9] 在一些实施方式中，本发明提供了一种用于治疗晚期实体瘤的有效的溶瘤VV。本 发明建立了使溶瘤VV带T细胞接合物臂来作为新型溶瘤VV的原理，从而为改进的溶瘤病 毒疗法的研发和应用打开了一条新路。该策略适用于多种形式的溶瘤病毒。
[0180] 实施例 3EPHA2-TEA-VV的构建
[0181] 通过将一种形式的含有T细胞接合物的pSEL穿梭质粒整合至WR痘苗病毒 的vSC20毒株的TK基因中来生成表达分泌性EphA2-scFv-CD3-scFv(EphA2-TEA-VV) 或GFP(GFP-VV)的痘苗病毒（西部保留地毒株）。首先，构建穿梭载体pSEL以含有 EphA2-SCFV-CD3-SCFv或GFP(图2)。插入的T细胞接合物在F17R晚期启动子的转录控制 下表达以在T细胞激活前允许足够的病毒复制。这些VV还表达DsRed2以允许监测感染性 (图3)。为了构建编码TE的重组病毒，将穿梭载体pSEL转染至人143TK细胞。随后使用 病毒VSC20以0. 1的感染复数（Μ0Ι)感染细胞。验证TEA表达的三轮斑筛选和扩增后，选 择一个克隆用于扩增和纯化。
[0182] 实施例4
[0183] EPHA2-TEA-VV表达的分泌性功能性双特异性EPHA2-SCFV-CD3-SCFV
[0184] 研究了EphA2-TEA_VV感染的肿瘤细胞是否表达分泌性双特异性 EphA2-scFv-CD3-scFv。为此，以Μ0Ι5 使用EphA2-TEA-VV或GFP-VV转导肺癌细胞系A549 并在孵育后24小时收集细胞培养基。随后将新鲜的人PBMC与收集自VV感染的A549培养 物的培养基孵育，随后使用EphA2-FITC(标记有FITC的EphA2蛋白）、⑶8-PE和⑶4-APC染 色。流式分析显示，EphA2-TEA-VV感染的A549表达分泌性双特异性EphA2-scFv-CD3-scFv 并具有结合人T细胞和EphA2两者的功能（图3)。该结果显示，EphA2-TEA-VV感染的肿瘤 细胞表达分泌性双特异性EphA2-scFv-⑶3-scFv，其能结合人T细胞和肿瘤抗原EphA2。
[0185] 实施例5
[0186] EPHA2-TE表达不削弱VV的复制能力
[0187] 为证明EphA2-TE不削弱EphA2-TEA-VV的复制能力，使用EphA2-TEA-VV、GFP-VV 和母体vSC20VV感染CV-1细胞和正常人皮肤成纤维细胞。使用EphA2-TEA-W、GFP-VV或 vSC20感染CV-1在多个时间点处生成了类似量的病毒（图5)。相比之下，所有三种病毒在 正常人皮肤成纤维细胞中都复制得较差（图5)。因此，EphA2-TE不干扰VV复制。
[0188] 实施例6
[0189] EPHA2-TE表达不削弱VV诱导肿瘤细胞裂解的能力
[0190] 比较了不存在人T细胞时EphA2-TEA-VV或GFP-VV诱导肿瘤细胞裂解的能力。以 递增的Μ0Ι(0、0. 01、0. 1、1或5)使用EphA2-TEA-VV或GFP-VV转导A549细胞并在病毒感 染48小时后通过MTS试验测定A549的活力。使用递增的Μ0Ι杀伤了A549细胞，与使用的 VV无关（图6)。EphA2-TEA-VV和GFP-VV之间不存在差异，表明EphA2-TE的表达不干扰 VV诱导肿瘤细胞裂解的能力。
[0191] 实施例7
[0192] EPHA2-TEA-VV显示人T细胞存在时针对A549的肿瘤裂解活性显著增强
[0193] 随后确定在人T细胞存在的情况下是否存在EphA2-TEA-VV的肿瘤裂解活性。首 先，使用EphA2-TEA-VV或GFP-VV以0. 1的Μ0Ι感染A549细胞。如上文所述添加人T细 胞，并在病毒感染24或48小时后通过MTS试验测定A549活力。在人T细胞存在的情况 下，仅EphA2-TEA-VV显示 24 小时（EphA2-TEA-VV对比GFP-VV，75 %对比 100 % )和 48 小 时（EphA2-TEA-VV对比GFP-VV，35%对比81%)时增强的溶瘤活性（图7)。
