GYTFTRYT MHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWG QGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNVYQQKSGTSPKRfflYDTSKY ASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKS
[0075]二聚化41BBL-HER2-CD3T细胞接合物
[0076]前导肽-VHGC33- (G4S1) 3-VLGC33-CH2CH3- (G4S1) -41BBL- (G4S1) -VH0KT3- (G4S1) 3-VL0KT3
[0077] SEQ ID N0:6如下，其中首个突出部分是前导肽且后续突出部分是上文通式所述 各scFv或CH2CH3结构域或4-1BBL之间的接头序列：
[0078] MDWIffRILFLVGAATGAHSEVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYPFTNYGMNffVKQAPGQGLKWMGff INTSTGESTFADDFKGRFDFSLETSANTAYLQINNLKSEDMATYFCARWEVYHGYVPYWGQGTTVTVSSGGGGSGGG GSGGGGSDIQLTQSHKFLSTSVGDRVSITCKASQDVYNAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASSRYTGVPSRFTGSGSGPD FTFTISSVQAEDLAVYFCQQHFRTPFTFGSGTKLEIKALFEEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSASACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELS PDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVA GEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQG ATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGSGGGGSGGGGSGGGGSVDDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMH WVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQG TTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVAS GVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKS
[0079] 三聚化41BBL-HER2-CD3T细胞接合物
[0080]前导肽-VHGC33- (G4S1) 3-VLGC33-接头肽-Col-接头肽-41BBL- (G4S1) -VH0KT3-( G4S1)3-VL0KT3
[0081] SEQ ID N0:7如下，其中首个突出部分是前导肽且后续突出部分是上文通式所述 各scFv或Col结构域或4-1BBL之间的接头序列：
[0082] MDWIffRILFLVGAATGAHSEVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYPFTNYGMNffVKQAPGQGLKWMGff INTSTGESTFADDFKGRFDFSLETSANTAYLQINNLKSEDMATYFCARWEVYHGYVPYWGQGTTVTVSSGGGGSGGG GSGGGGSDIQLTQSHKFLSTSVGDRVSITCKASQDVYNAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASSRYTGVPSRFTGSGSGPD FTFTISSVQAEDLAVYFCQQHFRTPFTFGSGTKLEIKALFEGAGGSGGSSGSDGASGSRVTAFSNMDDMLQKAHLVI EGTFIYLRDSTEFFIRVRDGWKKLQLGELIPIPADSPPPPALSSNPGAGGSGGSSGSDGASGSRASACPWAVSGARA SPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAK AGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGV HLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGSGGGGSGGGGSGGGGSVDDIKLQQSGAELARPGASV KMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYY CARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQK SGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKS
