R是约9至约15个碳原子的直链烷基、烯基或炔基链，其可以结合二氮 杂环丙烯基、羰基或两者，并且可以进一步被如上所定义的基团取代。
[0055] 式（I)的化合物的一个实例是化合物（3_N2)
[0056]
[0057] 二氮杂环丙烯与酰基链的3-碳键接，并且通篇都使用该命名法。
[0058] 如明显的，手性中心存在于丁内酯环取代的位置处。因此，所述化合物可以为任一 构型，但是（S)-(3_N 2)化合物是优选的，其可以在结构意义上没有任何改变的情况下被不 同地显示为
[0059]
[0060] 两者都表示（S) _对映异构体。
[0061 ] 存在天然存在的AHL化合物
[0062]
[0063] 其可以在本发明方法的多个实施方案中使用，用于诱导肿瘤细胞中的细胞凋亡， 或用于治疗患有癌症的患者。
[0064] 如本领域中已知的，"盐"包括与抗衡离子结合的离子形式的有机化合物如羧 酸、磺酸或胺。例如，处于其阴离子形式的酸可以与阳离子如金属阳离子例如钠、钾等形成 盐；与铵盐如NH 4+或各种胺的阳离子，包括四烷基铵盐如四甲基铵，或其他阳离子如三甲基 锍等形成盐。"药用（药学上可接受的）"或"药理学可接受的"盐是由已被批准用于 人使用的并且通常是无毒性的离子形成的盐，如氯化物盐或钠盐。"两性离子"是内盐如 可以在具有至少两个可离子化基团（一个形成阴离子而另一个形成阳离子，其用于彼此平 衡）的分子中形成。例如，氨基酸如甘氨酸可以以两性离子形式存在。"两性离子"是本 文意义范围内的盐。本发明的化合物可以采取盐的形式。术语"盐"包括作为本发明的化 合物的游离酸或游离碱的加成盐。盐可以是"药用盐"。术语"药用盐"是指这样的盐，其 具有在药物应用中提供实用性的范围内的毒性分布。但是，药学上不可接受（不可药用） 的盐可以具有性质如高结晶度，其在本发明的实施中具有用处，如例如可用于本发明化合 物的合成、纯化或配制过程中。
[0065] 合适的药用酸加成盐可以制备自无机酸或有机酸。无机酸的实例包括盐酸、氢溴 酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸。合适的有机酸可以选自脂肪族、脂环族、芳族、芳脂族、 杂环、羧酸和磺酸类的有机酸，其实例包括甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、 苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡糖醛酸、马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、 苯甲酸、邻氨基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、双羟萘酸（扑酸）、甲磺酸、乙磺酸、 苯磺酸、泛酸、三氟甲磺酸、2-羟基乙磺酸、对甲苯磺酸、磺胺酸、环己基氨基磺酸、硬脂酸、 藻酸、羟基丁酸、水杨酸、半乳糖二酸和半乳糖醛酸。药学上不可接受的酸加成盐的实 例包括，例如，高氯酸盐和四氟硼酸盐。
[0066] 典型的组合物包含本发明的化合物和药用赋形剂（excipient)，所述药用赋形剂 可以是载体（carrier)或稀释剂（diluent)。例如，活性化合物通常将与载体混合或由载体 稀释，或被封装在载体内，其可以是安瓿、胶囊、小袋、纸或其他容器的形式。当将活性化合 物与载体混合时，或当载体充当稀释剂时，它可以是充当用于活性化合物的载体、赋形剂或 介质的固体、半固体或液体材料。活性化合物可以被吸附在例如容纳在小袋中的粒状固体 载体上。合适载体的一些实例是水、盐溶液、醇、聚乙二醇、多羟基乙氧基化的蓖麻油、花生 油、橄榄油、明胶、乳糖、白土（terra alba)、鹿糖、糊精、碳酸镁、糖、环糊精、支链淀粉、硬脂 酸镁、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯树胶、硬脂酸或纤维素的低级烷基醚、硅酸、脂肪酸、月旨 肪酸胺、脂肪酸甘油一酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、聚氧乙烯、羟甲基纤维素和聚乙 烯吡咯烷酮。类似地，载体或稀释剂可以包括本领域中已知的任何持续释放材料，如甘油一 硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，单独地或与蜡混合。