[0194] 为进一步确定EphA2-TEA-VV是否将人T细胞重新导向至A549细胞，以递增的 Μ0Ι(Μ0Ι 0. 001、0. 01、0. 1或1)使用EphA2-TEA-VV感染细胞。随后，将人Τ细胞，使用CD4/ ⑶8微珠分离自PBMC的未刺激T细胞，添加至A549细胞，T细胞对A549比例为5:1。在病 毒感染后24、48、72和96小时，通过MTS试验测定A549活力。仅使用EphA2-TEA-VV感染 的A549细胞用作对照。EphA2-TEA-VV本身以剂量依赖的方式诱导细胞杀伤。然而，即使 在最高的测试Μ0Ι下，感染后96小时仍有15%的肿瘤细胞存活（图8B)。向培养物中添加 人T细胞显著（p〈0. 05)提高了抗肿瘤作用，其中在0. 1和1的Μ0Ι下，所有肿瘤细胞都在 感染后96小时内被杀死（图8A)。
[0195] 总之，数据显示EphA2-TEA-VV将人T细胞重导向至A549细胞。
[0196] 实施例8
[0197] EPHA2-TEA-VV激活T细胞
[0198] 为测定由EphA2-TEA-VV分泌的EphA2-TE是否不仅将T细胞重导向至肿瘤细胞还 激活人细胞，以1或0. 1的Μ0Ι使用EphA2-TEA-VV或GFP-VV感染A549细胞。如上文所述 添加人T细胞，并在病毒感染24或48小时后收集细胞培养基以通过ELISA确定促炎性细 胞因子的存在。人T细胞被EphA2-TE激活的证据是，与GFP-VV感染的A549和人T细胞 相比，EphA2-TEA-VV感染的A549和人T细胞的细胞培养上清液中产生促炎性细胞因子如 IFN- β和IL-2 (p〈0. 05)。作为对于GFP-VV感染的A549的应答，T细胞产生很少至不产生 IFN-β和IL-2(图9)。这些结果表明，T细胞激活依赖于肿瘤细胞的EphA2-TE表达。
[0199] 实施例9
[0200] TEA-VV诱导的未感染肿瘤细胞的周边杀伤
[0201] 考虑了TEA-VV诱导周边杀伤未被痘苗病毒感染的肿瘤细胞的能力。首先，以多种 Μ0Ι使用EphA2-TEA-VV、mTEA-VV或GFP-VV转导EphA2阳性肺癌细胞系A549。48小时培 养后收集细胞培养基。随后，在收集自经TEA-VV感染的A549培养物的细胞培养基存在的 情况下，将未感染的A549与新鲜PBMC共培养。48小时后，使用MTS试验测量肿瘤杀伤。结 果显示，A549仅在经EphA2-TEA-VV感染的A549的细胞培养基存在的情况下被杀伤，显示 了肿瘤细胞的周边杀伤（图9)。
[0202] 实施例10
[0203] 痘苗病毒中的EPHA2T细胞接合物显示增强的抗肿瘤作用
[0204] 使用体内肿瘤模型，在人T细胞存在的情况下，表征示例性EphA2-TEA-VV对抗肿 瘤作用的增强效果。
[0205] 为研究EphA2-TEA-VV在体内的抗肿瘤作用，我们最初使用皮下A549肿瘤模型。为 建立A549肿瘤，将2x 106个A549细胞与来自健康供体的未刺激PBMC混合并皮下接种至 SCID-取小鼠的右肋，随后在第0天腹腔注射lx 108vp的EphA2-TEA-VV或GFP-VV。接受 PBS的小鼠用作对照。与对照小鼠相比，GFP-VV中等抑制肿瘤生长。相反地，与接受GFP-VV 或PBS的小鼠相比，接受EphA2-TEA-VV的小鼠显示肿瘤生长的显著降低（EphA2-TEA-VV对 比GFP-VV p〈0. 0001)(图11)。此外，与GFP-VV或PBS组相比，EphA2-TEA-VV还大幅提高 小鼠存活（图12)。
[0206] 为研究EphA2-TEA-VV的抗肿瘤作用，在第0天将表达萤光素酶的A549细胞 (A549.eGFP.ffluc)静脉内注射至SCIDIg小鼠。在第7天，静脉内给予10x 106个未处理 的PBMC与lx10svp的EphA2-TEA-VV或GFP-VV混合物。仅接受PBMC的小鼠被用作对照。 生物发光成像的定量显示，与对照相比，GFP-VV加PBMC仅中等抑制肿瘤生长。相反地，与接 受GFP-VV加PBMC或只接受PBMC的小鼠相比，接受EphA2-TEA-VV加PBMC的小鼠显示肿瘤 生长的显著降低（图12,EphA2-TEA-VV对比GFP-VVp〈0. 05)。因此，在两种动物模型中， 与GFP-VV相比，EphA2-TEA-VV都导致增强的抗肿瘤活性。
