解在DMS0中并将等分试样存储在-20°C。 此外，定量QCL-1, 000发色法变形细胞溶解产物测定（BioWhittaker，Walkersville， MD)显示C12的制剂没有内毒素。样品中TNF的上清水平通过ELISA(BD Biosciences Pharmingen，San Diego, CA)测量。总 RNA 通过使用 TRizol 试剂（Invitrogen)分离。
[0321] 抗体和蛋白质印迹分析。抗_eIF2 a、磷酸-eIF2(l (p-eIF2 a )、p38、 p-p38(Thrl80/Tyrl32)、p-RelA(Ser536)、p-l K3Ser32/36 )、PARP 抗体购买自 Cell Signaling;抗-RelA、I KBa、IkBP来自 Santa Cruz Biotechnology。制备细胞提取物 并且通过如之前所述的蛋白质印迹测定进行分析E3。
[0322] 数据呈现。图11-13中所示数据三个以上实验中的一个，其中每张图反映多个研 究的典型发现。
[0323] 通用化学方法：除非另外说明，在氮气氛下利用无水的新鲜蒸馏的溶剂在无水条 件下进行反应。二氯甲烷（CH 2C12)从氢化钙蒸馏。四氢呋喃（THF)从二苯甲酮钠蒸馏。除 非另外说明，产率提及色谱和光谱上的均一物质。通过使用茴香醛、KNn0 4SPMA染色在 0. 25-mm EMD硅胶板（60F-254)上进行的薄层色谱法（TLC)监测反应。在Silicycle硅胶 (40-63目）上进行急骤色谱法分离。在Bruker 400MHz分光计上记录NMR谱并且使用溶剂 峰作为内标进行校准。使用以下缩写来指示多重性：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰； m，多重峰；br，宽峰。
[0324] 化学材料：（S) - a -氨基-丫- 丁内酯购买自Aldrich并且原样使用。
[0325] B.合成过程和表征数据
[0326] 合成C12的3-二氮杂环丙烯衍生物（3_N2) ?
[0327]
[0328]3的制备。在氮气氛下在25 °C将癸酸1 (700mg,4. 06mmol)加入至圆底烧瓶并 溶解在THF(5.0mL)中。然后加入CDI(725mg，4.47mm〇l)并将所得的混合物在25°C搅拌 4h。在氮气氛下在25°C，在第二个圆底烧瓶中，将丙二酸叔丁酯（716mg，4.47mmol)溶解在 THF(4. OmL)中。将烧瓶冷却至0°C，然后逐滴加入异丙基氯化镁（4. 5mL，2. 0M，在THF中， 8. 93mmol)。将所得的混合物在0°C搅拌30min，然后温热至50°C达30min。冷却至0°C后， 经由插管加入癸酸溶液并且在〇°C_25°C搅拌过夜。然后将反应用1M HCl(lOmL)猝灭并用 Et0Ac(2X20mL)萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，用似230 4干燥并且在真空中浓缩。将 所得的剩余物通过急骤柱色谱法（98 : 2己烷，在EtOAc中）纯化，从而获得3 (950mg，86% 产率）。3的表征数据与之前报道的匹配' 虫NMR(400MHz，CDC13,25°C) =3.31(s， 2H)，2. 48 (t，2H，J = 7. 2Hz)，1. 56-1. 53 (m，2H)，1. 44 (s，9H)，1. 21-1. 18 (m，12H)，0? 85 (t， 3H，J = 6. 8Hz)。
[0329]4的制备。在25°C将化合物3(1.34g,5. Ommol)加入至圆底烧瓶并溶解在乙 二醇（910mg，14.75mmol)和二氯甲烷（30mL)中。然后在25°C向搅拌溶液中逐滴加入 TMSC1 (3. 2g，3. 7mL，29. 5mmol)。将所得的混合物在25°C搅拌4天，然后用水（15mL)猝灭并 用二氯甲烷（2X20mL)萃取。将合并的有机相用Na 2S04干燥并在真空中浓缩。将该经保护 的材料用作后续反应的原料。在氮气氛下在〇°C将粗的乙二醇保护的3加入至圆底烧瓶并 溶解在THF (40mL)中。逐滴加入氢化铝锂（1. 0M，在己烷中，1. 