[0067] 所述制剂可以与不会与活性化合物发生有害反应的助剂混合。这样的添加剂可以 包括湿润剂、乳化剂和悬浮剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂和/或着色物质防腐剂、增甜 剂或调味剂。如果需要，所述组合物也可以被灭菌。
[0068] 给药途径可以是将本发明的活性化合物有效地运送至合适或所需的作用位点的 任何途径，如经口，经鼻，经肺，含服，皮下，皮内，透皮或肠胃外，例如，直肠，储库（depot)， 皮下，静脉内，尿道内，肌肉内，鼻内，眼科溶液或软膏，经口途径是优选的。
[0069] 如果将固体载体用于口服给药，则可以将制剂制成片剂，以粉末或小丸形式置于 硬明胶胶囊中，或其可以是药片或锭剂的形式。如果使用液体载体，则制剂可以是糖浆、乳 液、软明胶胶囊或无菌注射液如水性或非水性液体混悬剂或溶液的形式。
[0070] 注射剂型通常包括水混悬剂或油混悬剂，其可以使用合适的分散剂或湿润剂和悬 浮剂制备。注射形式可以为溶液相或是以混悬剂的形式，其用溶剂或稀释剂制备。可接受 的溶剂或载体包括无菌水、Ringer溶液或等渗盐水溶液。备选地，无菌油可以用作溶剂或 悬浮剂。优选地，油或脂肪酸是非挥发性的，包括天然或合成油、脂肪酸、甘油一酯、甘油二 酯或甘油三酯。
[0071] 对于注射，制剂也可以是适用于如上所述的用适当的溶液重构的粉末。这些的实 例包括但不限于，冷冻干燥、旋转干燥或喷雾干燥的粉末、非晶态粉末、细粒（granule)、沉 淀物或颗粒（particulate)。对于注射，制剂可以任选地含有稳定剂、pH调节剂、表面活性 剂、生物利用度改良剂及这些的组合。所述化合物可以被配制用于通过注射如通过推注或 连续注入的肠胃外给药。用于注射的单位剂型可以在安瓿中或在多剂量容器中。
[0072] 本发明的制剂可被设计成在通过采用本领域中已知的方法施用于患者后提供活 性成分的快速、持续或延迟的释放。因此，所述制剂也可以被配制成用于受控释放或用于缓 慢释放。
[0073] 本发明考虑的组合物可以包括，例如，胶束或脂质体，或一些其他包封形式，或可 以以延长的释放形式施用以提供延长的存储和/或递送效果。因此，所述制剂可以被压缩 成小丸或圆柱体并且被肌肉内或皮下植入以作为储库注射（depot injection)。这样的植 入物可以采用已知的惰性材料如硅酮和可生物降解的聚合物，例如，聚交酯-聚乙醇酸交 酯。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚（原酸酯）和聚（酸酐）。
[0074] 对于经鼻给药，制剂可以含有本发明的化合物，其溶解或悬浮在液体载体、优选含 水载体中，用于气溶胶应用。所述载体可以含有添加剂如增溶剂，例如，丙二醇，表面活性 剂，吸收促进剂如卵磷脂（磷脂酰胆碱）或环糊精，或防腐剂如对羟苯甲酸酯。
[0075] 对于肠胃外应用，尤其适合的是注射溶液或混悬剂，优选水溶液，其中活性化合物 溶解在多羟基化的蓖麻油中。
[0076] 具有滑石和/或碳水化合物载体或粘合剂等的片剂、糖锭剂或胶囊尤其适用于经 口应用。片剂、糖锭剂或胶囊的优选载体包括乳糖、玉米淀粉和/或马铃薯淀粉。在其中可 以采用增甜媒介物的情况下，可以使用糖浆或酏剂。
[0077] 可以通过常规压片技术制备的典型片剂可以含有：
[0078]核心:
[0079] 活性化合物(作为游离化合物或其盐）250mg胶体二氧化桂(Aerosil)? 1.5mg 微晶纤维素(Avicel)? 70mg 改性纤维素胶(Ae-Di-Sol)? 7.5 mg 硬脂酸镁 Ad.
