溶瘤病毒的制作方法

溶瘤病毒的制作方法
【专利说明】
[0001] 本发明要求2013年3月5日提交的美国临时专利申请第61/772, 803号的优先权， 其通过引用全文纳入本文。
技术领域
[0002] 本发明的领域至少包括免疫学、病毒学、细胞生物学、分子生物学和医药，包括癌 症医药。
【背景技术】
[0003] 虽然若干恶性肿瘤的治愈率已得到显著改善，但在过去的数十年中晚期实体瘤患 者的结果仍残酷地维持不变，这强调需要新疗法。溶瘤痘苗病毒是现有实体瘤治疗选项的 有用补充，因为其具有安全性和能够感染肿瘤细胞、在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞。虽 然临床研究已显示瘤内或静脉内注射溶瘤痘苗病毒是安全的并可诱导肿瘤裂解，但溶瘤痘 苗病毒的抗肿瘤效力未达到最佳且大多数肿瘤发生，这强调需要对溶瘤痘苗病毒疗法进行 进一步改进。
[0004] 概述
[0005] 本发明涉及用于针对个体的免疫治疗的方法和/或组合物。在【具体实施方式】中， 所述个体是患有癌症且需要癌症治疗的哺乳动物。该癌症可以是任何类型，包括肺癌、乳腺 癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌、脾癌、皮肤癌、脑癌、血液癌、肾癌、甲状腺癌等。 该癌症可以是实体瘤。在特定情况下，该癌症具有一种或多种肿瘤标志物，包括肿瘤抗原。 在本发明的特定方面中，一种或多种肿瘤抗原可存在于至少一些癌细胞中，且一种或多种 肿瘤抗原可以是免疫治疗的靶标。
[0006] 在本发明的【具体实施方式】中，提供了涉及适应于免疫治疗的重组溶瘤病毒（例如 具有T细胞接合物臂的溶瘤病毒（TEA-0V))载体的方法和组合物。本发明提供的TEA-0V提 供的益处超过单独的溶瘤病毒和单独的T细胞，益处在于重组溶瘤病毒在直接杀伤肿瘤细 胞外，还通过刺激被病毒感染的肿瘤附近的T细胞来杀伤肿瘤细胞。在具体的实施方式中， 这些载体经瘤内注射或静脉内注射，但本发明也涵盖其他递送方式。在某些实施方式中，该 载体包含双特异性活性，且在【具体实施方式】中其涉及存在激活结构域和抗原识别结构域。 在具体方面中，该溶瘤病毒载体是具有T细胞接合物臂的痘苗病毒，称作TEA-VV。
[0007] 在第一方面中，提供了重组溶瘤病毒，例如溶瘤痘苗病毒，其经工程改造以包含具 有启动子的表达区域，该启动子引导编码双特异性T细胞接合物多肽（例如靶向EphA2、 HER2、GD2或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的接合物）的核酸表达。在【具体实施方式】中，该双特异 性T细胞接合物多肽包含激活结构域和抗原识别结构域。在某些实施方式中，该激活结构 域是T细胞受体多肽的受体或配体，例如结合CD3以激活T细胞的多肽。在某些实施方式 中，该抗原识别结构域是针对目标细胞（如癌细胞）上细胞表面蛋白质的受体或配体。在 更具体的实施方式中，激活结构域和/或抗原识别结构域之一或两者都是抗体，例如单链 抗体，例如单链可变区片段（scFv)。在具体的实施方式中，该抗原识别结构域结合目标细 胞上存在的分子，且该抗原识别结构域结合的细胞受体引发最终对受体目标分子具有毒性 的过程。在【具体实施方式】中，双特异性涉及两个抗体片段或抗原结合片段或其衍生物，如单 链可变区片段（scFv)。虽然在某些实施方式中一个scFv特异性针对CD3,但在替代性实施 方式中，该scFv特异性针对TCR复合物的另一组分。本领域技术人员应理解，TCR复合物 是可变TCRa和β链的八聚体复合物，其具有三个二聚体信号转导模块⑶3δ/ε、⑶3 γ/ ε和⑶3 ζ / ζ或ζ/η。虽然在一些情况下本发明公开的组合物使用scFv靶向⑶3ε，但 本发明也涵盖使用特定scFv靶向其他⑶3分子（特别是⑶3ζ)或TCRa和β链。在具 体实施方式中，本发明涵盖的靶向分子不是TCR复合物的一部分（⑶27、⑶28、⑶40、⑶134、 ⑶137和⑶278)。在具体的实施方式中，一个scFv特异性针对Τ淋巴细胞上的⑶3分子且 另一scFv特异性针对选择的具体肿瘤抗原。
[0008] 在某些实施方式中，且不受理论的限制，带T细胞接合分子臂的溶瘤病毒（例如带 T细胞接合物臂的溶瘤痘苗病毒）促进肿瘤中的T细胞浸润并通过病毒表达的T细胞接合 分子诱导未受病毒感染的肿瘤细胞的周边杀伤（bystanderkilling)，导致增强的抗肿瘤 作用。
