癌症。
[0136] 本发明设想使用标准载体和/或基因递送系统来单独或联合给予上文定义的细 胞、双特异性单链抗体构建体、核酸分子和载体，并在至少一些情况下与药学上可接受的运 载体或赋形剂联用。给药后，所述核酸分子或载体可稳定地整合至对象的基因组中。
[0137] 在具体的实施方式中，可使用特异性针对某些细胞或组织且在所述细胞中持续存 在的病毒载体。合适的药学运载体和赋形剂在本领域是众所周知的。根据本发明制备的组 合物可而用于预防或治疗或延缓上文指出的疾病。
[0138] 此外，本发明涉及一种预防、治疗或缓解肿瘤性疾病的方法，包括以下步骤：给予 有此需要的对象有效量的细胞，所述细胞携带上文所述双特异性单链抗体构建体、上文所 述核酸序列、上文所述载体，和/或由上文所述方法产生。
[0139] 本发明的实施方式涉及包含上文所述双特异性单链抗体构建体、上文所述核酸序 列、上文所述载体和/或上文所述宿主的试剂盒。还设想本发明的试剂盒包含上文所述药 物组合物，其单独包含所述药物组合物或还组合有待给予需要医学治疗或干预的个体的其 它药物。
[0140] 溶瘤病毒的治疗性应用
[0141] 通过示例的方式，可如本文所述治疗癌症患者或易患癌症的患者或疑似患有癌症 的患者。本文所述的溶瘤病毒可给予个体并且停留延长的时间段。该个体可接受一次或多 次病毒给药。在一些实施方式中，这些病毒经包封以抑制免疫识别并置于肿瘤位点。本发明 的实施方式还涉及用于生产本发明所述组合物的方法，用于预防、治疗或缓解癌症的方法， 以及溶瘤病毒在预防、治疗或缓解癌症中的用途。
[0142] 在多个实施方式中，这些表达构建体、核酸序列、载体、宿主细胞和/或包含这些 物质的药物组合物可用于预防、治疗或缓解癌性疾病，如肿瘤性疾病。在【具体实施方式】中， 本发明的药物组合物特别可用于预防、缓解和/或治疗癌症，包括例如具有实体瘤的癌症。
[0143] 给予本发明的组合物的可能适应症是癌症，包括肿瘤疾病，包括乳腺癌、前列腺 癌、肺癌和结肠癌或上皮癌，如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、头颈癌、皮肤癌、生殖 _泌尿道癌 症，例如卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌和肾癌、肺癌、胃癌、小肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆 管癌、食道癌、唾液腺癌和甲状腺癌。在【具体实施方式】中，使用本发明的方法和组合物治疗 血液恶性肿瘤，包括但不限于白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征。例如， 在具体的实施方式中，该癌症是EphA2、HER2、GD2或磷脂酰基醇蛋白聚糖-3阳性的。在其 他具体的实施方式中，该癌症对本文列举的任意肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是阳性， 例如展示于其细胞表面上。给予本发明的组合物可用于所有阶段和类型的癌症，包括微量 残存病、早期实体瘤、晚期实体瘤和/或转移性实体瘤。
[0144] 本文所用"治疗"或"处理"包括对疾病或病理状况的症状或病变的任何有益或需 要的效果，并且可包括受治疗的疾病或病症（例如，癌症）的一种或多种可测量标志物的甚 至很小的减少。治疗可任选地包括疾病或病症的症状的降低或缓解，或者疾病或病症进展 的延迟。"治疗"不一定表示疾病或病症或其相关症状的完全根除或愈合。
[0145] 本文所用的"预防"和类似词汇如"防止"等表示用于预防、抑制或降低疾病或病 症（例如，癌症）出现或复发的可能性的方法。其也指延迟疾病或病症的发生或复发或者 延迟疾病或病症的症状的出现或复发。本文所用"预防"和类似词汇也包括在疾病或病症 发生或复发之前降低疾病或病症的强度、影响、症状和/或负担。
[0146] 在具体的实施方式中，本发明部分考虑可将病毒、表达构建体、核酸分子和/或载 体单独使用或与其他疗法联用，且在至少一些方面中，与药学上可接受的运载体或赋形剂 一同使用。在某些实施方式中，在给予病毒前，其可与本领域熟知的合适的药学运载体和赋 形剂合并。根据本发明制备的组合物可而用于预防或治疗癌症或延缓癌症的发生或恶化。