[0080]包衣:
[0081] HPMC 约 9mg
[0082] *Mywacett 9-40T 约 0? 9mg
[0083] *用作用于薄膜包衣的增塑剂的酰基化的甘油一酯。
[0084] 典型的用于经口施用的胶囊含有本发明的化合物（250mg)、乳糖（75mg)和硬脂酸 镁（15mg)。使该混合物通过60目筛并且将其装入1号明胶胶囊中。典型的可注射制剂通 过将250mg本发明的化合物无菌地放入到小瓶中，无菌地冻干并且密封制备。对于使用，将 小瓶的内容物与2mL无菌生理盐水混合，以制备可注射制剂。
[0085] 本发明的化合物可以被施用至需要对不良状况进行这样的治疗、预防、消除、减轻 或改善的哺乳动物，尤其是人。这样的哺乳动物还包括动物，家养动物例如家庭宠物、农场 动物以及非家养动物如野生动物。
[0086] 本发明的化合物在宽的剂量范围内是有效的。例如，在成人的治疗中，可以使用约 0. 05至约5000mg，优选约1至约2000mg，并且更优选约2至约2000mg/天的剂量。典型的 剂量是约l〇mg至约lOOOmg/天。在选择用于患者的治疗方案中，可能常常需要以较高的剂 量开始并且当症状得到控制时减小剂量。准确的剂量将取决于化合物的活性、给药形式、所 需的疗法、施用的形式、待治疗的受试者以及要治疗的受试者的体重，以及负责的医生或兽 医的偏好和经验。
[0087] 通常，本发明的化合物被分配在单位剂型中，其包含每单位剂量约0.05mg至约 lOOOmg活性成分以及药用载体。
[0088] 通常，适用于经口施用、经鼻施用、肺施用或透皮施用的剂型包含约125 yg至约 1250mg，优选约250 y g至约500mg，并且更优选约2. 5mg至约250mg的所述化合物，该化合 物与药用载体或稀释剂混合。
[0089] 剂型可以每日施用，或每天超过一次，如每日两次或三次。备选地，如果开处方的 医生认为是可取的，则剂型可以以低于每天的频率施用，如每隔一天一次，或每周一次。
[0090] 详沭
[0091] 我们考察了革兰氏阴性细菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)，其是一 种仅能够促进具有缺陷的免疫系统功能的宿主中的感染的机会性致病菌（Smith，R.S.和 Iglewski, B. H. (2003)Pseudomonas aeruginosa quorum sensing as a potential antimicrobial target(铜绿假单胞菌定额感测作为潜在的抗微生物祀标）.J Clin Invest 112,1460-5)。因为化合物（C12)
[0092]
[0093] 是由该细菌大量产生的信号传导分子，我们考察了野生型铜绿假单胞菌或缺少 Iasi (负责合成化合物（C12)的基因）的突变体菌株是否能够使肺癌细胞易感于TNF-或 TRAIL诱导的聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP)的裂解（其是细胞凋亡的指示特征）。令人激 动地，仅在细胞接受TRAIL和野生型细菌的组合时才检测到PARP裂解（图lib)，这表明化 合物（C12)是癌细胞中的TRAIL诱导的细胞凋亡所需要的。值得注意的是，在将其他AHL生 产细菌添加至细胞因子刺激的细胞时观察到类似的结果，而不具有AHL合酶的细菌没有效 果。此外，滴定实验证实，直接添加C12或若干天然存在的AHL类似物导致对TNF或TRAIL 的强烈促细胞凋亡反应，并且与我们的细菌实验一致，细胞对TRAIL更敏感（图11c)。
[0094] 因为NF-kB信号传导的激活抑制细胞凋亡，所以观察到的TNF和TRAIL的促细 胞凋亡作用方面的差异可能与这些细胞因子调节NF-kB活性的不同能力相关。与这种解 释相一致，对iKBa (NF-kB信号传导的一种指示性生化标志）的降解和再合成的蛋白质 印迹分析揭示响应于TNF而不响应于TRAIL的强烈NF-kB信号传导的激活。虽然响应于 TRAIL或化合物（C12)没有诱发NF-kB或细胞凋亡信号传导的调节，但是IkBa水平的显 著变化与用化合物（C12)和TRAIL的组合刺激的肺癌细胞中的PARP裂解相匹配（图lid)。 令人感兴趣的是，我们还观察到TRAIL和化合物（C12)的组合作用导致丝裂原活化的蛋白 激酶（MAPK)p38的延长激活，如通过对磷酸化形式的p38进行的蛋白质印迹分析所确定的 (图lld;p-p38)。这些发现表明化合物（C12)通过调节NF-kB、P38或两者的信号传导过 程增强TRAIL在癌细胞中执行细胞凋亡的能力。
