[0032] 图11显示EphA2-TEA-VV导致A549皮下肿瘤模型中增强的抗肿瘤应答。在第0 天将2xl06个A549细胞与1x10 7个未刺激的PBMC混合并皮下接种至SCID小鼠的右腋，随 后立即腹膜内注射lxl〇sPFUEphA2-TEA-VV或GFP-VV。通过卡尺测量肿瘤尺寸。
[0033] 图12显示EphA2-TEA-VV导致A549皮下肿瘤模型中改善的存活率。小鼠被接种 肿瘤，随后注射VV，如图10所述。监测小鼠存活率（EphA2-TEA-VVn= 8，GFP-VVη= 7);
[0034] 图13Α和13Β显示EphA2-TEA-VV在Α549静脉内肺癌模型中导致增强的抗肿瘤应 答。在第0天将2xl06个A549.eGFP.FFLuc细胞静脉内注射至SCID小鼠并在第7天使用 单次注射混合的lxlO7未刺激PBMC和1x10SPFUEphA2-TEA-VV或GFP-VV进行治疗。通过 体内生物发光成像来追踪肿瘤进展。A.显示代表性动物的图像。B.实线代表各组小鼠；
[0035] 图14A-14C显示HER2-TE有效地诱导HER2+A549肿瘤细胞的杀伤。A.慢病毒载体 中编码HER2-scFv-CD3-scFv(HER2-TE)或GFP(GFP)的慢病毒表达盒的示意图。B.将混合 的慢病毒感染的A549 (GFP+，0· 6xl06/孔）和未感染的A549 (GFP-，0· 4xl06/孔）与未刺激 的PBMC(lxl06/孔）在24孔板中共培养两天。收获细胞并使用针对⑶3的抗体进行染色， 随后进行流式分析。C.显示了细胞群体的百分比。D.在显微镜下检查GFP表达；
[0036] 图15A-15B比较了HER2-TE的串联双scFv和双抗体诱导杀伤HER2+A549 (GFP+) 肿瘤细胞的能力。A.慢病毒载体中编码串联双scFvHER2-TE或双抗体HER2-TE的表达盒 的示意图。B.将慢病毒感染的HER2+A549肿瘤细胞（lxlO6/孔）与未刺激的PBMC(lxl06/ 孔）在24孔板中共培养。24小时后在显微镜下检查GFP表达；
[0037] 图16A-16C显示⑶2-TE有效地诱导⑶2+JF和LAN1肿瘤细胞的杀伤。A.慢病毒 载体中编码⑶2-scFv-⑶3-scFv(⑶2-TE)或GFP(GFP)的表达盒的示意图。将慢病毒感染 的JF(GFP+)⑶或LAN1 (GFP+) (C)肿瘤细胞（lxlO6/孔）与未刺激的PBMC(lxl06/孔）在 24孔板中共培养。在显微镜下检查GFP表达。
[0038] 图17显示针对肝细胞癌（HCC)的HN3-TE和GC33-TE的构建和功能。A.慢病毒中 编码HN3-scFv-CD3-scFv(HN3-TE)或GC33-scFv-CD3-scFv(GC33-TE)的表达盒的示意图。 B.将HuH7或Η印G2肿瘤细胞（5xl03/孔）与逆转录病毒感染的人PBMC以不同的T细胞对 肿瘤细胞比例共培养，并通过标准Cr释放CTL试验来测定肿瘤裂解。
[0039] 图18显示构建三聚体或二聚体形式的带4-1BBL臂的T细胞接合物的方法。
[0040] 图19显示带4-1BBL臂的TEA-VV的增强的抗肿瘤作用。
[0041] 图20显示共刺激信号转导4-1BBL进一步增强肿瘤杀伤作用和诱导T细胞激活。 将逆转录病毒（GFP、HER2-TE、二聚体-41BBL-HER2-TE或三聚体-41BBL-TE)感染的A549肿 瘤细胞（GFP+，lxlO6/孔）与未刺激的PBMC共培养，并在48小时后在显微镜下检查GFP表 达。
[0042] 图21显示使用IFNy和IL2的细胞因子ELISA。将逆转录病毒（GFP、HER2-TE、二 聚体-41BBL-HER2-TE或三聚体-41BBL-TE)感染的A549肿瘤细胞（GFP+，lxlO6/孔）与未 刺激的PBMC共培养，并在48小时后在收集细胞培养基并通过ELISA检测IFNγ和IL2的 细胞因子表达。
[0043] 发明详述
[0044] 与长期存在的专利法惯例一致，本说明书包括权利要求中使用的单词"一"和"一 个"与单词包括一致，表示" 一种或多种"。本发明的一些实施方式可能由一个或多个本发 明的元素、方法步骤和/或方法组成或基本由其组成。考虑到本文所述的任意方法或组合 物可相对于本文所述的任意其他方法或组合物实施。 I.【具体实施方式】
[0045] 本发明提供了一种用于治疗癌症（包括晚期实体瘤）的新型溶瘤病毒策略，带Τ 细胞接合物臂的溶瘤病毒（TEA-0V)。溶瘤病毒疗法已在临床前模型和临床研究中显示作 为新型癌症治疗的希望。然而，抗肿瘤效力是次优的且大多数肿瘤复发，彰显需要进一步改 进。溶瘤病毒的主要作用模式是破坏肿瘤细胞，其可随后诱导针对肿瘤的抗原特异性Τ细 胞应答，从而即使在局部注射病毒后也能靶向转移性疾病。目前，病毒通过肿瘤扩散且抗原 特异性Τ细胞应答的诱导受限，这解释了观察到的溶瘤病毒的次优抗肿瘤活性。在本发明 的实施方式中，在肿瘤环境内激活驻留Τ细胞克服了这些限制，因为抗原特异性Τ细胞可杀 伤未被痘苗病毒感染的肿瘤细胞（周边杀伤），且其在激活后释放的细胞因子产生促进诱 导内源性肿瘤特异性Τ细胞应答的促炎微环境。