[0147] 此外，本发明涉及一种预防、治疗或缓解癌性（包括肿瘤性）疾病的方法，包括以 下步骤：给予有此需要的对象有效量的本发明的溶瘤病毒，该病毒表达的分子包含激活结 构域和抗原识别结构域，激活结构域结合免疫细胞上的靶标，抗原识别结构域结合目标细 胞生成或呈递的一种或多种分子。本发明包括编码接合物的核酸序列、编码接合物的载体， 其如本发明所述和/或通过本发明所述方法产生。
[0148] 本发明还包括联合其他癌症疗法的共同给药方案，这些其它疗法例如双特异性构 建体、革G向毒素或其他化合物，包括通过免疫细胞作用的那些，包括T细胞治疗。共同给予 本发明的组合物的临床方案可包括在给予其他组分同时、之前和/或之后共同给予。具体 组合疗法包括化疗、放疗、手术、激素疗法和/或其他类型的免疫疗法。
[0149] 多个实施方式涉及包含一种或多种本发明所述溶瘤病毒、本发明所述核酸序列、 本发明所述载体和/或本发明所述宿主的试剂盒。还考虑本发明的试剂盒包含上文所述药 物组合物，其单独包含所述药物组合物或还组合有待给予需要医学治疗或干预的个体的其 他药物。
[0150] 可以多种方式将病毒导入宿主生物体（如哺乳动物）。在【具体实施方式】中，在肿瘤 位点处导入病毒，但在替代性实施方式中，病毒定位到癌症或者经修饰定位到癌症。所采用 的病毒数量将取决于多种情况、导入的目的、细胞的寿命、待使用的方案例如给药的次数、 病毒的稳定性等。这些病毒可在分散体中施用，并可在感兴趣的位点处或附近注射。这些 病毒可以在生理上可接受的介质中。
[0151] 该溶瘤病毒可静脉内或动脉内给予。该溶瘤病毒可分散在用于注射的药学上可接 受的制剂中。个体可给予约lO'lO'lO'lO'lO'lO'lO'lO'K^pfu的病毒。该个体可 给予多次溶瘤病毒，包括1、2、3、4、5、6或更多次。
[0152] 应理解，该系统是可变的。因此，即使存在可给予大部分群体的病毒，仍预期对于 各个体患者应监测各患者的个体合适剂量，并且这类监测患者的实践在本领域中是常规 的。
[0153] 药物组合物
[0154] 根据本发明，术语"药物组合物"指用于给予个体的组合物。在优选的实施方式 中，该药物组合物包括用于胃肠道外、透皮、管腔内、动脉内、鞘内或静脉内给药或用于直接 注射入癌的组合物。具体设想通过输注或注射向个体给予所述药物组合物。可通过不同方 式实现合适组合物的给予，例如通过静脉内、皮下、腹膜内、肌内、局部或皮内给药。本发明 的药物组合物还可包含药学上可接受的运载体。合适的药学运载体的示例是本领域已知的 且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液，如油/水乳液、多种类型的润湿剂、无菌溶液等。可 通过熟知的常规方法配制包含这类运载体的组合物。这些药物组合物可以合适剂量给予对 象。可通过主治医师和临床因素来确定剂量方案。如医学领域所熟知，用于任何一个患者 的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、给予的特定化合物、患者性别、 给药时间和给药途径、总体健康状况和同时给予的其他药物。本发明的组合物可局部或全 身给予。给药通常将是胃肠道外的例如静脉内；还可直接将DNA给予至目标位点，例如通过 基因枪递送到内部或外部目标位点或通过导管递送到动脉内位点。在优选的实施方式中， 药物组合物被皮下给予，且在更有效的实施方式中，静脉内给予。胃肠道外给药制剂包括无 菌的水性或非水性溶液、悬液和乳液。非水性溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄 榄油，和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或混悬液，包括盐水 和缓冲介质。胃肠道外载剂包括氯化钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格溶液 或固定油。静脉内载剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂（例如基于林格右旋糖的那 些物质）等。也可包含防腐剂和其它添加剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气 体等。此外，本发明的药物组合物可包含蛋白性运载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优 选人来源的。设想本发明的药物组合物在蛋白性双特异性单链抗体构建体或编码其的核酸 分子或载体（如上文所述）以外，还可包含生物活性试剂，这取决于该药物组合物的预定用 途。