5当量），并使反应混合物温 热至25°C。搅拌4h后，将反应用水猝灭并过滤。将滤液浓缩至~20mL，加入1M HCl(20mL) 并将混合物在25°C搅拌过夜。然后将反应混合物用Et0Ac(2X30mL)萃取，并将合并的有 机相用Na 2S04干燥并在真空中浓缩。将所得的剩余物通过急骤柱色谱法（3 : 1己烷，在 EtOAc中）纯化，从而获得4 (1. 0g，3个步骤的产率为80 % )。4的表征数据与之前报道的匹 配65。虫 NMR(400MHz，CDC13,25°C ) : S = 3. 82(t，2H，J = 5. 4Hz)，2. 64(t，2H，J = 5. 2Hz)， 2. 39 (t，2H，J = 5. 2Hz)，1. 56-1. 54 (m，2H)，1. 26-1. 23 (m，12H)，0? 86 (t，3H，J = 6. 8Hz)。
[0330]5的制备。用于二氮杂环丙烯装联的方案遵循之前的报道3。将化合物4(489mg， 2. 44mmol)加入至配有冷凝器的圆底烧瓶并溶解在甲醇（8mL)中。加入液态氨（30mL)，并 将搅拌的溶液加热至回流达7h。将所得的混合物在干冰-丙酮浴中冷却，并在5分钟内加 入见1 2050311(3321^，2.93臟〇1)在甲醇（101^)中的溶液。除去冷却浴，并将混合物加热至回 流达1小时。在过夜蒸发液态氨后，将反应混合物过滤，并将滤饼用甲醇洗涤。将滤液和洗 液在真空中浓缩，并将粗二氮杂环丙稀（diazirine)用作随后的氧化反应的原料。粗二氮 杂环丙烷到二氮杂环丙烯5的氧化使用之前所述的碘-Et3N法进行E6,在急骤柱色谱法后 获得所述化合物（120mg，23% 产率）。虫匪1?(4001抱，0)(：13,25°(：) =3.44(t，2H，J = 6. 4Hz)，1. 64 (t，2H，J = 6. 4Hz)，1. 37 (t，2H，J = 6. 4Hz)，1. 26-1. 17 (m，14H)，0? 87 (t，3H，J = 6.8Hz) ;13。匪1?(1001抱，0)(：13,25。(：）=170.1，52.6,49.8,46.9,31.9,29.6,29.6， 29.6,29.3,22.7，19.4，14. 1 ;对于 C12H24N20[M+H]+计算的 HRMS(ESI-TOF)m/z 212. 1889,实 际值 212. 1318。
[0331] 3_&的制备。使用标准琼斯试剂(Jones)氧化条件将二氮杂环丙烯5的伯醇氧化 为相应的酸。4 NMR(400MHz，CDC13,25°C) = 2.28(d，2H，J = 4.4Hz)，1.53-1.51(m，2H)， 1. 26-1.17 (m，14H)，0. 84 (t，3H，J = 6.8Hz) ;13C NMR(100MHz，DMS0, 25 °C) = 177.3， 168. 9,52. 4,46. 3,31. 9,29. 6,29. 6,29. 6,29. 3,22. 7,19. 1，14. 1 ;对于 C12H22N202[M+H]+计 算的HRMS(ESI-T0F)m/z 226. 1681，实际值226. 1653。使用草酰氯将所述酸转化为相应 的酰基氯并偶联至（S)-a-氨基-Y-丁内酯，如之前所述E7' ES。虫NMR(400MHz，⑶Cl3， 25 °C):S =6.24(app s，lH)，4.57-4.47(m，2H)，4.32-4.29(m，lH)，2.88-2.85(m，lH)， 2. 27-2. 2 (m，3H)，1. 53 (t，2H，J = 6. 8Hz)，1. 26-1. 15 (m，14H)，0? 87 (t，3H，J = 6. 8Hz) ;13C NMR(100MHz，DMS0,25 °C ) : S = 190. 0,175. 4,168. 9,66. 3,49. 6,41. 4,32. 7,29. 6,29. 5， 29. 4,29. 2,24. 0,14. 3,14. 2(14 实际值）；对于 C16H27N303[M+H]+计算的 HRMS(ESI-T0F)m/z 309. 2052,实际值 309. 2039。
[0332] C.细菌实验
[0333] 将癌细朐暴露于细菌培养物.