[0095] 尽管表达TRAIL受体，但正常细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡有抗性。类似于非转 化的细胞，许多恶性细胞对TRAIL的促细胞凋亡作用不敏感或仅部分敏感。因此，为了评 估化合物（C12)作为依赖于TRAIL的肿瘤免疫监视的调质的选择性，我们比较了若干种癌 细胞系和正常细胞对TRAIL和化合物（C12)的敏感性。与我们之前的观察结果相一致，在 用化合物（C12)和TRAIL的组合刺激的肺、结肠和乳腺癌细胞中观察到PARP裂解的大量诱 导。相反，来自正常供体的人肝细胞以及其他来自正常组织的原代细胞对相同的处理有抗 性（图12a和12c)。重要地，癌细胞用TRAIL加上化合物（C12)的更长时间处理显著降低 其生存力，尽管没有注意到对正常细胞的存活性的作用（图12b和12d)。
[0096] 虽然这些数据证明了化合物（C12)作为依赖于TRAIL的抗癌活性的增强剂的治疗 潜力，但是仍然需要解决关于（C12)介导的对免疫细胞（如原代巨噬细胞）的促细胞凋亡 作用的问题。考虑到与C12相关的可能的固有药代动力学不利条件，针对来源于骨髓的巨 噬细胞和TRAIL处理的肺癌细胞测试了较小的一系列化合物（C12)类似物。从这些研究中， 发现缺少3-氧代部分的AHL在两种测定中都完全无活性；然而，发现被称为化合物（3-N 2) 的化合物（C12)的含3-二氮杂环丙稀（diazirine)的衍生物，
[0097]
[0098] 所提及的是其（S)_对映异构体，其中二氮杂环丙烯环（即，含有在两个氮原子之 间的双键）代替了化合物（C12)的羰基；（结构、合成和表征数据参见以下实施例），对巨噬 细胞无毒性，但是以与母体分子类似的方式显示对TRAIL处理的癌细胞的毒性。此外，我们 还观察到化合物（C12)和化合物（3-N 2)对TRAIL抗性癌细胞中的TRAIL诱导的PARP裂解 的相当的作用（图13a)。
[0099] 为了更好地定义AHL介导的对TRAIL的促细胞凋亡作用的效果和（C12)或化合物 (3-N 2)的激动潜力之间的结构-活性关系，通过对PARP裂解、p38的激活以及真核翻译起 始因子2 a (eIF2 a )的磷酸化（响应于C12及其3-氧代-类似物的哺乳动物细胞活化的 区别特征）的蛋白质印迹分析考察了巨噬细胞对这些化合物的反应。对化合物（C12)和化 合物（3_N 2)的激动活性的比较揭示两种化合物以类似的方式诱导eIF2 a磷酸化；然而，化 合物（3_N2)不诱导p38磷酸化和PARP裂解（图13b)，这表明除了如之前公开的刺激噬菌 活性以外，P38通路的激活还促进AHL诱导的细胞凋亡。
[0100] 除了其激动活性以外，化合物（C12)还在多种细胞类型中抑制对TNF、LPS和其他 TLR配体的炎性反应。在巨噬细胞中，C12的抗炎活性干扰NF-kB靶基因如IkB a和TNF 的可诱导的表达。我们的结果还表明IkBa依赖性NF-kB信号传导的AHL介导的破坏使 得癌细胞易感于TNF和TRAIL诱导的细胞凋亡（见图lid)。因此，为了考察化合物（3-N 2) 是否影响刺激物诱导的NF-kB信号传导，我们比较了用LPS或其与化合物（C12)或化合 物（3_N2)的组合活化的巨噬细胞中IkBa表达的动力学。令人奇怪的是，虽然在化合物 (C12)的存在下（在化合物（3-N2)存在下则没有）观察到预期的PARP的促细胞凋亡裂解， 但是两种化合物都可以同样有效地阻断IkB a的LPS诱导的再合成（图13c)。此外，从对 化合物（C12)和化合物（3-N2)对TNF的LPS诱导的产生的抑制作用的比较，同样明显的是 其抗炎活性间的相似性（图13d)。这些实验表明化合物（3-N 2)对休眠的或炎症激活的巨 噬细胞是无毒性的；然而，它保持了 C12调节LPS诱导的NF-kB信号传导的能力。
[0101] TNF是负责LPS诱导的肿瘤生长的关键炎性介体，并且TNF的促生长活性依赖于 NF-kB活化。最重要地，使用LPS诱导的肿瘤生长的小鼠模型的实验表明，癌细胞中TNF介 导的NF-kB信号传导的抑制将炎症诱导的肿瘤生长转变为由内源性TRAIL介导的炎症诱 导的肿瘤退化。为了确定AHL是否能够增强TRAIL在炎症激活的癌细胞中的抗癌活性，我 们考察了非最优浓度的TRAIL对在用TNF和化合物（3-N 2)的组合处理的癌细胞中的PARP 裂解的作用。蛋白质印迹分析揭示，在化合物（3_N2)存在下用TNF刺激的癌细胞中出现依 赖于TRAIL的PARP裂解，并且显著地，TRAIL介导的细胞凋亡反应与TNF诱导的NF-kB信 号传导的破坏一致（图13e).
