化合物包覆的纳米颗粒和纳米乳剂的制备及其用图
【专利说明】
[0001] 相关参考申请
[0002] 本PCT申请要求申请号为61/830, 335的美国临时申请之申请日的利益，该美国临 时申请名称为"化合物包覆的纳米颗粒和纳米乳剂的制备及其用途"、申请日为2013年6月 3日的。该参考申请的全部内容以参考方式并入本申请。
技术领域
[0003] 本发明涉及含有生物活性成分的纳米乳剂和纳米颗粒的制备和用途，该生物活性 成分包括能通过皮肤屏障和促进细胞生长的具有明显临床效果的化妆品、医疗和药物活性 成分。
【背景技术】
[0004] 纳米材料是指在原子或分子水平上对物质的操作。一纳米（nm)是十亿分之一 米，或10 9米。相比之下，经典的碳-碳键长度，或在一个分子中原子之间的距离，都在 0· 12-0. 15纳米之间，并且DNA双螺旋的直径约为2nm。美国国家纳米技术计划（National Nanotechnology Initiative in the US)对纳米的定义是，在1至100纳米之间的物质 [1]。纳米颗粒是连接宏观物质和原子或分子结构之间的有效桥梁。宏观物质不管其大小 应该具有恒定的物理性能，但在纳米水平，它们的特性变得与尺寸相关。纳米颗粒（纳米颗 粒和纳米微粒在本发明中是可互换的）可以强烈地影响物质的机械性能，如硬度、弹性、光 学透明性、扩散运输和保质期稳定性[2]。因此，它们对于制药、医疗、食品和个人护理产品 来说是非常重要的。
[0005] 在一般术语中，研究人员把纳米乳剂（纳米乳液和纳米乳剂是在本发明中是可互 换的）定义为液滴通过剪切力诱导破裂形成的纳米级破裂；微乳液通常是通过自行形成 的。还可以形成粒径小于IOOnm的微乳液，通过加入表面活性剂自行乳化，而无需加入通常 与结晶相平衡溶致的形成有关的剪切力，其中的表面张力有效地消失，并且通过分子热力 自下而上自发形成液滴[3]。
[0006] 只要粒度或物质是纳米级的，它可以被称为纳米乳剂（纳米乳液）和纳米颗粒 (纳米微粒）。微乳液介于纳米乳液、细乳液和乳液之间。微乳液粒度可以从20纳米至200 纳米或更大。
[0007] 在过去几十年里，包括生物活性化合物在内的大分子只有通过诸如注射等有创的 方法才能穿过皮肤屏障有效给药。但这种有创方法由于安全问题和病人疼痛等依从性问 题，有明显的不足。除了有创经皮给药方法的安全性和患者依从性问题之外，无创经皮给药 方法的需求比以往任何时候都更加高，因为快速发展的生物技术衍生的分子具有比当前治 疗方法能够提供的更好的治疗和/或药妆价值。可以预期的是，在制药工业和化妆品行业， 为了更好的患者和消费者依从性，生物活性成分的无创性经皮给药技术变得非常有吸引力 和重要。不幸的是，迄今为止，因为许多明显的原因，还没有合适的给药方法能满足这不断 增加的需求。至少有两大障碍是，生物活性分子在制造、贮存、运输和使用过程中，对环 境非常敏感。温度、pH值、振动、光线、离子强度和其它添加剂的变化很容易会使其变性或破 坏其生物学活性。因此制造过程和涉及这些分子的其他过程，必须非常温和、和缓，在整个 过程中必须保持生物活性；2是生物分子体积大，难以通过在皮肤上的天然屏障穿过皮肤。 为了克服这些及其他现实障碍，给药方法必需要具备能使大分子穿过各层皮肤屏障（角质 层、表皮层和真皮层）的能力，以及在整个给药过程中维持生物活性的能力。
