术人员还可W按照公知的方法对组织匀浆、上清液W及超滤收集的组分 进行冷冻干燥。
[0045] 作为优选，截留后还包括调节抑值为6. 8~7. 2的步骤。
[004引在抑值为6. 8~7. 2的范围内，鸡胚活性肤的性质稳定，活性较高。
[0047] 所述冷冻干燥为鸡胚活性肤与冷冻干燥剂混合，经冷冻干燥制得冻干粉。所述冷 冻干燥赋型剂为甘露醇。具体的，组织匀浆、上清液W及超滤收集的组分中加入甘露醇至质 量分数为8%进行冷冻干燥。优选的，在超滤收集的组分中加入甘露醇至质量分数为8%进 行冷冻干燥。
[004引本发明提供了鸡胚活性肤在制备保护细胞活力的产品中的应用。本发明所采用的 鸡胚活性肤中包括鸡胚活性肤和游离氨基酸；其中，鸡胚活性肤的分子量小于lOkDa。本发 明实验证实，鸡胚活性肤能够保护人成纤维细胞的活性，与不添加本发明鸡胚活性肤的对 照组相比，添加鸡胚活性肤的实验组人成纤维细胞的活性得到保护。因此，鸡胚活性肤能够 作为改善细纹、肤色暗沉，去除红血丝、美白、桂皱、活肤细胞复苏修复或去癒痕的功能的化 妆品。
【附图说明】
[0049] 图1示实施例1制得鸡胚活性肤对人成纤维细胞的保护作用。
【具体实施方式】
[0050] 本发明提供了提供鸡胚活性肤在制备保护细胞活力的产品中的应用，本领域技术 人员可W借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改 动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应 用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内 对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0051] 本发明采用的材料、仪器或试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0052] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0053] 实施例1
[0054] (1)解化鸡胚：取SPF级受精鸡蛋，放入解化箱内进行解化，解化溫度控制在 37. 5°C，相对湿度60%，每2小时自动翻蛋一次，待解化至16天，取出受精鸡蛋，放-20°C的 冷库中，停止解化并保存备用。
[0055] (2)匀浆及细胞破碎：对解化的鸡蛋进行表面消毒，去除蛋壳取出鸡胚，在4°C下 将鸡胚用组织匀浆机匀浆后，倒入灭菌后的密封盒中，放到-30°C的冷库中冷冻72小时，融 解后于4°C的环境中对其进行细胞超声破碎，加入等量的注射用水，放置于4°C的冷藏库中 备用。
[0056](3)酶水解及离屯、：取细胞破碎后的冷藏液加热水浴至50°C，调抑至7. 5,加入 膜酶至浓度为2. 5% (质量分数）水解恒溫水浴1小时，在4°C、45(K)r/min条件下离屯、20 分钟，收上清液在降溫至4°C冷藏备用。
[0057] (4)超滤及调K1值：将鸡胚浆液超滤过lOkDa的滤膜，收集lOkDaW内的超滤液， 调抑值至6. 8~7. 2,制得鸡胚活性肤。
[0058] 活性肤经shotgun分析，活性肤的含量为0. 1μg/μL;肤段数量共计300条，分别 来自70种不同的蛋白，具体结果如表1 :
[0059] 表1 shotgun分析结果
[0060]
[0061]
[0062] 采用GB/T5009. 124-2003提供的方法，利用k8800型氨基酸自动分析仪，对鸡胚 活性肤中游离氨基酸进行检测。结果为：
[0063] 表2游离氨基酸检测
[0064]
[0065]
[006引 实施例2
[0067] 利用MTT比色法测定细胞存活率。其检测原理为活细胞线粒体中的班巧酸脱氨酶 能使外源性Μ?Τ还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲琐（Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞 无此功能。二甲基亚讽（DMS0)能溶解细胞中的甲琐，用酶联免疫检测仪在550nm波长处测 定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与活细胞 数成正比。
[006引MTT法测定细胞活力：
[0069] 将人成纤维细胞（皿F细胞）（第六代）W1X104个/孔接种于96孔板中；
[0070] 实验分为实验组、空白对照组；