[0334] 我们使用了这样的实验体系，其中由细菌释放的产物可以与真核靶标相互作用 同时避免细菌与组织培养物中的细胞的直接接触。将包含细菌培养物的插入物紧邻未用 TRAIL处理的或用TRAIL处理的（同时将TRAIL直接加入到GM培养基中）培养的肺癌细胞 放置。我们使用定制的插入物，所述插入物制备自切割的具有溶剂焊接的聚偏二氟乙烯膜 基底（PVDF Durapore 亲水性 O.lum 膜，Millipore VVLP09050)的聚苯乙稀管（14mm 直径 x25mm高）。为了制备这些插入物，将切割的聚苯乙烯管的一端浸入二氯甲烷中达5秒，并 将软化的塑料压在PVDF膜的切割部分的表面上达0. 5min。使软化的聚苯乙烯充分地流入 PVDF中从而形成不透水的粘合而不破坏膜孔结构。在使溶剂完全蒸发数小时后，将插入物 浸入1%次氯酸盐中达30分钟，之后用无菌盐水清洗6次（在层流净化罩中进行）。14_ 直径插入物最适合24孔板，插入物的内部区域覆盖孔表面的~70 %。
[0335] 我们使用原型0. 1 y m PVDF膜插入物用于研究，其中将组织培养物细胞暴露于来 源于铜绿假单胞菌PA01 (野生型）、PA01 A lasi、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、鲍氏不 动杆菌和大肠杆菌的可溶性产物。将细菌培养在BHI琼脂平板上，转移至接种培养物过夜， 之后1/100稀释到在125ml三角摇杯（baffled shake flask)中的20ml BHI肉汤中以用 于在37°C、250rpm温育4-6小时。将等量的后对数期培养物或对照BHI肉汤转移至PVDF 插入物，所述PVDF插入物被放置在含有在0. 5ml DMEM培养基中培养的目标细胞的24孔板 中。
[0336] 确宙细菌培养物中的C12浓度。格2-ml培养物用50 y 1 HC1酸化并加入10ml乙 酸乙酯，并将内含物剧烈混合。使各层分离，并取出5ml的乙酸乙酯层，用MgS04干燥，并在 真空中浓缩。将剩余物重悬在冷的甲醇中并浓缩以除去沉淀。通过LC-MS(液相色谱-质 谱）分析所得的甲醇溶液的C12含量。进行反相LC-MS分析（Agilent Zorbax柱，5ym， 300SB-C8,4. 6 X 50mm)，利用 MeCN-H20-0. 1 % 甲酸的梯度（0 至 lmin :5 % MeCN，lmin 至 9min :5% MeCN至98% MeCN的梯度，并且9至llmin :98% MeCN)，从而允许通过测量以下 离子来量化 C12 :298 (M+H+)、316 (M+H20+H+)、320 (M+Na+)和 338 (M+H20+Na+)。C12 在铜绿假 单胞菌PA01 (野生型）的样品中的浓度为约4. 3 y M(P < 0? 001，n = 5次独立实验）。
[0337] D?哺乳动物细胞激活
[0338] 细朐刺激。在所有实验中，如图例所示的，用LPS(100ng/ml)、AHL(10-25 uM :通常 BMDM和原代巨噬细胞用25yM C12刺激）或它们的组合来刺激BMDM。如果没有指示，则用 40ng/ml TNFa、20ng/ml TRAIL和10yM(在癌细胞的情况下）或25yM(在正常细胞的情 况下）AHL来刺激癌细胞和正常细胞。
[0339] E.细胞生存力和细胞凋亡评估?