[0102] 总之，对作为"TRAIL增强剂"的化合物（C12)及其类似物如化合物（3-N2)以及这 些化合物通过调节NF-kB信号传导而抑制促炎症反应的能力的鉴定，为选择性杀死癌细 胞提供了原理论证的应用。值得注意地，化合物（3_N 2)对癌细胞中的TRAIL诱导的细胞凋 亡的协同作用与抗癌剂硼替佐米（bortezomib)的作用相当；然而，与硼替佐米不同，化合 物（3_N2)(单独的或与TRAIL组合）对来源于正常供体的组织的人肝细胞是没有毒性的。 癌症和炎症的联系表明在癌症治疗和预防中使用抗炎剂如NF-kB的抑制剂可以获得很大 的好处。
[0103] 因此，在多个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含有效 量的式⑴的N-酰基高丝氨酸内酯（AHL)类似物化合物：
[0104]
[0105] 其中R是约9至约15个碳原子的直链烷基、烯基或炔基，所述烷基、烯基或炔基具 有与其键接的一个或多个二氮杂环丙烯基，任选地在所述烷基、烯基或炔基上的4以上的 位置处具有一个或多个羰基，并且还任选地被叠氮基、羟基或卤素取代；或其药用盐；和， 任选地，
[0106] 药用赋形剂。
[0107] 对于关于对任选地在所述烷基、烯基或炔基上的4以上的位置处具有一个或多个 羰基的陈述，位置编号（例如，4)是指与氧原子键接的酰基链的碳编号（例如，在酰基链的 位置4处）。酰基链与高丝氨酸内酯氨基形成酰胺键从而提供AHL化合物。
[0108] 例如，AHL化合物可以具有式（II)
[0109]
[0110] 其中R1是约7至13个碳原子的直链烷基、烯基或炔基，所述烷基、烯基或炔基任 选地具有以下各项中的一个或多个：
[0111] (d)二氮杂环丙烯基；
[0112] (e) -个或多个羰基；或
[0113] (f) -个或多个独立选择的叠氮基、羟基或卤素基团。
[0114] 在多个实施方案中，本发明的药物组合物还可以包含肿瘤调制剂，所述肿瘤调制 剂是TRAIL多肽。
[0115] 更具体地，N-酰基高丝氨酸内酯（AHL)类似物选自由以下各项组成的组：
[0116]
[0117] 在多个实施方案中，本发明提供一种治疗患者的肿瘤的方法，所述方法包括向所 述患者施用有效量的式（I)的N-酰基高丝氨酸内酯（AHL)类似物化合物，
[0118]
[0119] 其中R是约9至约15个碳原子的直链烷基、烯基或炔基，所述烷基、烯基或炔基具 有一个或多个二氮杂环丙烯基，任选地具有一个或多个羰基，并且还任选地被叠氮基、羟基 或卤素取代；或药用盐；和任选地，药用赋形剂。例如，所述化合物可以是式（II)的化合物，
[0120]
[0121] 其中R1是约7至13个碳原子的直链烷基、烯基或炔基，所述烷基、烯基或炔基任 选地具有以下各项中的一个或多个：
[0122] (a)二氮杂环丙烯基；
[0123] (b) -个或多个羰基；或
[0124] (c) 一个或多个独立选择的叠氮基、羟基或卤素基团。
[0125] 本发明的方法还可以包括施用有效量的肿瘤调制剂，所述肿瘤调制剂是TRAIL多 肽。更具体地，N-酰基高丝氨酸内酯（AHL)类似物可以选自由以下各项组成的组：
[0126]
[0127] 例如，可以根据本发明的方法治疗的肿瘤可以选自由以下各项组成的组：肺肿瘤 (lung tumor)、子宫颈肿瘤（cervical tumor)、乳腺肿瘤（breast tumor)和脑肿瘤（brain tumor)〇
[0128] 在多个实施方案中，本发明提供一种用于在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡、捕获细胞 分裂或抑制细胞增殖的方法，所述方法包括将细胞与有效量的N-酰基高丝氨酸内酯（AHL) 化合物和有效量的TRAIL接触，其中所述AHL化合物具有式（I):
[0129]
[0130] 其中R是约9至约15个碳原子的直链烷基、烯基或炔基，所述烷基、烯基或炔基具 有一个或多个二氮杂环丙烯基，任选地具有一个或多个羰基，并且还任选地被叠氮基、羟基 或卤素取代。例如，在多个实施方案中，有效量的A