[0155] 溶瘤病毒
[0156] 溶瘤痘苗病毒是有希望的抗癌剂，原因在于其能够感染肿瘤细胞、在肿瘤细胞中 复制并裂解肿瘤细胞，并在连续的复制轮次中扩散至其他肿瘤细胞。溶瘤痘苗病毒疗法已 在临床前模型和临床研究中显示希望。然而，溶瘤痘苗病毒的抗肿瘤效力是次优的。这很可 能是由于溶瘤痘苗病毒在肿瘤中的受限病毒传播和肿瘤内抗肿瘤T细胞应答的有限激活。 因此，本发明提供了一种溶瘤痘苗病毒，其1)促进T细胞肿瘤浸润和激活，以及2)有效地 裂解未被痘苗病毒感染的肿瘤细胞（周边杀伤）。这些方面克服了现有的溶瘤痘苗病毒的 限制。
[0157] 溶瘤病毒可利用DNA或RNA作为其遗传材料。溶瘤DNA病毒可具有二十面体 或复杂的衣壳对称性。二十面体溶瘤DNA病毒可以是裸的或包含包膜。溶瘤DNA病毒 的家族包括腺病毒科（Adenoviridae)(例如腺病毒，基因组大小为36-38kb)、疱疹病毒 科（Herpesviridae)(例如HSV1，基因组大小为 120_200kb)和痕病毒科（Poxiviridae) (例如痘苗病毒和黏液瘤病毒，基因组大小为130-280kb)溶瘤RNA病毒包括具有二十 面体或螺旋衣壳对称性的那些。二十面体溶瘤病毒是裸的且不具有包膜且包括呼肠孤 病毒科（Reoviridae)(例如呼肠孤病毒，基因组大小为22_27kb)和小核糖核酸病毒科 (Picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒，基因组大小为7. 2-8. 4kb)。螺旋溶瘤RNA病毒 是具有包膜的且包括弹状病毒科（Rhabdoviridae)(例如VSV，基因组大小为13_16kb)和副 粘病毒科（Paramyxoviridae)(例如MV和NDV，基因组大小为16_20kb)。
[0158] 这些类型的溶瘤病毒中任一种都可用于本发明。在【具体实施方式】中，可使用痘苗 病毒。
[0159] 试剂盒
[0160] 本文所述的任意组合物可包含于试剂盒中。在一个非限制实施例中，试剂盒中可 包含一种或多种病毒和/或生成或操纵该病毒的试剂。以合适的容器方式提供试剂盒组 分。
[0161] 试剂盒的一些组分可包装在水性基质中或包装成冻干形式。这些试剂盒的容器用 具通常包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器用具，组分可放置其内，并优 选经适当分装。在试剂盒中存在超过一种组分的情况中，该试剂盒通常还含有第二、第三或 其他附加容器，其内可分开放置其他组分。然而，可在小瓶中包含多种组分的各种组合。这 些试剂盒通常还包含用于以封闭约束形式来容纳这些组分以供市售的器具。此类容器可包 括注塑或吹塑的塑料容器，其中存留所需小瓶。
[0162] 当在一种和/或多种液体溶液中提供试剂盒的组分时，液体溶液是水性溶液，无 菌水性溶液是特别有用的。在一些情况中，容器用具本身可以是注射器、移液器和/或其他 这类设备，从中可将制剂施用于身体的受感染区域、注射入动物和/或甚至用于和/或与试 剂盒的其他组分混合。
[0163] 然而，试剂盒的组分可以干粉形式提供。当以干粉提供试剂和/或组分时，可通过 加入合适的溶剂来重溶粉末。设想也可以另一种容器用具提供溶剂。该试剂盒还可包含第 二容器用具用以容纳无菌的、药学上可接受的缓冲剂和/或其他稀释剂。
[0164] 在具体的实施方式中，在试剂盒中提供了用于治疗的病毒，且在一些情况下这些 病毒实质上是试剂盒的唯一组分。该试剂盒可包含对所需病毒进行改性的试剂和材料。在
【具体实施方式】中，这些试剂和材料包括表达构建体、用于扩增所需序列的引物、限制性酶、 供纳入病毒的一种或多种DNA、核苷酸、合适的缓冲液或缓冲剂、盐等，并且在一些情况中， 这些试剂包括编码本发明所述接合分子的DNA和/或载体和/或为此的调控元件。
[0165] 在【具体实施方式】中，试剂盒中存在适用于从个体提取一个或多个样品的一种或多 种设备。该设备可以是注射器、解剖刀等。
[0166] 在一些情况中，除了病毒实施方式以外，该试剂盒还包括第二癌症疗法，例如化 疗、激素疗法和/或免疫疗法。这些试剂盒可对个体的具体癌症调整并且包含该个体的相 应第二癌症疗法。
[0167] 实施例
[0168] 描述了以下实施例以更完整地说明本发明的优选实施方式。然而，其绝不构成对 本发明广泛范围的限制。
[0169] 实施例1
[0170] 作为新型癌症疗法的带T细胞接合物臂的溶瘤病毒（TEA-0V)