[0340] 通过使用基于XTT的毒理学测定试剂盒（Sigma，St. Louis，MS)根据生产者的说明 来确定细胞毒性。对于一些实验，为了确认毒性的细胞凋亡性质，使用Annexin V-FITC细 胞凋亡检测试剂盒（Biovision，Mountain View，California)的方案和说明来分析细胞。 此外，通过比色测定（R&D System)来确定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、8和9活性，并且将 数据表示为与未处理或对照处理的细胞的值相比的倍数增加（n = 5)。
[0341] E引用的实验文献
[0342] (El)Mathison, J. C. ；Virca, G. D. ；ffolfson, E. ；Tobias, P. S. ；Glaser, K.； Ulevitch, R. J. J. Clin. Invest. 1990,85,1108.
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[0350] 本文中提及的所有专利和出版物（专利和非专利）通过引用结合于此，其程度与 将各个单独的出版物具体且个别地指定为通过引用完整地结合一样。
[0351] 已经使用的术语和表达用作说明而非限制的术语，并且在这样术语和表达的使用 中无意排除显示和描述的特征的任何等效物或其部分，而要认识到，多种改进在要求保护 的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解，虽然已经通过优选的实施方案和任选特征具 体公开了本发明，本文中公开的构思的更改和变化可以诉诸于本领域技术人员，并且这样 的更改和变化被认为是在如所附权利要求所限定的本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的式（I)的N-酰基高丝氨酸内酯 (AHL)类似物化合物：其中R是约9至约15个碳原子的直链烷基、烯基或炔基，所述烷基、烯基或炔基具有一 个或多个二氮杂环丙烯基，任选地在所述烷基、烯基或炔基上的4以上的位置处具有一个 或多个羰基，并且还任选地被叠氮基、羟基或卤素取代；或其药用盐；和，任选地， 药用赋形剂。2. 权利要求1所述的药物组合物，其中所述化合物具有式（II):其中R1是约7至13个碳原子的直链烷基、烯基或炔基，所述烷基、烯基或炔基任选地 具有以下各项中的一个或多个： (j) 二氮杂环丙烯基； (k) 一个或多个羰基；或 (l) 一个或多个独立地选择的叠氮基、羟基或卤素基团。3. 权利要求1所述的药物组合物，所述药物组合物还包含肿瘤调制剂，所述肿瘤调制 剂是TRAIL多肽。4. 权利要求1所述的药物组合物，其中所述N-酰基高丝氨酸内酯（AHL)类似物选自由 以下各项组成的组：5. -种治疗患者的肿瘤的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的式（I)的N-酰 基高丝氨酸内酯（AHL)类似物化合物，其中R是约9至约15个碳原子的直链烷基、烯基或炔基，所述烷基、烯基或炔基具有一 个或多个二氮杂环丙烯基，任选地具有一个或多个羰基，并且还任选地被叠氮基、羟基或卤 素取代；或药用盐；和任选地，药用赋形剂。6. 权利要求5所述的治疗患者的肿瘤的方法，其中所述化合物是式（II)的化合物，其中R1是约7至13个碳原子的直链烷基、烯基或炔基，所述烷基、烯基或炔基任选地 具有以下各项中的一个或多个： (g) 二氮杂环丙烯基； (h) -个或多个羰基；或 (i) 一个或多个独立地选择的叠氮基、羟基或卤素基团。7. 权利要求5所述的治疗患者的肿瘤的方法，所述方法还包括施用有效量的肿瘤调制 剂，所述肿瘤调制剂是TRAIL多肽。8. 