[0083] 对于本发明所述接合物中的任一种，N端至C端各结构域可以是任意顺序，包括例 如具有的激活结构域在抗原识别结构域的N端、具有的激活结构域在抗原识别结构域的C 端，等等。在某些实施方式中，T细胞经修饰以分泌接合分子，该接合分子具有的抗原识别 结构域在激活结构域的N端。在具体的实施方式中，接合分子的两个或更多个结构域可由 接头隔开。该接头可以是任何合适的长度，且这类参数在本领域中进行常规优化。例如，接 头的长度和序列足以确保第一和第二结构域各自彼此独立，保留其差异接合特异性。
[0084] 在某些实施方式中，抗原识别结构域结合的抗原是肿瘤相关抗原（TAA)或肿瘤特 异性抗原（TSA)。在某些实施方式中，接合物的抗原识别结构域是特异性针对TAA或TSA 的scFv。在【具体实施方式】中，该TAA或TSA表达于癌细胞上。在一个实施方式中，该TAA 或TSA表达于血液癌细胞上。在另一个实施方式中，该TAA或TSA表达于实体瘤的细胞 上。在更具体的实施方式中，该实体瘤是成胶质细胞瘤、非小细胞肺癌、非小细胞肺癌以外 的肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌、脾癌、皮肤癌、成胶质细胞瘤以外的 脑癌、肾癌、甲状腺癌等。在更具体的实施方式中，该TAA或TSA由个体中的肿瘤细胞表达。 在【具体实施方式】中，该TAA或TSA是一种或多种的，例如接合物上的scFv特异性针对以下 一种或多种：EphA2、HER2、⑶2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、5Τ4、8Η9、α ν β 6整联蛋白、B7-H3、 Β7-Η6、CAIX、CA9、CD19、CD20、CD22、κ轻链、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、 CD70、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、 ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胎儿AchR、叶酸受体α、⑶2、⑶3、HLA-AIMAGEAl、HLA-A2、ILllRa、 IL13Ra2、KDR、Lambda、Lewis-Y、MCSP、间皮素、Mucl、Mucl6、NCAM、NKG2D配体、NY-ES0-1、 PRAME、PSCA、PSC1、PSMA、R0R1、SURVIVIN、TAG72、TEM1、TEM8、VEGRR2、癌胚抗原、HMW-MAA、 VEGF受体，以及存在于肿瘤的胞外基质或肿瘤的坏死区中的其他示例性抗原，如生腱蛋白、 纤连蛋白的癌胚变体。
[0085] 在本发明的实施方式中，方法和组合物涉及包含双特异性单链抗体构建体的组合 物。该双特异性单链抗体构建体可包含至少两个结构域或由其组成或基本由其组成，所 述至少两个结构域之一特异性结合肿瘤抗原例如EphA2、HER2、GD2或磷脂酰肌醇蛋白聚 糖-3,且第二个结构域结合T细胞蛋白质例如CD3抗原。
[0086] EphA2 可称作EPH受体A2(肝配蛋白A型受体 2 ;EPHA2 ;ARCC2;CTPA;CTPP1 ;或 ECK)，其在人中是由蛋白质酪氨酸激酶家族的肝配蛋白亚家族中的EPHA2基因编码的蛋 白质。该亚家族中的受体通常包含单个激酶结构域和含有富Cys结构域和2个纤连蛋白 III型重复的胞外区；本发明的抗体的实施方式可靶向这些结构域中任一个。这些肝配蛋 白受体被分成两组，分配依据为其各胞外结构域序列的相似性及其结合肝配蛋白A和肝配 蛋白B配体的亲和力，且EphA2编码的蛋白质结合肝配蛋白A配体。示例性人EphA2核酸 序列是GenBank?登录号NM_004431，并且示例性人EphA2多肽序列是GenBank?登录号 NP_004422,两者都通过引用全文纳入本文。
[0087]HER2可称作人表皮生长因子受体2 (Neu、ErbB-2、CD340或pl85)，其是人中由表皮 生长因子受体（EFR/ErbB)家族中ERBB2基因编码的蛋白质。HER2含有可与大量信号分子 相互作用的胞内结构域、跨膜结构域和胞外配体结合结构域。本发明的抗体的实施方式可 靶向胞外配体结合结构域。
[0088] 示例性人EphA2核酸序列是GenBank?登录号ΝΜ_004448· 2,并且示例性人EphA2 多肽序列是GenBank?登录号NP_004439,两者都通过引用全文纳入本文。
[0089] ⑶2是神经外胚层起源的肿瘤（包括人成神经细胞瘤和黑素瘤）上表达的双唾液 酸神经节苷脂，其在正常组织中具有高度受限制的表达，主要是人中小脑和外周神经。GD2 存在并集中于细胞表面上，其中神经酰胺部分的两条烃链包埋在质膜中而寡糖位于胞外表 面上，它们在该位置呈现胞外分子或邻近细胞表面的识别点。本发明的抗体的实施方式可 靶向胞外结构域。
[0090] 术语"双特异性单链抗体构建体"涉及包含两个抗体衍生的结合结构域的构建体。 在【具体实施方式】中，双特异性单链抗体构建体可以是串联双SCFv或双抗体。结合结构域之 一可包含其能够与例如EphA2、HER2、⑶2或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3特异性结合/相互作用 的抗体的重链（VH)和轻链（VL)两者的可变区（或其部分）、抗体片段或其衍生物。第二个 结合结构域可包含能够与例如人CD3抗原特异性结合/相互作用的抗体的重链（VH)和轻 链（VL)两者的可变区（或其部分）、抗体片段或其衍生物。在具体的实施方式中，可变区的 部分可以是至少一个⑶R( "互补决定区"），如至少⑶R3区。
