[0168] 本实验通过在去细胞人工角膜体外培养细胞并观察细胞生长情况，评价其细胞生 物相容性。 阳1例 1材料和方法：
[0170] 1.1.1主要试剂和仪器 阳171] 0.25%膜蛋白酶、青霉素与链霉素混合液、胎牛血清、MEM、DMEM及DMEM/F12均购 自美国GIBCO公司、DAPI溶液，DPBS购自美国corning公司，高速台式离屯、机、超净工作台、 C〇2培养箱。 阳172] 1.1. 2培养液的制备 阳173] DMEM/F12培养液含体积分数20 %胎牛血清及IOOXIO3U?L1青霉素与链霉素混 合液，PH值7. 2~7. 4。 阳174] DMEM与MEM培养液各含体积分数10%胎牛血清及IOOXIO3U?L1青霉素与链霉 素混合液，PH值7. 2~7. 4。 阳175] 1.2实验方法 阳176] 1. 2. 1人源角膜上皮细胞与去细胞人工角膜接触培养 阳177]经传代培养的人源角膜上皮细胞细胞80%融合后用PBS冲洗2次，加入0.25%膜 蛋白酶Iml倒置显微镜下观察细胞形态变圆，细胞间隙变大或少量细胞脱壁时加入含血清 的DMEM培养液终止消化，收集细胞悬液，离屯、5min(800?min-1)，计数，W1XlOVml的密 度接种在脱细胞角膜的上皮细胞层。细胞接种前，先将脱细胞角膜在PBS中浸泡lOmin，然 后将样品平铺于96孔培养板中，接种后的细胞与支架复合体在37°C、5%C〇2培养箱中静置 化后，再加入适量MEM培养液，继续放解箱培养，第二天换液一次。倒置显微镜观察细胞生 长情况，培养2-3天后，培养的细胞与支架复合体经2. 5%的戊二醒固定，脱水，冷冻干燥完 做扫描电镜；观察细胞形态。
[0178] 1. 2. 2人源皮肤成纤维细胞与去细胞人工角膜接触培养
[0179] 人源皮肤成纤维细胞培养：人源皮肤成纤维细胞80 %融合后用PBS冲洗2次，加 入0. 25%膜蛋白酶Iml倒置显微镜下观察细胞形态变圆，细胞间隙变大或少量细胞脱壁时 加入含血清的MEM培养液终止消化，收集细胞悬液，离屯、6~Smin(1000 .min1)，计数，W IXioVml的密度接种在脱细胞角膜的上皮细胞层。细胞接种前，先将脱细胞角膜在PBS中 浸泡lOmin，然后将样品平铺于48孔培养板中，接种后的细胞与支架复合体在37°C、5%C〇2 培养箱中静置化后，再加入适量培养液，继续放解箱培养，第二天换液一次。倒置显微镜观 察细胞生长情况，培养3-4天后，培养的细胞与支架复合体经2. 5%的戊二醒固定，脱水，冷 冻干燥完做扫描电镜；观察细胞形态。 阳180] 1. 2. 3人源上皮细胞在去细胞人工角膜贴壁率实验 阳181]经传代培养的人源角膜上皮细胞细胞，取对数期生长的细胞接种于贴有去细胞人 工角膜的24孔培养板，对照组接种于普通培养板，各10孔。在37°C、50mL/LC〇2及饱和湿 度条件下的培养箱中培养化、化后，DAPI染色观察细胞形态及贴附情况，另采用MT法测 定细胞悬液吸光度值An。通过实验已利用MT法测得当细胞悬液的密度为MO= 1.OXIO8/ L时，在492nm处的吸光度值为AO= 0. 137。根据一定范围内活细胞数与吸光度值成正比， 可W计算出化、化后贴壁存活细胞数，并据此算得化、化细胞贴壁率：pn=An/AOX100% (n= 1, 2,…，10)。 阳182] 1. 2. 4扫描电镜前制样步骤：固定+脱水 阳183] 1)、缓冲液漂洗完3次，使用2. 5%戊二醒每孔加l-2ml，固定1天。 阳184] 2)、固定完后用梯度乙醇脱水（50 %，70 %，80 %，90 %，100 % )各泡3次，3min/ 次，接着泡叔下醇步骤相同；泡完放-20°C冰箱保存化后，放冷冻干燥机干燥。 阳185] 2.结果： 阳186] 2. 1电镜观察结果 阳187] 如图5和图6可见，细胞接种到脱细胞基质48小时后扫描电镜观察发现细胞均贴 附到支架材料上，人源角膜上皮细胞在72小时后可见细胞伸展，呈多角形，逐渐融合图。 阳188] 2. 2显微镜下观察6h、化细胞贴附情况 阳189]将密度为MO=1.OXIOVl的细胞悬液分别接种于贴有去细胞人工角膜的24孔 培养板及作为对照的普通培养板，6h、化后DAPI染色置于镜下观察细胞形态并分别计算贴 壁率为90. 67%和92. 67%，详细见图7所示。