权利要求5所述的治疗患者的肿瘤的方法，其中所述N-酰基高丝氨酸内酯（AHL)类 似物选自由以下各项组成的组：9. 权利要求5所述的治疗患者的肿瘤的方法，其中所述肿瘤选自由以下各项组成的 组：肺肿瘤、子宫颈肿瘤、乳腺肿瘤和脑肿瘤。10. -种式（I)的化合物：其中R是约9至约15个碳原子的直链烷基、烯基或炔基，所述烷基、烯基或炔基具有一 个或多个二氮杂环丙烯基，任选地在所述烷基、烯基或炔基上的4以上的位置处具有一个 或多个羰基，并且还任选地被叠氮基、羟基或卤素取代；或其药用盐。11. 权利要求10所述的化合物，其中所述化合物是式（II)的化合物，其中R1是约7至13个碳原子的直链烷基、烯基或炔基，所述烷基、烯基或炔基任选地 具有以下各项中的一个或多个： (g) 二氮杂环丙烯基； (h) -个或多个羰基；或 (i) 一个或多个独立地选择的叠氮基、羟基或卤素基团。12. 权利要求10所述的化合物，所述化合物为与肿瘤调制剂的药物组合，所述肿瘤调 制剂是TRAIL多肽。13. 权利要求10所述的化合物，其中所述N-酰基高丝氨酸内酯（AHL)类似物选自由以 下各项组成的组：14. 一种用于在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡、捕获细胞分裂或抑制细胞增殖的方法，所述 方法包括将所述细胞与有效量的N-酰基高丝氨酸内酯（AHL)化合物以及有效量的TRAIL 接触，其中所述AHL化合物具有式（I):其中R是约9至约15个碳原子的直链烷基、烯基或炔基，所述烷基、烯基或炔基具有一 个或多个二氮杂环丙烯基，任选地具有一个或多个羰基，并且还任选地被叠氮基、羟基或卤 素取代。15. 权利要求14所述的用于在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡、捕获细胞分裂或抑制细胞 增殖的方法，其中处于所述有效量的所述AHL类似物是所述肿瘤细胞中的未折叠蛋白反应 (UPR)、内质网膨胀（ERS)或两者的激活剂。16. 权利要求14所述的用于在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡、捕获细胞分裂或抑制细胞增 殖的方法，其中所述化合物是式（II)的化合物，其中R1是约7至13个碳原子的直链烷基、烯基或炔基，所述烷基、烯基或炔基任选地 具有以下各项中的一个或多个： (f) 二氮杂环丙烯基； (g) -个或多个羰基；和 (h) -个或多个独立地选择的叠氮基、羟基或卤素基团。17. 权利要求14所述的用于在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡、捕获细胞分裂或抑制细胞增 殖的方法，其中所述N-酰基高丝氨酸内酯（AHL)类似物选自由以下各项组成的组：
【专利摘要】本发明涉及在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡、捕获细胞周期或抑制细胞增殖或它们的任意组合的方法，所述方法通过向患者施用有效量的N-酰基高丝氨酸内酯类似物(AHL)，任选地联合肿瘤调制剂如肿瘤坏死因子(TNF)相关的细胞凋亡诱导配体(TRATL)进行。还提供N-酰基高丝氨酸内酯的新型生物活性类似物。
【IPC分类】A61K31/402
【公开号】CN105228618
【申请号】CN201480028681
【发明人】弗拉迪米尔·克拉夫琴科, 理查德·J·乌莱维特, 基姆·D·扬达
【申请人】斯克里普斯研究所
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2014年3月19日
【公告号】CA2907668A1, EP2976076A2, WO2014153415A2, WO2014153415A3