[0207] 实施例11
[0208]HER2-TE的构建和功能
[0209] 为表征分泌性双特异性HER2-TE诱导杀伤HER2+肿瘤细胞的能力，构建了慢病毒， 其编码分泌性双特异性HER2-TE和GFP(HER2-TE)或仅GFP(GFP)(图14A)。将Lv-HER2-TE 或Lv-GFP感染的A549与未感染的A549 (GFP-)混合，随后与未刺激的PBMC共培养两天。 通过流式细胞术测量肿瘤细胞杀伤。LV-HER2-TE诱导了GFP+和GFP-A549细胞的杀伤，而 Lv-GFP不诱导A549的杀伤，表明受感染肿瘤所表达的分泌性双特异性TE诱导未受病毒感 染的肿瘤细胞的周边杀伤（图14B)。总之，这些结果显示，HER2-TE诱导⑶3+T细胞介导的 未感染A549细胞的杀伤。
[0210] 实施例12
[0211] 双SCFV串联HER2-TE和双抗体HER2-TE的比较
[0212] 为比较双特异性串联HER2-TE和双抗体HER2-TE诱导杀伤⑶2+肿瘤细胞的 能力，构建了慢病毒，其编码分泌性双特异性串联HER2-TE(双SCFv-HER2-TE)、双抗体 HER2-TE(双抗体-HER2-TE)或仅GFP(GFP)(图 15)。将Lv-双-scFv-HER2-TE、Lv-双抗 体-HER2-TE或Lv-GFP感染的HER2+肿瘤细胞系A549与未刺激的PBMC共培养。24小时后 在显微镜下监测肿瘤细胞杀伤。Lv-双-scFv-HER2-TE或Lv-双抗体-HER2-TE都有效地诱 导杀伤HER2+A549肿瘤细胞，而Lv-GFP不诱导杀伤这些细胞（图16B)。这些结果显示，双 特异性串联HER2-TE和双抗体HER2-TE都能有效地诱导CD3+T细胞介导的HER2+肿瘤细胞 杀伤。
[0213] 实施例13
[0214] ⑶2-TE的构建和功能
[0215] 为表征双特异性GD2-TE诱导GD2+肿瘤细胞杀伤的能力，构建了慢病毒，其编码分 泌性双特异性⑶2-TE和GFP(⑶2-TE)或仅GFP(GFP)(图16A)。将Lv-GD2-TE或Lv-GFP 感染的GD2+肿瘤细胞系JF或LAN2与未刺激的PBMC共培养。在显微镜下监测肿瘤细胞杀 伤。LV-GD2-TE诱导杀伤⑶2+肿瘤细胞系JF和LAN1，而Lv-GFP不诱导杀伤这些细胞（图 16B)。这些结果显示，⑶2-TE诱导⑶3+T细胞介导的⑶2+肿瘤细胞杀伤。
[0216] 研发了TEA-0V技术以生产增强的溶瘤病毒作为癌症疗法。该技术可适用于任何 已知的溶瘤病毒和任何已知的肿瘤抗原。通过使用溶瘤痘苗病毒和EphA2肿瘤抗原作为模 型，其表明表达T细胞接合物的溶瘤病毒i)杀伤EphA2阳性肿瘤细胞，ii)诱导未被病毒 感染的EphA2阳性肿瘤细胞的周边杀伤。该技术在整个病毒癌症治疗领域有广泛用途并可 适用于所选择的任何溶瘤病毒和肿瘤抗原。
[0217] 实施例14
[0218] 说明性实施例
[0219] 用于肝细胞癌（HCC)的HN3-TE和GC33-TE的构建和功能（HN3和GC33是针对 HCC抗原磷脂酰基醇蛋白聚糖-3的两种抗体克隆）。为表征双特异性EphA2-TE、HN3-TE和GC33-TE诱导杀伤HCC的能力，构建了逆转录病毒（Rv)，其编码分泌性双特异性EphA2-TE、 HN3-TE、GC33-TE和⑶2-TE(图17A)。将逆转录病毒感染的人PBMC与HCC系Huh7或Η印G2 共培养并通过6小时Cr释放CTL试验测定肿瘤细胞毒性。结果显示，EphA2-TE、HN3-TE或 GC33-TE有效地诱导HCCHuh7或Η印G2的裂解。
[0220] 图18显示构建三聚体或二聚体形式的带4-1BBL臂的Τ细胞接合物的方法。三聚 体-41BBL-HER2-T细胞接合物编码将形成稳定三聚体的胶原XVNC1结构域（col)的Ν端 三聚化区域。二聚体-41BBL-HER2-T细胞接合物编码将形成稳定二聚体的人IgGlCH2CH3 结构域。4-1BBL属于TNF超家族且其二聚体或三聚体形式是显著的共刺激功能所必需的。