[0190]去细胞人工角膜的细胞亲和性可W直接接触法进行检测，该法将细胞直接放在生 物材料上进行细胞培养，可W直接观察到细胞在材料表面贴附情况。直接接触法不仅能直 接检测材料溶出物的细胞毒，同时也是考察材料与组织细胞相容性的重要手段。 阳191]脱细胞角膜基质经过冷冻干燥处理后，基质结构疏松，电镜显示其网状间隙率为70-200um，细胞在其上接种培养后，可向材料深层迁徒，说明基质层的网状结构能够提供间 充质细胞生长的空间，保证营养成份和代谢产物的交换，有利于细胞在材料的表面黏附和 生长。 阳192]在细胞亲和性检测中，我们也尝试将人源的角膜上皮细胞接种到脱细胞角膜上， 细胞在材料界面同样生长良好。表明脱细胞角膜也可作为体外细胞培养的载体。 阳193] 4.结论：
[0194] 本实验结果说明制备的去细胞人工角膜具有极低的抗原性、良好的组织相容性和 细胞亲和性，可W提供角膜上皮生长的底物-基底膜及相对健康的角膜基质微环境，促进 宿主角膜上皮细胞的黏附和生长，是宿主细胞生长的优良载体。
[0195] 从W上详细的实验数据可见，本发明人工角膜具有良好的透光性、机械强度和初 性，可W有效地在角膜板层缺损区保护眼内容物，防止继发损害；结构与宿主角膜相似，酶 残留活性及DNA残留量的检测，说明人工角膜具有极低的抗原性；具备正常角膜超微结构 W及良好的细胞亲和性、组织相容性，可W提供角膜上皮生长的底物-基底膜及相对健康 的角膜基质微环境，促进宿主角膜上皮细胞的黏附和生长，是宿主细胞生长的优良载体。
[0196]W上详细描述了本发明的较佳具体实施例，是发明人花费了大量人才财力和时 间，在多次试验出来的结果，应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可W根据本发 明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明构思在现有技术 基础上通过逻辑分析、推理或者根据有限的实验可W得到的技术方案，均应该在由本权利 要求书所确定的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种人工角膜，其特征在于，以动物脱细胞角膜基质先浸泡于光敏剂中，然后在紫外 光照射下交联均匀，其厚度为50-1000μm。2. -种光氧化胶原交联的方法，其特征在于，其包括的步骤如下： (1) 将动物脱细胞角膜基质在〇. 〇l_5mg/ml光敏剂溶液中浸泡l-60min; (2) 将浸泡后的动物脱细胞角膜基质取出放于培养皿中，用100-400nm波长紫外光照 射l_60min; (3) 用磷酸盐缓冲溶液浸泡0. 5-4h，然后振荡0. 5-2h。3. 根据权利要求2所述的一种光氧化胶原交联的方法，其特征在于，还包括以下步骤： (4)更换磷酸盐缓冲溶液，浸泡0. 5-4h，然后振荡0. 5-2h。4. 根据权利要求2所述的一种光氧化胶原交联的方法，其特征在于，所述（2)步骤中， 在紫外光照射l_30min时换面，然后继续进行照射。5. 根据权利要求2所述的一种光氧化胶原交联的方法，其特征在于，所述（2)步骤中， 紫外光照射的功率密度在lmw/cm2-6000mw/cm2。6. 根据权利要求2所述的一种光氧化胶原交联的方法，其特征在于，所述动物脱细胞 角膜基质是猪、牛、羊、马、兔或者猴角膜基质脱细胞后的产品。7. 根据权利要求2所述的一种光氧化胶原交联的方法，其特征在于，所述光敏剂是 NFK、3-经基犬尿酸、君咔琳、核黄素、FMN、FAD及视黄醛。8. 根据权利要求2所述的一种光氧化胶原交联的方法，其特征在于，所述光敏剂是稠 环醌类天然光敏剂、扑啉类及其衍生物光敏剂。
【专利摘要】本发明公开了一种人工角膜，将动物脱细胞角膜基质先浸泡于光敏剂中，然后在紫外光照射下交联均匀。一种光氧化胶原交联的方法的步骤如下：(1)将动物脱细胞角膜基质在0.01-5mg/ml光敏剂溶液中浸泡1-60min；(2)将浸泡后的动物脱细胞角膜基质取出放于培养皿中，用100-400nm波长紫外光照射1-60min；(3)用PBS溶液浸泡0.5-4h，然后振荡0.5-2h。本发明的有益效果是：可以有效的改善脱动物脱细胞角膜基质的机械强度等生物力学特性；因为生物力学特性主要取决于胶原纤维、胶原纤维束以及它们空间结构的组成，因此，通过光辐照/光敏剂交联术可以改善动物脱细胞角膜基质的生物机械性能及其稳定性。
【IPC分类】A61L27/36, A61L27/50
【公开号】CN105343934
【申请号】CN201510250565
【发明人】官习鹏, 易静楠
【申请人】广州悦清再生医学科技有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年5月15日