[0009] 可选择或调节针对肿瘤抗原的特定scFv以识别相应癌细胞，该癌细胞包含（例如 在其细胞表面上显示的）特定肿瘤抗原。在【具体实施方式】中，该肿瘤抗原是：EphA2、HER2、 ⑶2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、5Τ4、8Η9、α νβ6整联蛋白、B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、 CD20、CD22、κ轻链、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD 123、CD 138、CD 171、 CEA、CSPG4、EGFR、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胎 儿AchR、叶酸受体a、⑶2、⑶3、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2、ILllRa、IL13Ra2、KDR、Lambda、 Lewis-Y、MCSP、间皮素、]?11。1、]\111。16、从^1、疆620配体、附450-1、？狀1^、？5〇厶、？5(：1、？5嫩、 R0R1、SURVIVIN、TAG72、TEM1、TEM8、VEGRR2、癌胚抗原、HMW-MAA、VEGF受体，以及其他在肿 瘤的胞外基质或肿瘤的坏死区中存在的示例性抗原，如生腱蛋白、纤连蛋白的癌胚变体。
[0010] 在【具体实施方式】中，本发明提供了一种溶瘤痘苗病毒，其包含编码双特异性T细 胞接合分子的多核苷酸，所述双特异性T细胞接合分子靶向EphA2并能比未改良的痘苗 病毒更有效地诱导表达EphA2的肿瘤的裂解。在【具体实施方式】中，该病毒载体编码双特异 性T细胞接合分子且还编码表达共刺激分子的一个或多个多核苷酸，所述共刺激分子包括 CD70、CD80、CD83、CD86、CD134L(0X40L)和CD137L(41BBL)。在一些实施方式中，该病毒载体 编码至少一个二聚化结构域或至少一个三聚化结构域。该二聚化或三聚化结构域可以某些 构型位于病毒载体上。在【具体实施方式】中，编码二聚化或三聚化结构域的核酸序列位于编 码激活结构域和抗原识别结构域的核酸之间。具体的示例性本发明组合物包含例如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7 的序列。
[0011] 在某些实施方式中，该痘苗病毒可以是惠氏（Wyeth)、改良痘苗安卡拉（MVA)、李 斯特（Lister)或西部保留地（WR)毒株。该启动子可以是痘苗病毒启动子、合成的启动子、 至少在至少感染早期期间引导转录的启动子，或至少在感染晚期期间引导转录的启动子。
[0012] 本发明的一种示例性TEA-VV在体外和体内表达功能性双特异性接合分子；显示 的病毒/复制/肿瘤裂解效力与未改良的痘苗病毒相似；与未改良的痘苗病毒相比在人T 细胞存在时更有效地诱导肿瘤杀伤；和/或有效地诱导未感染病毒的细胞的周边杀伤；该 组合物还在体内抑制肿瘤进展。仅作为说明性示例，使用本发明的方法杀伤了A549腺癌性 人齿槽基底上皮细胞。
[0013] 在另一个实施方式中，可以使用除溶瘤痘苗病毒以外的任何类型的合适的溶瘤病 毒载体以表达用于癌症治疗的双特异性T细胞接合分子。在具体的实施方式中，该载体是 溶瘤腺病毒载体（AdV)、单纯疱疹病毒（HSV)、呼肠孤病毒、黏液瘤病毒（MYXV)、脊髓灰质炎 病毒、水泡性口炎病毒（VSV)、麻疹病毒（MV)和新城疫病毒（NDV)等。在某些实施方式中， 该病毒多核苷酸编码包含激活结构域和抗原识别结构域的融合分子，且在【具体实施方式】中 各结构域是scFv。该激活结构域的位置可相对抗原识别结构域位于多肽的N端，或该激活 结构域的位置可相对抗原识别结构域位于多肽的C端。
[0014] 可通过本领域中任何合适的遗传重组方法生成重组溶瘤病毒。