[0046] 为激活肿瘤内的Τ细胞，本发明描述了带Τ细胞接合物臂的溶瘤病毒（I-cell EngagerArmedQncolyticYiruses，TEA-〇V)，其编码的T细胞接合物是一种包含激活结构 域和抗原识别结构域的双特异性分子。在具体情况中，该接合物包含CD3单链可变区片段 (⑶3-scFv)。在使用溶瘤痘苗病毒作为平台的示例性研究中，⑶3-scFv表达为结合⑶3和 示例性肿瘤细胞表面抗原EphA2的分泌性双特异性scFv(EphA2-TEA-VV)。与对照VV相比， EphA2-TEA-VV通过诱导未被VV感染的肿瘤细胞的周边杀伤而显示显著增强的肿瘤裂解活 性。因此，编码结合CD3和肿瘤细胞表面抗原的双特异性scFv的带T细胞接合物臂的溶瘤 痕苗病毒（T-cellEngagerArmedOncolyticVacciniaViruses，TEA-VV)显不T细胞存 在的情况下显著增强的肿瘤裂解活性，代表用于癌症治疗且具有独特的接合T细胞能力的 新型和增强的溶瘤病毒策略。
[0047] 本发明的实施方式表明，使溶瘤VV带T细胞接合物臂（例如包含至少⑶3-scFv 的T细胞接合分子）导致增强的抗治疗作用，从而为有效的溶瘤病毒疗法的研发和应用打 开了一条新路。TEA-0V可用于治疗癌症，包括目前的治疗策略通常难以治愈的晚期实体瘤。
[0048] II.接合分子及其应用
[0049] 在某些实施方式中，本发明提供的溶瘤病毒载体经遗传工程改造以包含编码接合 分子如接合多肽的多核苷酸序列。这类接合多肽一般包含抗原识别结构域和激活结构域。 可设计接合分子的抗原识别结构域以结合目标细胞上存在的一种或多种分子，而接合分子 的激活结构域结合存在于效应细胞（例如，T淋巴细胞）上的分子。一旦接合分子的激活 结构域已经结合效应细胞，该激活结构域可激活效应细胞。在某些实施方式中，当接合物的 激活结构域结合免疫细胞上的激活分子，并且抗原识别结构域结合目标细胞抗原时，该免 疫细胞杀死目标细胞。
[0050] 该接合物可以是两部分的（例如包含激活结构域和抗原识别结构域，其可任选通 过接头接合），或者可以是三部分或多部分的（例如包含一个或多个激活结构域和/或抗原 识别结构域或其他结构域，包含一个或多个共刺激结构域和/或一个或多个二聚化或三聚 化结构域）。
[0051] 在某些实施方式中，该接合物是蛋白质，例如，工程改造的蛋白质。在具体实施方 式中，接合物的激活结构域是或包含抗体或其抗原结合片段或部分，例如，单链可变片段 (scFv)。在其他【具体实施方式】中，抗原识别结构域是或包含抗体或抗体片段或其抗原结合 片段或部分，例如，单克隆抗体、Fv或scFv，或者其可包含配体、肽、可溶性T-细胞受体或其 组合。在某些实施方式中，激活结构域和抗原识别结构域通过接头，例如肽接头连接。
[0052] 接合分子的激活结构域可激活免疫细胞。本领域技术人员认识到免疫细胞具有不 同的激活受体。例如，CD3是T-细胞上的激活受体，而CD16、NKG2D或NKp30是NK细胞上 的激活受体，并且CD3或非变异TCR是NKT-细胞上的激活受体。因此，激活T-细胞的接 合分子可具有与激活NK细胞的接合分子不同的激活结构域。在【具体实施方式】中，例如，在 免疫细胞是T细胞的情况中，激活分子是以下中的一种或多种：CD3,例如CD3y、CD3S或 ⑶3ε;或者⑶27、⑶28、⑶40、⑶134、⑶137和⑶278。在其他【具体实施方式】中，例如，在免 疫细胞是ΝΚ细胞的情况中，激活分子是CD16、NKG2D或ΝΚρ30,或者在免疫细胞是ΝΚΤ-细 胞的情况中，激活分子是CD3或非变异TCR。
[0053] 在某些其他实施方式中，接合物还包含一种或多种其他结构域，例如，一种或多种 细胞因子、共刺激结构域、抑制Τ-细胞激活的负调控分子的结构域或其组合。在具体实施 方式中，细胞因子是IL-15、IL-2和/或IL-7。在其他【具体实施方式】中，共刺激结构域是 ⑶27、⑶80、⑶83、⑶86、⑶134或⑶137。在其他【具体实施方式】中，抑制Τ-细胞激活负调控 分子的结构域是ro-1、PD-L1、CTLA4或Β7-Η4。
[0054] 具体接合分子的示例。下文提供了接合分子的具体示例。通常，scFv含有由接头 肽连接的VH和VL结构域。例如，SEQIDN0:1是一种EphA2-⑶3T细胞接合物，其包含以 下通式：
[0055]EphA2-CD3T细胞接合物
[0056]前导肽-VH4H5- (G4S1) 3-VL4H5-SG4S-VH0KT3- (G4S1) 3-VL0KT3
[0057] SEQ ID NO: 1如下，其中首个下划线部分是前导肽且后续下划线部分是上文通式 所述各scFv之间的接头序列：
[0058] MDfflffRILFLVGAATGAHSQVQLLESGGGLYQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSffVRQAPGQALEffMGT ISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREAIFTYWGRGTLVTSSGGGGSGGGGSGGG GSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINNYLSWYQQKPGQAPRLLIYRANRLVDGVPDRFSGSGYGTDFTLTI NNIESEDAAYYFCLKYDVFPYTFGQGTKVEIKSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHffVKQ RPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLT YSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNVYQQKSGTSPKRfflYDTSKVASGYPY RFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKS
[0059] HER2-CD3T细胞接合物
[0060]前导肽-VHFRP5- (G4S1) 3-VLFRP5-G4S-VH0KT3- (G4S1) 3-VL0KT3
[0061] SEQ ID N0:2如下，其中首个下划线部分是前导肽且后续下划线部分是上文通式 所述各scFv之间的接头序列：
[0062] MDfflffRILFLVGAATGAHSEVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYPFTNYGMNVYKQAPGQGLKffMGff INTSTGESTFADDFKGRFDFSLETSANTAYLQINNLKSEDMATYFCARWEVYHGYVPYWGQGTTVTVSSGGGGSGGG GSGGGGSDIQLTQSHKFLSTSVGDRVSITCKASQDVYNAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASSRYTGVPSRFTGSGSGPD FTFTISSVQAEDLAVYFCQQHFRTPFTFGSGTKLEIKALGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYT MHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWG QGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNVYQQKSGTSPKRfflYDTSKY ASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKS
[0063] ⑶2-CD3T细胞接合物
[0064]前导肽-VH14g2a- (SG4SG2) -VL14g2a-G4S-VH0KT3- (G4S1) 3-VL0KT3
[0065] SEQ ID N0:3如下，其中首个下划线部分是前导肽且后续下划线部分是上文通式 所述各scFv之间的接头序列：
[0066] MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDILLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQS PKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFP GSGGGGSGGEVKLQQSGPSLVEPGASVMISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRA TLTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGY TFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHY CLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWI YDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKS
[0067] HN3-CD3T细胞接合物
[0068]前导肽-VHHN3-G4S-VH0KT3- (G4S1) 3-VL0KT3
[0069] SEQ ID N0:4如下，其中首个下划线部分是前导肽且后续下划线部分是上文通式 所述VH与scFv之间的接头序列：
[0070] MDffIffRILFLVGAATGAHQVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASYFDFDSYEMSffVRQAPGKGLEffIGSI YHSGSTYYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTATYYCARVNMDRFDYWGQGTLVTVSSSGGGGSDIKLQQ SGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQL SSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYffGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRAS SSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKL ELKS
[0071] GC33-CD3T细胞接合物
[0072]前导肽-VHGC33- (G4S1) 3-VLGC33-G4S-VH0KT3- (G4S1) 3-VL0KT3
[0073] SEQ ID N0:5如下，其中首个下划线部分是前导肽且后续下划线部分是上文通式 所述各scFv之间的接头序列：
[0074] MDffIffRILFLVGAATGAHSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHffVKQTPVHGLKffIGA LDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGG GGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGT DFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTS