抗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9型（抗PCSK9）化合物及其用于治疗和/或预防心 ...的制作方法
【专利说明】抗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9型（抗PCSK9)化 合物及其用于治疗和/或预防心血管疾病的方法
[0001] 相关申请的的夺叉参考
[0002] 本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请号61/789867的权益，其全部 内容通过引用并入本文。
[0003] 关于联邦咨助的研究或开发的声明
[0004] 在国家心脏、肺和血液研究所（NHLBI)的支持下根据SBIR批准号 1R43HL096167-01作出本发明。美国政府对本发明具有一定的权利。 发明领域
[0005] 本发明涉及调节前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9型（PCSK9)的生理作用 的化合物，包括其与低密度脂蛋白受体（LDLR)的相互作用。更具体地说，本发明涉及包含 PCSK9功能的小分子调节剂的组合物以及使用这些调节剂作为药物的方法。PCSK9功能的 小分子调节剂可在治疗上用于降低血液中的LDL-胆固醇水平，并且可以用于预防和/或治 疗胆固醇和脂蛋白代谢紊乱，包括家族性高胆固醇血症、导致动脉粥样硬化的血脂异常、动 脉粥样硬化，和更通常的，心血管疾病（CVD)。
[0006] 发明背景
[0007] 心血管疾病是导致死亡的原因，而动脉粥样硬化是心血管疾病的首要原因。动脉 粥样硬化是动脉的疾病并且导致与工业化国家的许多死亡相关的冠状动脉心脏疾病。现 在已确定冠状动脉心脏疾病的几个危险因素：血脂异常，高血压，糖尿病，吸烟，不良饮食习 惯，缺乏运动和压力。血脂异常是血浆胆固醇（高胆固醇血症）和/或甘油三酯（TGs)的提 高或低的高密度脂蛋白（HDL)水平，这促使动脉粥样硬化发病。它是一种经证明促进心血 管疾病的代谢疾病。在血液中，胆固醇在脂蛋白颗粒中运送，其中，低密度脂蛋白（LDL)胆 固醇（LDL-C)被认为是"坏的"胆固醇，而HDL-胆固醇（HDL-C)被称为"好的"胆固醇。由 于胆固醇对动脉粥样硬化的影响，脂质和脂蛋白异常在一般人群中极为常见，并且被认为 是心血管疾病的高度可改变的危险因素。虽然用他汀类药物治疗（护理动脉粥样硬化的现 行标准），60-70 %的心血管事件、心脏病发作和中风发生，因此，存在关于CVD的长期感到 显著未满足的需求。此外，新的指南建议应该实现更低的LDL水平以保护高危患者免受过 早的 CVD(l)。
[0008] 在PCSK9和胆固醇代谢之间的联系建立之后，很快就发现PCSK9基因中的选定突 变引起常染色体显性高胆固醇血症（2)，这表明突变通过增加PCSK9的正常活动而赋予功 能获得（gain-of-function) (3)。这通过野生型和突变PCSK9(S127R和F216L)在小鼠的肝 脏中高水平地表达的实验得到支持；接受野生型或突变PCSK9的小鼠的肝LDLR蛋白水平急 剧下降（4,5)。未观察到LDLR mRNA水平的相关降低，表明突变或野生型PCSK9的过表达通 过转录后机制降低LDLR。
[0009] 由于PCSK9的功能获得型突变导致高胆固醇血症，那么产生功能缺失型突变是否 具有相反的效果并导致低胆固醇血症的疑问是合乎情理的。在非裔美国人中确定了 PCSK9 的三个功能缺失型突变（6)。这些突变降低LDL-C水平28%，并显示出降低CHD的频率 (解释为心肌梗塞，冠心病死亡或冠状动脉血管重建）88%。Rashid等人（7)研究了其中 灭活PCSK9的小鼠中功能缺失型突变的机制。他们报告说，这些基因敲除小鼠显示增加 的肝脏LDLR蛋白（而不是mRNA)，增加的循环脂蛋白的清除以及降低的血浆胆固醇水平。 PCSK9的天然存在的突变的结构功能关系分析也已经提供了对PCSK9的作用机制的深刻理 解。