[0091] 在【具体实施方式】中，本发明的组合物中使用的"双特异性单链抗体构建体"是 双特异性单链Fv(scFv)。通常，scFv含有由接头肽连接的VH和VL结构域。可分泌接 合物由来自细胞的信号肽（以允许分泌）以及随后的由接头肽（Lx，Ly，Lz)连接的2个 scFv组成。接头的长度和序列足以确保第一和第二结构域各自彼此独立，保留其差异接 合特异性。双特异性单链分子是本领域已知的且描述于W0 99/54440;Mack，J. Immunol. (1997)，158, 3965-3970;Mack，PNAS，（1995)，92, 7021-7025;Kufer，Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197；Loffler,Blood,(2000),95, 6, 2098-2103；以及 Bruhl, J. Immunol.,(2001),166, 2420-2426。
[0092] 在本发明的【具体实施方式】中，本发明的示例性分子形式提供了编码特定多肽的溶 瘤病毒多核苷酸构建体，所述多肽包含信号肽和之后的两个抗体衍生的区域。各抗体衍生 的区域（scFv)都包含一个VH和一个八区。在具体的实施方式中，双特异性scFv可以是串 联双scFv或双抗体。双特异性scFv可以不同形式排列：
[0093] VHa-Lx_Vla-Ly_VHβ_Lz_VlβΝVLα-Lx_VHα-Ly_VHβ_Lz_Vlβν
[0094] VL α -Lx-VH α -Ly_VL β -Lz-VH β、VH α -Lx_Vl α -Ly_VL β -Lz-VH β、
[0095] VH α _Lx_Vl β _Ly_VH β_Lz_Vl α、VL α _Lx_Vl β _Ly_VH β _Lz_VH α、
[0096] VH α _Lx_VH β _Ly_VL β_Lz_Vl α、VL α _Lx_VH β _Ly_VL β _Lz_VH α、
[0097]VHβ_Lx_Vlα-Ly_VHα-Lz_VlβΝVLβ_Lx_Vlα-Ly_VHα-Lz_VHβν
[0098]VHβ_Lx_VHα_Ly_VLα_Lz_Vlβ、VLβ_Lx_VHα_Ly_VLα_Lz_VHβ。·因此，具有上述 可能排列的双特异性scFv是所述双特异性单链构建体的【具体实施方式】。
[0099] 在本发明的【具体实施方式】中，该抗体构建体还可包含其他结构域，例如用于分离 和/或制备重组产生的构建体。此外，该抗原结合结构域可含有多个抗原识别结合结构域 以允许靶向多种抗原，而激活结构域可含有多个结构域以激活细胞。
[0100] 术语"单链"在本发明中指所述双特异性单链构建体的第一和第二结构域是共价 连接的，优选以可由单个核酸分子编码的共线性氨基酸序列的形式。
[0101] 术语"与……结合/相互作用"在本发明中指至少两个"抗原相互作用位点"彼此 之间的结合/相互作用。术语"抗原相互作用位点"在本发明中指能够与特定抗原或特定抗 原组特异性相互作用的多肽基序。结合/相互作用也理解为定义"特异性识别"。术语"特 异性识别"在本发明中指能够与本发明所定义各目标分子中的至少两个氨基酸特异性相互 作用和/或结合。该术语涉及抗体分子的特异性，即其区分本发明所定义的人目标分子的 特定区域的能力。抗原相互作用位点与其特定抗原的特异性相互作用可导致信号起始，例 如由于诱导抗原的构象变化、抗原的寡聚化等。此外，还可通过"钥锁原理"的特异性来说 明结合。因此，抗原相互作用位点的氨基酸序列中的特定基序和抗原彼此结合，该结合是其 一级、二级或三级结构的结果，在一些实施方式中也是所述结构的二次修饰的结果。抗原相 互作用位点与其特定抗原的特异性相互作用也可导致该位点与抗原的简单结合。
[0102] 术语"特异性相互作用"在本发明中指双特异性单链构建体与类似结构的 (多）肽不存在或基本不存在交叉反应。可测试所研究的一组双特异性单链构建体的交 叉反应性，例如通过评估该组双特异性单链构建体在常规条件下（参见例如Harlow和 Lane，Antibodies:ALaboratoryManual(《抗体：实验室手册》），冷泉港实验室出版社 (ColdSpringHarborLaboratoryPress)，1988 以及UsingAntibodies:ALaboratory Manual(《使用抗体：实验室手册》），冷泉港实验室出版社，1999)与感兴趣的（多）肽以及 与多个或多或少（在结构和/或功能上）密切相关的（多）肽的结合。只有结合感兴趣的 (多）肽/蛋白质但不结合或基本不结合任何其他（多）肽的那些抗体才被认为是特异性 针对感兴趣的（多）肽/蛋白质。抗体相互作用位点与特定抗原的特异性相互作用的示例 包括配体与其受体的特异性。该定义具体包含结合其特定受体后诱导信号的配体的相互作 用。相应配体的示例包括与其特定细胞因子受体相互作用/结合的细胞因子。所述相互作 用的另一个示例（其也特别包含于所述定义）是抗原性决定区（表位）与抗体的抗原性结 合位点的相互作用。
[0103] 术语"与……结合/相互作用"还可涉及构象表位、结构表位或不连续表位，其 由人目标分子或其部分的两个区域组成。在本发明中，构象表位定义为在一级序列中隔 开的两个或更多个离散的氨基酸序列，其在多肽折叠为天然蛋白时在分子表面上聚拢 (Sela， （1969)Science166, 1365 和Layer, (1990)Cell61，553-6)〇
[0104] 本发明的构建体还考虑与构象/结构表位结合/相互作用，所述构象/结构表位 包含本发明所述人CD3复合物或其部分的两个区域