胞完整同时诱导癌细胞自毁，则鞘脂介导的细胞 凋亡信号传导的增强可以阻止疾病自任何阶段进展。
[0243] 在这点上，C12影响Sph代谢的能力（见以上图2)表明，C12通过选择性激活转化 的细胞或炎症破坏的细胞，如产生肿瘤坏死因子（TNF)(-种炎性细胞因子）的巨噬细胞中 的细胞凋亡而充当潜在的癌症终止剂和癌症预防剂。与该假设一致，我们之前发表的数据 揭示了 C12处理骨髓细胞导致细胞凋亡的快速诱导，而非骨髓细胞显示明显延迟的动力学 和细胞凋亡标志表达的减少（见Kravchenko等，2006 ;参考文献#12中的图3)。
[0244] 为了进一步验证该假设，我们比较了乳腺癌细胞系MCF7对由TNF、C12或它们的组 合诱导的细胞凋亡的敏感性。在这些实验中，我们使用MCF7的对照变体（载体）以及稳定 表达细胞凋亡的负向调节物如Bcl-2和CLARP的MCF7细胞；Bcl-2是一种内部细胞凋亡通 路的抑制剂，而CLARP抑制依赖于受体的细胞凋亡信号传导，也被称为外部细胞凋亡通路。 将细胞与TNF、C12或它们的组合温育，并且通过蛋白质印迹分析蛋白提取物的PARP裂解 (一种指示细胞凋亡的生化标志） 26。如预期的，对照和MCF7/Bcl-2细胞与TNF的延长的温 育诱导PARP裂解，而MCF7/CLARP细胞对TNF介导的细胞凋亡具有抗性（图3A)。相反，三 种细胞系都显示对C12的敏感性；并且，C12和TNF之间的协同作用在用两种刺激物的组合 处理的三种细胞系中都是明显的（图3B)。
[0245] 通过使用正常人支气管上皮细胞和作为转化的细胞的实例的HeLa细胞系进行类 似的实验。我们观察到HeLa和正常细胞对TNF的促细胞凋亡作用都具有抗性（图3C和 3D)。正常细胞还显示对C12及其与TNF的组合的抗性（图3D)，虽然单独的C12在HeLa细 胞中诱导PARP裂解。值得注意地，在HeLa细胞中在TNF和C12之间观察到强的协同作用 (见图3C)。因此，这些数据进一步支持我们的假设，即C12诱导癌细胞的细胞凋亡，而正常 细胞相对地对C12或其与TNF的组合具有抗性。此外，两种刺激物-C12和TNF-协同作用 于癌性细胞，而正常细胞保持完整。
[0246] TRAIL和C12或类似物的组合协同地杀死癌性细胞.
[0247] 在有前景的癌症疗法的候选中的是肿瘤坏死因子（TNF)相关的细胞凋亡诱导配 体（TRAIL)。类似于TNF家族的其他成员，TRAIL通过受体介导的机制（也被称为外部细 胞凋亡通路）启动细胞凋亡。对比于其他天然存在的促细胞凋亡配体如TNF和Fas配体 (FasL)，将TRAIL注入小鼠中不会引起致死反应或对组织和器官的可检测的毒性 27 29。此 外，TRAIL用于杀死癌细胞的潜在的有效性已经得到动物模型中的研究的支持，所述研究证 明该细胞因子对人肿瘤异种移植物具有选择性毒性，但是对正常组织却没有 28'29。然而，对 TRAIL诱导的细胞凋亡的敏感性是限制TRAIL治疗的效力的关键因素，因为敏感性谱在不 同的恶性细胞中变化 27'28'3°。此外，类似于正常细胞，一些癌细胞也对TRAIL诱导的细胞凋 亡具有抗性，尽管细胞对TRAIL介导的作用的敏感性和抗性的基础未被全面了解。
[0248] 增加的对细胞凋亡的分子细节的了解表明肿瘤细胞可以通过干扰外部或内部细 胞凋亡信号传导通路来获得对细胞凋亡的抗性，这通常伴有细胞生长控制的缺陷或/和存 活通路如NF-kB和Akt信号传导级联的抗细胞凋亡活性的增加。实际上，如果通过能够克 服这样的抗细胞凋亡活性的机制被触发，则大部分癌细胞保持进行细胞凋亡的能力。例如， 抑制NF-kB活性显著增加由细胞凋亡刺激物诱导的细胞凋亡31 34。此外，在激活若干细胞 内非细胞凋亡信号传导过程后也发生细胞凋亡增强，所述过程包括JNK通路或内质网（ER) 应激，其在真核细胞中被称为未折叠蛋白反应（UPR) 11。引人注目地，近来的观察结果揭示 UPR激活剂如衣霉素（Tm)、毒胡萝卜内酯（Tg)和RRR-a -生育酚醚连乙酸类似物（a -TEA) 使癌细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡敏感35 37。然而，这些试剂诱导组成性的和持续的UPR激 活，这通常导致依赖于线粒体的内部细胞凋亡通路的诱导38 4°，甚至是在不存在促细胞凋亡 刺激物如TRAIL的情况下37'4°。
[0249] 现代对宿主和微生物群之间的亲密联合的理解41，表明微生物已经进化出巧妙的 和选择性的策略以与宿主生物学协调 1>42。正常地很多细菌产物诱导炎性过程，其是通常与 癌症和自体免疫病的发展相关的风险因素17' 43。然而，对于其他细菌分子则不是这样。例 如，我们近来的发现揭示C12具有强的抗炎活性17。此外，对C12还诱导UPR的认识促使我 们去探索其作为抗癌疗法的补充的潜力。