[0071] 24小时后，实验组给予不同浓度的实施例1提供的鸡胚活性肤（20,50，100， 250, 500μg/mL)处理细胞；空白对照组不添加活性肤。继续培养48小时。在培养结束前4 小时每孔加入20 □LMTT20 □LMTT(5μg/mL)。产生的紫色结晶用DMS0溶解，在550nm 波长条件下测定光吸收值。W空白对照的吸光值为100%，计算各组细胞的相对空白对照组 细胞的活性。结果如图1。
[0072] 结果表明，当鸡胚活性肤的剂量为20~100μg/mL时，成纤维细胞的活性与空白 对照组无显著差异（P〉〇. 05);而当鸡胚活性肤的剂量为250~500μgAiL时，成纤维细胞 的活性与空白对照相比显著升高（P<〇. 05)，升高比例分别为20%和40%。W上结果说明， 鸡胚活性肤能够促进成纤维细胞的活性，在250~500μg/mL剂量范围内皆有效。
[0073] W上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可w做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 鸡胚活性肽在制备保护细胞活力的产品中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞为人成纤维细胞。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鸡胚活性肽保护细胞活力保护的剂 量为 250μg/mL~500μg/mL。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鸡胚活性肽中包括鸡胚活性肽和游 离氨基酸；其中，所述鸡胚活性肽的分子量小于10kDa。5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鸡胚活性肽的制备方法为：将鸡胚 去壳、匀浆后，破碎细胞；经胰酶酶解后，离心收集上清液，超滤截留分子量小于10kDa的组 分。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述破碎细胞包括冻融和超声破碎的步 骤； 所述冻融的冷冻温度为_20°C~_40°C，时间为60h~80h;溶解温度为4°C~8°C; 所述超声破碎的温度为4°C~8°C，功率为800W~1200W，时间为15min~25min。7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述酶解的酶解液中，胰酶的质量分数为 2. 5% ;所述酶解的温度为45°C~55°C，pH值为7. 3~7. 7,酶解时间为40min~80min。8. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述离心的转速为4500r/min，离心的时 间为20min，离心的温度为4°C。9. 鸡胚活性肽在制备的化妆品中的应用；所述化妆品为具有修复红血丝、美白、祛皱、 活肤细胞复苏修复或去瘢痕的功能的化妆品。10. -种化妆品，其特征在于，包括鸡胚活性肽、透明质酸、黄原胶、荷荷巴油、熊果苷和 甘油。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鸡胚活性肽及其制备方法与应用。本发明提供的鸡胚活性肽，包括鸡胚活性肽和游离氨基酸；其中，鸡胚活性肽的分子量小于10kDa。本发明提供的鸡胚活性肽能够保护人成纤维细胞的活性，与不添加本发明鸡胚活性肽的对照组相比，添加鸡胚活性肽的实验组人成纤维细胞的活性得到保护。与不进行紫外照射的空白组相比，实验组的人成纤维细胞活性与之持平甚至略有升高。本发明提供的鸡胚活性肽的制备方法操作简便，通过匀浆、冻融和超声破碎，最大程度上的破碎了细胞膜，使胞内的活性肽得到良好的溶出，再经离心和超滤等生物技术提取工艺，从而提高了提取效率。
【IPC分类】A61Q19/02, A61K8/64, A61K8/34, A61K8/98, A61K8/73, A61K8/92, A61K8/60, A61Q19/08, C12P21/06
【公开号】CN105380818
【申请号】CN201511017187
【发明人】耿威, 王笑琳, 金英花, 战铁楠, 耿利, 李杨, 王莉红, 耿晓宇
【申请人】耿威
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年12月30日