRAIL或在没有TRAIL 的情况下相同剂量的（C12)温育的样品中，细胞存活率为~100%。
[0039] 图13.炎症诱导的NF-kB信号传导的AHL介导的抑制足以使得肿瘤易感于TRAIL 诱导的细胞凋亡。a)用TRAIL或如所示的其与不同AHL的组合刺激3小时的癌细胞中的 PARP裂解的蛋白质印迹分析。b)来自用如所示的（C12)或（3-N 2)，即（S)-(3-N2)刺激的 骨髓来源巨噬细胞（BMDM)的提取物中的PARP裂解以及磷酸化形式的eIF2 a和P38的蛋 白质印迹分析。c)在用LPS或其与（C12)或（3-N2)的组合处理后制备的BMDM提取物中的 PARP裂解和IkBa表达的时序分布的蛋白质印迹分析。d) (C12)及其衍生物对BMDM中的 LPS诱导的TNF产生的抑制作用。e)将肺癌细胞暴露于（3-N2) (10 yM)、TRAIL(0. 5ng/ml)、 TNF(20ng/ml)或如所示的它们的组合。2h后，制备细胞溶解产物并且通过蛋白质印迹分析 PARP裂解、IkBa和肌动蛋白。
[0040] 详述
[0041] 烷基包括具有1至约20个碳原子，并且典型地具有1至12个碳或，在某些实施 方案中，具有1至8个碳原子的直链和支链烷基和环烷基。直链烷基的实例包括具有1至 8个碳原子的那些如甲基，乙基，正丙基，正丁基，正戊基，正己基，正庚基和正辛基。支链烷 基的实例包括但不限于，异丙基，异丁基，仲丁基，叔丁基，新戊基，异戊基和2, 2-二甲基丙 基。如本文使用的，术语"烷基"涵盖正烷基，异烷基和反异烷基（anteisoalkyl)以及烷基 的其他支链形式。
[0042] 烯基包括如上所定义的直链和支链和环状烷基，不同之处在于至少一个双键存在 于两个碳原子之间。因此，烯基具有2至约20个碳原子，并且典型地具有2至12个碳或，在 某些实施方案中，具有2至8个碳原子。实例尤其包括但不限于乙烯基，-CH = CH(CH3)，-CH = C(CH3)2，-C(CH3) =CH2，-C(CH3) =CH(CH3)，-C(CH2CH3) =CH2，环己烯基，环戊烯基，环己 二烯基，丁二烯基，戊二烯基和己二烯基。
[0043] 炔基包括直链和支链烷基，不同之处在于至少一个三键存在于两个碳原子之间。 因此，炔基具有2至约20个碳原子，并且典型地具有2至12个碳或，在某些实施方案中，具 有2至8个碳原子。实例尤其包括但不限于-C三CH，-C三C-CH3)，-C三C-CH2CH3)，-CH2C三CH ，-CH2Cec-CH3)和-CH2Cec-CH2CH3)。
[0044] 当取代基超过一价如二价的0时，其可以通过超过一个键与其所取代的原子键 合，即，二价取代基通过双键键合；例如，被0取代的C形成羰基C = 0,其也可以被书写 为"C0"、" C(0)"或"C( = 0)"，其中C和0成双键。当碳原子被成双键的氧（= 0)基团取代时，氧取代基被称为"氧代"基团。当本文中陈述烷基、烯基或炔基包含羰 基时，所指的分别是其中链的碳原子与氧原子成双键结合的烷基、烯基或炔基链，例如，式
;中，其中波形线指示连接点。羰基也可以键接所述烷基、烯基或 炔基的任何其他碳原子。
[0045] 除非另有说明，术语"卤代"或"卤素"或"卤化物"自身或作为另一取代基的一 部分，表示氟、氯、溴或碘原子，优选表示氟、氯或溴。
[0046] "卤代烷基"包括一卤代烷基、多卤代烷基（其中所有卤素原子可以是相同的或不 同的）和全卤代烷基（其中所有氢原子被卤素原子如氟取代）。卤代烷基的实例包括三氟 甲基，1，1-二氯乙基，1，2-二氯乙基，1，3-二溴-3, 3-二氟丙基，全氟丁基等。
[0047] "羟基"是与碳键合的0H基团。
[0048] 术语"叠氮基"是指式^=ti = N..U^N3基团，其中波形线指示连接点。
[0049] "二氮杂环丙烯基（diazirenyl) "作为本文中使用的术语是指包括一个碳原子和 两个氮原子的三元环，其中两个氮原子彼此成双键并且每个氮原子与所述碳原子成单键， 例如，为以下结构：
[0050]
[0051] 其中四面体碳原子可以与两个另外的取代基键接。当本文中陈述烷基、烯基或炔 基包含二氮杂环丙烯基时，所指的分别是这样的烷基、烯基或炔基链，其中所述链的饱和碳 原子是与两个氮原子中的每个键合的碳原子。例如，包含二氮杂环丙烯基的C10烷基可以 具有式
其中波形线指示连接点。二氮杂环丙烯基也可 以键接所述烷基、烯基或炔基的任何其他碳原子。
[0052] "N-酰基高丝氨酸内酯（AHL)类似物"作为本文中使用的术语可以指具有如在 Cahn-Ingold-Prelog体系下指定的（S)绝对构型的式（I)的化合物
[0053]
[0054] 其中基团