[0015] 在另一个方面中，提供了一种治疗患有癌症的个体的方法，包括给予该个体治疗 有效量的TEA-0V，例如，所述TEA-0V表达的T细胞接合物包含抗原识别结构域，该抗原识别 结构域结合所述癌症显示的TAA或TSA。在【具体实施方式】中，向个体给予重组带T细胞接 合物臂的溶瘤病毒（TEA-VV)。在【具体实施方式】中，该TEA-VV通过瘤内、肌内、静脉内、动脉 内、腹膜内、皮下、鞘内或鼻内给予。
[0016] 在某些实施方式中，提供了一种治疗个体中癌症的方法，包括以下步骤：向该个体 递送治疗有效量的本发明所述病毒，包括编码双特异性分子的溶瘤病毒，所述双特异性分 子包含特异性针对细胞表面分子的scFv和特异性针对肿瘤抗原的scFv。在【具体实施方式】 中，给予个体的病毒量（如治疗有效量）包含l〇5-l〇13pfu的病毒。本发明的方法可包括向 个体递送其他癌症治疗的步骤，如手术、放疗、化疗、免疫治疗、激素治疗或其组合。本发明 的方法可包括鉴定个体需要癌症治疗的步骤。
[0017] 在一个实施方式中，存在一种遗传工程改造的溶瘤病毒，其包含的核酸序列编码 的分子包含激活结构域和抗原识别结构域，激活结构域结合免疫细胞上靶标，抗原识别结 构域结合由目标细胞生成或呈递的一种或多种分子。在【具体实施方式】中，所述激活结构域 和所述激活结构域由接头连接。在一些实施方式中，该病毒还包含编码一种或多种共刺激 分子的核酸。在某些实施方式中，该病毒还包含编码二聚化结构域的核酸。在具体实施方 式中，该病毒还包含编码三聚化结构域的核酸。在一些实施方式中，该激活结构域包含抗 体、配体、受体或肽。在某些实施方式中，该免疫细胞是T细胞且该激活结构域是识别CD3 的抗体，且在一些实施方式中，该免疫细胞是NK细胞且该激活结构域是识别CD16、NKG2D或 NKp30的抗体。在一些实施方式中，该抗体是单链可变区片段（scFv)抗体。在某些实施方 式中，该抗原识别结构域是识别目标细胞所生成抗原的抗体。在特定情况中，该抗体是scFv 抗体。在一些实施方式中，该抗原识别结构域是配体、肽或可溶性TCR。在【具体实施方式】中， 该病毒编码的多肽包含SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQID N0:5、SEQIDN0:6或SEQIDN0:7的序列。各实施方式还包含一种病毒，其中抗原是肿瘤抗 原，例如选自：EphA2、HER2、⑶2、磷脂酰基醇蛋白聚糖-3、5了4、8!19、€[36整联蛋白、87-!13、 B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、 CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、FAP、FAR、FBP、胎儿 AchR、FRa、⑶3、HLA-A1+MAGE1、ILllRa、IL13Ra2、κ、KDR、λ、Lewis-Y、MCSP、间皮素、 Mucl、Mucl6、NCAM、NKG2D配体、NY-ES0-1、PRAME、PSCA、PSMA、R0R1、SURVIVIN、TAG72、TEM1、 TEM8和VEGRR2。在某些实施方式中，免疫细胞上的靶标选自⑶3、⑶16、NKG2D、NKp30和非 变异TCR。免疫细胞上的靶标可以是CD3。在一些情况下，该溶瘤病毒是痘苗病毒，但在一 些实施方式中该溶瘤病毒是腺病毒、单纯疱疹病毒（HSV)、黏液瘤病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰 质炎病毒、水泡性口炎病毒（VSV)、麻疹病毒（MV)或新城疫病毒（NDV)。在具体的实施方式 中，一种或多种共刺激分子选自4-1BBL、⑶80、⑶86、⑶83和0X40L。在一些实施方式中，该 二聚化结构域是IgGlCH2CH3结构域、亮氨酸拉链、螺旋-环-螺旋、锚蛋白或PAS结构域。 在【具体实施方式】中，该三聚化结构域来自XVNCI型人胶原、I型胶原、II型胶原、III型胶 原、IV型胶原、V型胶原、XI型胶原、T4噬菌体次要纤维蛋白（fibritin)的C端结构域或 Nemo三聚化结构域。
[0018] 在本发明的一个实施方式中，提供了一种治疗个体癌症的方法，包括向个体递送 治疗有效量的本发明的病毒的步骤。在一些实施方式中，病毒量包含l〇5_l〇13pfu的病毒。在 一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：向个体递送其他癌症治疗，如手术、放疗、化疗、 免疫治疗、激素治疗或其组合。在一些实施方式中，该方法还包括鉴定该个体是否需要进行 癌症治疗的步骤。
[0019] 前述内容相当宽泛地描述了本
【发明内容】
的特征和技术优点，使得能够更好地理解 以下的详细说明。以下描述的本发明的其他特征和优点构成本发明要求保护的主题。本领 域的技术人员应理解，所揭示的观念和【具体实施方式】可以方便地被用作改进或设计实现本 发明的同样目的的其他构思的基础。本领域的技术人员还应认识到这些等价构思没有偏离 所附权利要求书中提出的本发明的精神和范围。被认为是本发明的特征的新特征，对于其 构建和方法的操作，还有其他对象和优点等，可以结合以下详细的说明和附图一起，得到更 好的理解。但应理解，各附图仅仅是为了示意和说明，并不旨在对本发明进行限定。
[0020] 附图简要说明
[0021] 为了更完整地理解本发明，下文结合附图提供说明，附图中：
[0022] 图1显示TEA-VV的示例性原理；
[0023]图 2 提供 了编码EphA2-scFv-CD3-scFv(EphA2-TEA-VV)或GFP(GFP-VV)的表达盒 的示例性示意图；
[0024] 图3显示在F17R晚期启动子的转录控制下，病毒复制是GFP表达所需的；
[0025] 图4显示EphA2-TEA-VV表达分泌性双特异性EphA2-scFv-CD3-scFv，其具有结合 人T细胞和肿瘤抗原EphA2的能力。以Μ0Ι5使用EphA2-TEA-VV或GFP-VV感染A549肿瘤 细胞（6孔板中lxl06/2ml/孔）。孵育24小时后收集培养基并添加至lxlO6未刺激的PBMC， 随后进行EphA2-FITC、⑶8-PE和⑶4-APC的染色。插入的数目是来自门选的⑶8+或⑶4+ 细胞的EphA2阳性细胞群体百分比；
[0026] 图5A和5B表明，与母体VV相比，EphA2-TEA-VV在CV-1细胞和正常人细胞中显示 类似的病毒复制能力。显示了CV-l(A)和正常人成纤维细胞（B)中EphA2-TEA-VV、GFP-W 和vSC20的复制。以0. 1的Μ0Ι感染细胞并在1、2或3天后通过CV-1细胞中的菌斑试验 测定病毒效价；
[0027] 图6表明，在人T细胞不存在的情况下，EphA2-TEA-VV显示的针对EphA2+A549 肿瘤细胞的肿瘤裂解能力与GFP-VV相思。使用递增剂量（MOI0.01、0. 1、1或5)的 EphA2-TEA-VV(EphA2-VV)或GFP-VV感染A549肿瘤细胞。通过MTS试验测定感染后48小 时的细胞活力。结果表明，在人T细胞不存在的情况下，EphA2-TEA-VV或GFP-VV显示类似 的针对A549肿瘤细胞的肿瘤裂解活性。
[0028] 图7表明，在人T细胞存在的情况下，EphA2-TEA-VV显示的针对EphA2+A549肿瘤 细胞的肿瘤裂解能力比GFP-VV有增强。以Μ0Ι0. 1使用EphA2-TEA-VV或GFP-VV感染A549 肿瘤细胞。在一些实验中，将人T细胞与A549细胞共培养（T:A549 = 5:1)。通过MTS试验 测定感染后多个时间点的细胞活力；
[0029] 图8A和8B表明，在人T细胞存在的情况下，EphA2-TEA-VV针对EphA2+A549肿瘤 细胞的肿瘤裂解能力是病毒剂量依赖的。使用递增剂量（Μ0Ι0. 001、0. 01、0. 1或1)使用 EphA2-TEA-VV感染A549肿瘤细胞。在一些实验中，将人T细胞与A549细胞共培养（T:A549 =5:1)。通过MTS试验测定感染后24或48小时的细胞活力；
[0030] 图 9A-9D表明EphA2-TEA-VV激活人T细胞。以Μ0Ι0· 1 或 1 使用EphA2-TEA-VV 或GFP-VV感染A549细胞。在人T细胞存在的情况下培养感染的A549细胞（T细胞：A549 比例=5:1)。24、48或72小时后，收集上清液并通过ELISA测定IFN-γ(A和B)和IL-2(C 和D)生产；
[0031] 图10表明EphA2-TEA-VV诱导肿瘤细胞的周边杀伤。以多种Μ0Ι使用 EphA2-TEA-VV或GFP-VV感染A549并在24小时后收集上清液并用于PBMC和A549细胞的 共培养试验（PBMC:肿瘤细胞=5:1)。48小时后，通过MTS试验测量肿瘤细胞杀伤；