有趣的是，被发现与LDL-C血浆水平的最大降低相关的PCSK9的突变是通过扰乱其合 成（Y142X)、自催化处理（L253F)或折叠（C679X)而防止成熟PCSK9分泌的那些（8)。Y142X 突变不产生可检测的蛋白，因为其早在转录时发生并且据预计启动无义介导的mRNA降解。 催化结构域（L253F)的突变干扰蛋白质的自催化切割。表达PCSK9-253F的细胞与表达 PCSK9-WT的细胞相比，成熟蛋白质的量降低，这表明突变抑制自催化切割。L253F突变接近 催化三联体（PCSK9是一种丝氨酸蛋白酶），因此它可能干扰活性位点（8)。由于蛋白质从 ER输出需要PCSK9的自催化切割，L253F突变延迟PCSK9从ER传输到细胞表面。PCSK9中 的无义突变（C679X)，其截断蛋白质14个氨基酸，不干扰蛋白质加工，但成熟蛋白在细胞中 积聚并且不分泌，这表明该蛋白正常地裂解但被错误折叠，并保留在ER中（8,9)。
[0010] 尚未完全阐明PCSK9引起LDLR降解的机制。然而，很明显LDLR降解不需要PCSK9 的蛋白酶活性（10,11)。Li等人（10)已经共同表达了前结构域和反式的催化结构域，并表 明所分泌的PCSK9无催化活性，但在降低细胞LDL摄取和LDLR水平方面它功能上等同于野 生型蛋白。McNutt等人（11)也报道了类似的研究。此外，Zhang等人（12)已经绘制PCSK9 结合到LDLR的EGF-A重复，并且表明这样的结合降低了受体回收并增加其降解。他们还报 道了与EGF-A结构域的结合是钙依赖性的，并且随着pH从7降低到5. 2显著地减少。最 近，Kwon等人（13)确定了与LDLR-EGF-AB(EGF-A和EGF-B)复合的PCSK9的晶体结构。该 结构显示明确界定的EGF-A结构域，但EGF-B结构域是无序的并且未出现在它们的电子密 度图中。EGF-A结构域在远离催化位点的位点处与PCSK9催化结构域结合，并且不与C末端 结构域或前结构域（14)接触。
[0011] 已经为靶向PCSK9提出了若干策略（15)。策略1 :mRNA基因敲除方法包括使用反 义寡核苷酸或RNAi。对小鼠施用的反义寡核苷酸将PCSK9表达降低了 >90 %并将血浆胆固 醇水平降低了 53% (16)。对食蟹猴单次静脉注射在类脂质（lipidoid)中递送的RNAi将 血浆PCSK9水平降低了 70%并将血浆LDL-C水平降低了 56% (17)。策略2 :用小分子、肽 或针对PCSK9的抗体防止PCSK9与LDLR在细胞表面上结合。添加EGF-A片段到培养细胞 抑制外源添加的PCSK9介导LDLR降解的能力。策略3 :开发PCSK9加工的小分子抑制剂。 尽管有证据表明LDLR降解不需要PCSK9的催化活性（11)，PCSK9催化活性的细胞内抑制剂 应该是有效的，因为蛋白质从ER分泌需要PCSK9的自催化加工。在其合成之后，PCSK9进 行脱去前结构域的自催化裂解反应，但前结构域仍然连接催化结构域（18,19)。PCSK9的分 泌需要自催化加工步骤（20)，可能是因为前结构域充当分子伴侣和促进折叠。前结构域的 持续连接部分地阻断PCSK9的底物结合口袋（18,19)。McNutt等人（21)证明分泌的PCSK9 的拮抗作用增加HepG2细胞中的LDLR表达。他们表明，导致功能获得型突变的相关的 LDLR等位基因（H306Y)是由于PCSK9与LDLR的亲和力增加，这将导致增强的LDLR破坏， 和降低的血浆LDL-C清除。另外，他们能够优雅地表明用LDLR(H306Y)亚片段阻断分泌的 PCSK9导致培养IfepG2细胞的LDLR水平的增加。因此，PCSK9充当引起LDLR降解的分泌因 子，并且干扰自催化过程的小分子抑制剂应该减少成熟分泌的PCSK9的量。本发明涉及使 用策略2识别下调PCSK9的功能的小分子。