[0171] 本发明的至少某些实施方式的重要性在于研发了一种改进的溶瘤痘苗病毒，其具 有诱导周边杀伤未感染痘苗病毒的肿瘤细胞的独特能力，导致增强的抗肿瘤作用。本发明 建立的原理是使溶瘤痘苗病毒带T细胞接合物臂以作为新型溶瘤痘苗病毒疗法，从而为研 发有效的溶瘤病毒疗法打开了一条新路。本发明的多个实施方式的溶瘤痘苗病毒代表首例 通过整合T细胞接合物来增强溶瘤痘苗病毒。该新策略适用于改进多种形式的溶瘤病毒的 效力，例如溶瘤腺病毒（AdV)、单纯疱疹病毒（HSV)、呼肠孤病毒、黏液瘤病毒（MYXV)、脊髓 灰质炎病毒、水泡性口炎病毒（VSV)、麻疹病毒（MV)和新城疫病毒（NDV)。
[0172] 重要的是，本发明的实施方式提供了一种治疗组合物，其可用于治疗晚期实体瘤。 以下实施例评估了人肿瘤异种移植模型中新型溶瘤痘苗病毒的效力。这些TEA-VV实施方 式可用于治疗至少晚期实体瘤，包括例如使用现有治疗策略难以治愈的那些肿瘤。
[0173] 在【具体实施方式】中，TEA-0V技术具有高度创新性，因为其测试了接有T细胞接 合物CD3-SCFv臂的溶瘤痘苗病毒是否能够导致增强的抗肿瘤作用。在【具体实施方式】中， TEA-0V通过一种或两种机制发挥其抗肿瘤活性：i)双特异性scFv引导T细胞识别并杀伤 未被痘苗病毒感染的肿瘤细胞（周边杀伤），导致增强的肿瘤裂解，以及ii)CD3-SCFv激活 肿瘤内的T细胞，其激活后释放的细胞因子建立了促炎性微环境，抑制肿瘤生长。
[0174] 实施例2
[0175] 用于晚期实体瘤的带T细胞接合物臂的溶瘤痘苗病毒（TEA-VV)的研发
[0176] 越来越多的证据表明，T细胞能够控制癌症患者中的肿瘤生长和存活，在疾 病早期和晚期阶段都是如此。例如，已证明T细胞的过继转移能够有效治疗播散肿瘤 (disseminatedtumor)，包括霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌、成神经细胞瘤和黑素瘤。然而，肿瘤特 异性T细胞应答难以在癌症患者中建立并维持且受限于免疫编辑期间选择的肿瘤细胞的 多种免疫逃逸机制。因此，需要开发一种替代性策略以使得用于癌症治疗的T细胞能够克 服肿瘤的免疫逃逸机制。本发明提供了这类策略。
[0177] 使溶瘤痘苗病毒带T细胞接合物CD3-scFV臂是一种使T细胞参与癌症治疗的有 用方式。CD3-scFV已被用于双特异性T细胞接合物（BiTE)，其由特异性针对肿瘤表面抗原 的scFv和⑶3-scFv构成。临床研究已表明，BiTE疗法在非霍奇金淋巴瘤和B细胞前体急 性淋巴细胞性白血病患者中导致肿瘤细胞的高度有效杀伤。在本发明中，存在一种带T细 胞接合物⑶3-scFv臂的溶瘤痘苗病毒（TEA-VV)。TEA-VV编码的双特异性scFv将引导T 细胞识别并杀伤未被痘苗病毒感染的肿瘤细胞（周边杀伤），导致增强的肿瘤裂解。此外， CD3-SCFv将促进T细胞浸润至肿瘤及其激活，并且其激活后释放的细胞因子将建立促炎性 微环境，抑制肿瘤生长。重要的是，CD3-SCFv能够将患者中的大量现有T细胞克隆重定向 至肿瘤细胞，从而克服肿瘤的许多免疫逃逸机制。此外，溶瘤病毒诱导T细胞接合物的局部 产生，其可使靶标处产生较高浓度同时降低全身性副作用。因此，使溶瘤痘苗病毒带双特异 性scFv臂提供了使T细胞参与癌症治疗的替代性方法并通过诱导周边杀伤使现有痘苗病 毒疗法产生所需的抗肿瘤活性提高（图1)。
[0178] 已研发了带CD3-SCFv臂的痘苗病毒作为针对晚期实体瘤的有效病毒疗法。在 本发明的【具体实施方式】中，表达双特异性scFv结合CD3和肿瘤细胞抗原的溶瘤痘苗病 毒，将促进T细胞浸润至肿瘤和周边杀伤未被痘苗病毒感染的肿瘤细胞，导致增强的抗肿 瘤活性。在这些研究中，生成了以分泌性双特异性scFv形式表达的人⑶3-scFv，其结合 CD3和肿瘤细胞抗原EphA2(EphA2-TEA-VV)(图2)。表达分泌性EphA2-CD3-scFv的人肺 癌细胞系A549诱导未被病毒感染的EphA2阳性A549的杀伤，表明诱导周边肿瘤杀伤（图 10)。在一个示例性实施方式中（图2)，EphA2-TEA-VV包含的一个分子含有调控双特异性 EphA2-scFv-CD3-scFv的F17R启动子和调控标记物（如DsRed)的Psel启动子；各组件的 替代性配置也是适用的。
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