[0008] 正因为有了这两大要求和适合于不同生物分子的其他考虑，这也难怪，一直没有 合适的无创性的经皮方法能够实现这一目的。脂质体技术已被广泛应用在注射用药物产 品，以增加药物活性水溶性和/或具有药物缓释特性，例如Doxil [4、5、6、7和8]。然而，由于 磷酸胆碱脂质（PCs)和用于脂质体制造技术的其他脂质的玻璃化转变温度（Tg)要高于室 温，许多生物分子不能耐受制造过程中较高的温度（即：>50°C )或挤压类工艺的韧度[9]。 化妆品行业在使用其他微创方法，如微阵列（微针）[10]，但由于皮肤微创伤本身仍存在严 重的安全性问题，并且它不易操作。
[0009] -般来说，人体皮肤厚度是大约250微米或更小，且对于个体来说，不同部位的皮 肤其厚度是不同的。人体皮肤包括顶层的角质层，中间层的表皮层，以及更深的真皮层，在 真皮层中分布有丰富的神经末梢和细胞。经皮给药路径被认为会涉及毛囊通道、细胞间隙、 和细胞内间隙，并且前面2种是主要的途径[11]。可以想像的是，颗粒的粒度和属性在运 送小分子和大分子时也会起重要的作用。鉴于纳米颗粒非常小且具有独特的特性，纳米颗 粒可以是经皮给药精细操作的一个很好选项。皮肤的表层和下层分别是亲脂性的和亲水性 的。内层皮肤和细胞的细胞膜也是亲脂性，细胞内是亲水性的。为了不止一次地通过亲脂 性的和亲水性的膜穿过皮肤中的这些皮肤层次和细胞，简单的单层纳米颗粒很难完成该精 细的任务。
[0010] 因此，选择包裹活性成分的多层纳米颗粒和纳米乳剂（在更大的纳米颗粒内小纳 米颗粒），精心设计及开发以实现这一目的。这些包裹的多层纳米颗粒和纳米乳剂的主要目 的是穿过皮肤层，而无需使用针，并且在穿透的过程之中或之后，自行把包裹的内容物传送 到皮肤内层。因此，已经进行了本发明范围内的许多实验，以开发这些在非常温和的和缓的 条件下具有良好稳定性的多层纳米颗粒和纳米乳剂，旨在包裹活性成分，保持它们的生物 活性，并且克服多层皮肤亲脂性和亲水性膜的障碍。
【发明内容】
[0011] 通过本发明的新颖的制造工艺（方法）制成的本发明多层纳米颗粒，纳米乳剂和 乳膏是合适的载体，其可以穿过多层皮肤把包裹的化合物递送给组织和细胞，具有深远的 临床效果。多层纳米颗粒和纳米乳剂自行穿越皮肤层的机理被认为是涉及上述提到的3种 经皮递送途径：毛囊通道、细胞间隙和细胞内间隙或膜。通过亲脂性和亲水性膜沿着皮肤的 穿透路径，多层小纳米颗粒和纳米乳剂进入（用手与手指按摩）皮肤的内层；纳米颗粒内包 裹的化合物（纳米颗粒和纳米乳剂的表面，多层纳米乳剂之间）逐渐释放到穿透路径中的 不同层。皮肤的多个亲脂性层和亲水性层与多层纳米颗粒纳米乳剂之间的相互作用能帮助 活性成分的吸收，并且帮助纳米颗粒穿越多层皮肤屏障。因为在施用过程中按摩皮肤是一 个温柔和自然的过程，自然皮肤结构是完整的（相对于微针和注射），大生物分子在释放到 皮肤内层和细胞内部之前一直活性保持，皮肤内层和细胞内部产生的临床效果最佳。这种 机制还解释了在使用这些配方的个体中观察到的明显的抗皱、皮肤紧致、皮肤美白和伤口 愈合效果。