[0012] 最近（22-24)，Regeneron/Sanofi和Amgen已经报道了证实单克隆抗体阻断PCSK9 的第二阶段概念验证数据，作为使不受标准他汀类药物治疗控制的患者的LDL-C降低的策 略。他们报告说，单次注射他们的称为REGN727的药物，在临床试验中削减LDL水平超过 60%。他们的方法遵循使用抗体而不是小分子的策略2。该策略2也正由Merck、Novartis 和Pfizer公司进行，而策略1正由Alnylam、Idera和Santaris进行（25)。
【发明内容】
[0013] 本发明涉及选择性地与PCSK9功能相互作用并且下调PCSK9功能的小分子的治疗 应用。在第一实施方案中，在本发明的实行中使用的试剂具有下面的通式：
[0014]
[0015] 其中A选自由以下组成的组：
[0016]
[0017] 其中R1，R2和R3独立地选自由H和任选取代的低级烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、 杂环和杂芳基组成的组；R4选自由H、低级烷基、0H、SH、NH2、卤素、CN、羰基、酰氨基（amido) 和羧酰氨基（carboxamido)组成的组；
[0018] X是（CH丄、0、S、N(R5)或价键；R5是H或低级烷基；以及n是1-3的整数；
[0019] M 是 CONH、NHCO、NHS02、NHC0N(R6)或价键；R6是 H 或低级烷基；
[0020] Q独立地为CH或N ;
[0021] Z 是 CH2、S、0 或 NH;
[0022] m和p独立地是0-1的整数；
[0023] B选自由C( = 0)和S( = 0)2组成的组；T选自由H、氨基、烷氧基、羧基，酰氨基、 氣基幾基、单烷基氣基幾基、^烷基氣基幾基、单烷基氣基亚横醜基、^烷基氣基亚横醜基、 单烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、羟基磺酰氧基、烷氧基磺酰氧基、 烷基磺酰氧基、羟基磺酰基、烷氧基磺酰基、烷基磺酰基烷基、单烷基氨基磺酰基烷基、二烷 基氨基磺酰基烷基、单烷基氨基亚磺酰基烷基、二烷基氨基亚磺酰基烷基和任选取代的低 级烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环和杂芳基组成的组；
[0024] &和R b独立地代表H或者低级烷基，以及t，u，v和w独立地是0-1的整数，前提 是v和w中的至少一个是0 ;
[0025] 及所述化合物的药学上可接受的盐和所有的立体异构体。
[0026] 在一个实施方案中，本发明提供了在需要这种治疗的患者中治疗或预防高胆固醇 血症和/或血脂异常、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏疾病的至少一种症状的方法，包 括对这样的患者施用治疗有效量的具有以上式I的化合物。
[0027] 在另一个实施方案中，本发明的方法涉及施用至少一种具有下式的化合物：
[0029] 其中，Het选自下组：
[0030]
[0031] 并且R2是任选取代的烷基、环烷基、芳烷基、芳基、杂环、杂环烷基、杂芳基和杂芳 基烷基，X选自NR。、0、S和到札的价键，并且R。是H或者低级烷基；
[0032] Z选自由S、0和CH2组成的组；
[0033] R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环、杂环烷基、杂芳基和杂芳基 烷基；
[0034] Ra，Rb，R'和R"独立地选自H和低级烷基；
[0035] X^Y1和Z1相同或不同并且各自表示氢或选自由羟基、卤素、氨基、单烷基氨基、二 烷基氨基、烷氧基、羧基、酰氨基（包括甲酰胺基、烷基酰氨基和芳基酰氨基）、氨基羰基、单 烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、氨基甲酸酯（carbamato)、羧酰氨基（carboxamido)、单烧 基氨基亚磺酰基、二烷基氨基亚磺酰基、单烷基氨基磺酰基、二烷基氨基磺酰基、烷基磺酰 基氨基、羟基磺酰氧基、烷氧基磺酰氧基、烷基磺酰氧基、羟基磺酰基、烷氧基磺酰基、烷基 磺酰基烷基、单烷基氨基磺酰基烷