[0250] 为了验证该假设，我们在体外考察了 C12对TRAIL针对来源于人肺癌样品的A549 细胞系的活性的作用。与报道的关于A549细胞的观察一致28 (Ashkenazi A等，1999)，体 外添加TRAIL(50ng/ml)到培养的A549细胞中并不明显影响其生存力和生长。然而，当将 TRAIL(50ng/ml)和C12(l yM)的组合添加至培养基时，A549细胞的生存力显著下降（图 4)，尽管在存在C12 (1 y M或25 y M)，其非天然的立体异构体C12R (25 y M)或TRAIL (50ng/ ml)和C12R(25 yM)的组合的情况下，细胞生长和生存力实际上不改变（图4A)。滴定实验 揭示在含有100nM C12和50ng/ml TRAIL的培养基中温育24小时后，超过50%的细胞丧失 其生存力（图4B)。这些数据支持我们的假设，即对TRAIL介导的细胞凋亡的抗性可以在 C12的存在下被克服。
[0251] 为了确定C12是否增加TRAIL针对癌性细胞的促细胞凋亡作用，我们通过针对与 细胞凋亡和细胞生长的调节以及细胞应激应答相关的若干生化参数的蛋白质印迹分析比 较了 A549细胞对TRAIL、C12或TRAIL+C12的反应。即，聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP)和 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的裂解被用作指示由外部和内部细胞凋亡通路两者诱导的过 程的两种共同的标志 26'44;我们还考察了作为指示内部细胞凋亡通路的标志的半胱氨酸天 冬氨酸蛋白酶-9的裂解 45;通过分析JNK的磷酸化来测试蛋白激酶JNK通路的激活（一种 与细胞生长控制相关的哺乳动物应激反应的标志46 4S)。为了监测C12的活性，我们分析了 eIF2a的磷酸化（ER应激的独特特征n'49)和蛋白激酶p38的磷酸化（一种哺乳动物应激 反应的另外标志 5°)。这些实验的结果揭示利用C12的刺激导致快速且强烈的应激反应的激 活，其中全部三种标志的动力学都类似，尽管在测试的任何时间点都没有诱导细胞凋亡信 号传导（图5)。相反，对于eIF2 a磷酸化的激活和应激反应的其他标志，TRAIL处理当然 是平静的，而我们在6小时时间点几乎没有观察到可检测的p38和JNK磷酸化；并且，我们 观察到预期的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的激活，其导致随后的PARP裂解（见图5)。值 得注意地，在后面的时间点，细胞凋亡和应激反应标志的显著变化在用TRAIL和C12的组合 处理的细胞中是明显的（图5;比较2小时和6小时时间点）。
[0252] 对一组其他癌性细胞和正常细胞进行的类似研究证实了这些观察结果并且显示 C12显著地使不同的癌细胞对TRAIL介导的细胞凋亡敏感，而正常细胞是完全具有抗性的 (图6、图7和表2)，这与我们之前在使用TNF而不是TRAIL的情况下的观察结果相一致（见 以上图3)。因此，C12-和TRAIL-或TNF介导的信号传导之间的相互协同作用导致针对癌 细胞的显著促细胞凋亡作用，这表明应用C12可能揭开新的抗癌治疗策略。
[0253] 硼替佐米（bortezomid)(也被称为万河（velcade))是一种抗癌药物，其强效地使 癌细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡敏感 51 53。因此，为了评估C12用于抗癌治疗的潜在效用， 我们比较了这两种化合物-(C12)和硼替佐米（bartezomid) (Bor)-对癌症A549细胞和原 代人肝细胞中TRAIL介导的细胞凋亡的作用。在存在Bor或（C12)的情况下观察到A549 细胞对TRAIL的敏感性的类似增加（图8A，上图）；并且，响应于TRAIL与Bor或（C12)的 组合，类似水平的PARP裂解（一种细胞凋亡标志）被诱导（图7,下图）。在TRAIL存在下 正常人肝细胞的生存力未改变（图8B，上图）；并且，TRAIL处理的肝细胞没有显示细胞凋 亡的迹象（图8B，下图）。对Bor处理的样品的类似考察揭示虽然单独的该药物显示较低 水平的对肝细胞的毒性，但是在TRAIL存在下Bor介导的毒性以及Bor诱导的细胞凋亡显 著增强（见图8B)。相反，在（C12)或其与TRAIL的组合存在下，肝细胞实际上是健康且完 整的（见图8B)。因此，（C12)具有有效的抗癌活性同时对非癌性细胞不具有明显的毒性。
[0254] 因为（C12)是3-氧代-AHL家族的原型成员，所以有理由进行结构-活性-关系 (SAR)研究以确定癌症终止和癌症预防活性以及UPR激活所需的AHL的一般结构特征。为 了解决该问题，合成了一组AHL及其类似物（见AHL和类似物的列表），并且考察所有化合 物对一组癌性细胞和正常细胞的生物活性。所选类似物的生化数据的原型实例显示在图9 和图10中，而表2概述了对所有化合物的SAR研究。这些全面的SAR研究鉴定了（C12)的 数种类似物（13、15和16,见下表1)，其具有与（C12)类似的对哺乳动物细胞的作用。此外， 类似于（C12)，全部三种类似物都强效地使多种癌细胞对TRAIL介导的细胞凋亡敏感，这表 明其应用可以产生新抗癌治疗策略。
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