[0221] 图19显示带4-1BBL臂的TEA-VV的增强的抗肿瘤作用。带4-1BBL臂的TEA-VV通 过三种机制增强TEA-VV的抗肿瘤作用：1)T细胞接合物的三聚化或二聚化提高了scFv对 靶标的结合亲和力，2) 41BB-L还激活T细胞，以及3) 41BB-L共刺激赋予T细胞克服调节性 T细胞所介导免疫抑制的能力。
[0222] 图20显示共刺激信号转导4-1BBL还增强肿瘤杀伤作用和诱导T细胞激活。生 成了慢病毒，其表达41BBL-HER2-T细胞接合物或对照慢病毒载体（Lv-GFP、LV-HER2-TE、 Lv-二聚体-41BBL-HER2-TE或三聚体-41BBL-HER2-TE)。使用慢病毒感染人A594-GFP肺 肿瘤细胞（HER2阳性）并将其与未刺激的人PBMC共培养。48小时后，观察到4-1BBL的共 刺激显著增强了TEA-VV的裂解活性。此外，收集了细胞培养上清液用于细胞因子ELISA。 未刺激的人PBMC被41BBL激活，正如根据促炎性细胞因子（如IFNy和IL2)的产生所判 断的那样（图21)。
[0223] 尽管已经详细描述了本发明和其优势，但是应当理解，可对本文进行各种变化、替 代和改变而不背离所附权利要求所定义的本发明的精神和范围。此外，本申请的范围不是 旨在限制于本说明书所述的形式、手段、方法和步骤的过程、机器、制造、组合物的具体实施 方式。本领域普通技术人员通过本发明的内容将容易理解，现存或后续开发的与本文所述 相应实施方式实施基本相同功能或实现基本相同结果的形式、手段、方法、或步骤的过程、 机器、制造、组合物均可使用。因此，所附权利要求旨在将形式、手段、方法、或步骤的过程、 机器、制造、组合物包括在其范围内。
【主权项】
1. 一种溶瘤病毒，其编码的两部分分子包含特异性针对细胞表面分子的单链可变区片 段（scFv)和特异性针对肿瘤抗原的scFv。2. 如权利要求1所述的病毒，所述细胞表面分子在效应细胞上。3. 如权利要求2所述的病毒，所述效应细胞是T淋巴细胞。4. 如权利要求1所述的病毒，所述肿瘤抗原选自EphA2、HER2或⑶2。5. 如权利要求1所述的病毒，所述细胞表面分子选自⑶3、⑶4、⑶5、⑶8、⑶16、⑶28、 CD40、CD134、CD137 和NKG2D。6. 如权利要求1所述的病毒，所述细胞表面分子是CD3。7. 如权利要求1所述的病毒，所述溶瘤病毒是痘苗病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒（HSV)、 黏液瘤病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、水泡性口炎病毒（VSV)、麻疹病毒（MV)或新城 疫病毒（NDV)。8. -种治疗个体中癌症的方法，包括向所述个体递送治疗有效量的权利要求1所述的 病毒的步骤。9. 如权利要求8所述的方法，所述病毒的量包括10 5-1013pfu的所述病毒。10. 如权利要求8所述的方法，还包括向所述个体递送其他癌症治疗的步骤。11. 如权利要求10所述的方法，所述其他癌症治疗是手术、放疗、化疗、免疫治疗、激素 疗法或其组合。
【专利摘要】本发明的各实施方式涉及用于治疗癌症的溶瘤病毒(如痘苗病毒)，这些病毒编码的接合分子具有激活结构域以及抗原识别结构域，所述激活结构域识别T细胞上的细胞分子如CD3，所述抗原识别结构域识别肿瘤抗原如EphA2、HER2、GD2或磷脂酰基醇蛋白聚糖-3。在一些实施方式中，这些接合分子还包含例如细胞因子或共刺激结构域。本发明还包括使用一种或多种这类组合物治疗癌症的方法。
【IPC分类】C07K16/30, A61K35/76, A61K35/768, C07K16/28
【公开号】CN105407902
【申请号】CN201480025597
【发明人】宋晓彤, S·M·戈茨查克, 于峰
【申请人】贝勒医学院
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2014年3月5日
【公告号】CA2903096A1, EP2964241A1, US20160000842, WO2014138314A1