[0012] 本发明涉及纳米颗粒和纳米乳剂，制备和使用它们的方法。特别是，这涉及到特定 的包裹有活性成分的多层水包油包水纳米颗粒，并用乳膏包覆。一般而言，纳米颗粒可通过 诸如电化学[12]、超声和微流体[13、14、15]等方法制备。本发明报告了制备内部包裹有活 性成分的较小纳米颗粒（例如小于约10纳米、20纳米、30纳米、40纳米）的新颖方法。这 些纳米颗粒被稍大的包裹活性成分的纳米颗粒（如小于约30纳米、40纳米、50纳米、60纳 米左右）包围。最后这些纳米颗粒被乳膏包围，以形成稳定的纳米乳剂，其粒度为10至150 纳米，但主要是20至50纳米。活性成分被包裹在纳米颗粒内部、纳米颗粒层之间、纳米乳 剂内部和纳米颗粒与纳米乳剂的表面上。
[0013] 下述策略用于制备多层纳米乳剂，该纳米乳剂包含小纳米颗粒，该小纳米颗粒内 部还包含更小的纳米颗粒。温和的过程及和缓的条件已经用来开发整个制造过程。首先， 把包括生物分子的活性成分水溶液加入到搅拌的油相中生成油包水（W/0)纳米颗粒（较小 的纳米颗粒），其粒度小于l〇nm、20nm、有时小于30纳米、或50纳米；其次，将这些较小的纳 米颗粒加入到含有诸如生物分子等活性成分的搅拌的水相中生成水包油（0/W)纳米颗粒 (小纳米颗粒），其粒度小于30nm、40nm、有时小于50nm、60纳米、80纳米；第三，把乳膏（例 如本说明书中列出的乳膏1或本说明书的实施例中列出的其他乳膏）加入到所形成的小纳 米颗粒以形成多层纳米颗粒和纳米乳剂，该多层纳米颗粒和纳米乳剂粒度小于30纳米、40 纳米、50纳米、60纳米、有时小于80纳米，但通常小于100纳米，或有时小于150纳米。该 多层纳米颗粒和纳米乳剂，通常看起来透明或半透明的，有时不太透明。在这个制备纳米颗 粒和纳米乳剂的领域中，并未使用复杂的设备。磁力搅拌，机械搅拌或相当的装置都可以使 用。多层纳米颗粒和纳米乳剂的最终产品可以相当容易地从该方法获得，并可根据所使用 的活性成分的性质广泛用于制药、医疗、化妆品领域。上述制备的多层纳米颗粒和纳米乳剂 显示在图1中。皮肤结构图显示在2A中。本发明多层纳米颗粒和纳米乳剂如何穿过皮肤 示显示在图2B中。
【附图说明】
[0014] 图1显示了多层纳米颗粒和纳米乳剂的简化方案。1表示油相，2表示水相，3表示 包裹的成分（在所有层中以小点方式表不），4表不油相，5表不水相，6表不油相。
[0015] 图2A显不了皮肤结构/层的简化方案。7表不油相，8表不水相，9表不油相，10 表示水相，11表示油相，12表示水相，13表示油相，14表示水相，15表示油相，16表示水相， 17表示油相，18表示角质层，19表示表皮层，20表示真皮层，21表示细胞，22表示毛囊/毛 孔。
[0016] 图2B显示了多层纳米颗粒和纳米乳剂穿越皮肤层到细胞的简化方案。23表示进 入皮肤之前的多层纳米颗粒和纳米乳剂，24表示角质层，25表示表皮，26表示真皮，27表示 位于皮肤下方的细胞，28表示进入皮肤之前放大的纳米颗粒和纳米乳剂，29表示穿过角质 层后释放的成分，30表示穿过角质层后的多层纳米颗粒和纳米乳剂，31表示穿过表皮后释 放的成分，32表示穿过表皮后的多层纳米颗粒和纳米乳剂，33表示穿过真皮后的多层纳米 颗粒和纳米乳剂，34表示穿过真皮后释放的成分，35及35'表示单个细胞，36表示细胞内部 释放的成分，37表示细胞内部的多层纳米颗粒和纳米乳剂，38及38'表示细胞核，39表示细 胞核内释放的成分。
【具体实施方式】
[0017] 已经进行了许多实验，且本