或由其组成，如下文所公开的那样。
[0105] 因此，可通过本领域已知的方法和本发明公开和描述的方法通过实验测定特异 性。这类方法包括但不限于：Western印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA、EIA测试和肽扫描。
[0106] 术语"抗体片段或其衍生物"涉及单链抗体或其片段、合成的抗体、抗体片段，如 驼科动物Ig、IgNAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab) ' 2片段、F(ab) ' 3片段、Fv、单链Fv抗体 ("scFv"）、双-scFv、（scFv)2、小抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定化的Fv蛋白 质（"dsFv"）和单结构域抗体（sdAb，纳米抗体）等，或上述任一种的化学修饰的衍生物。 本发明所用抗体或其相应免疫球蛋白链还可使用本领域已知的常规技术进行进一步修饰， 例如通过使用氨基酸删除、插入、取代、添加和/或重组和/或本领域已知的任何其他修饰 (例如翻译后和化学修饰，如糖基化和磷酸化），这些技术可单独使用或联用。在编码免疫 球蛋白链的氨基酸序列的DNA序列中导入这类修饰的方法是本领域技术人员熟知的，例如 参见Sambrook等（1989)。
[0107] 术语"抗体片段或其衍生物"具体涉及包含至少一个⑶R的（多）肽构建体。
[0108] 所述抗体分子的片段或衍生物定义了以下（多）肽，其是上述抗体分子的一部分 和/或经化学/生物化学或分子生物学方法修饰。相应方法是本领域已知的且描述于（但 不限于）实验室手册中（参见Sambrook等；MolecularCloning:ALaboratoryManual(《分 子克隆：实验室手册》）；冷泉港实验室出版社，第2版1989和第3版2001 ;Gerhardt等； MethodsforGeneralandMolecularBacteriology(《一般和分子细菌学方法》）；ASM出 版社，1994;Lefkovits;ImmunologyMethodsManual:TheComprehensiveSourcebookof Techniques(《免疫学方法手册：综合性技术资料大全》）；学术出版社（AcademicPress)， 1997;Golemis;Protein-ProteinInteractions:AMolecularCloningManual(《蛋白 质-蛋白质相互作用：分子克隆手册》）；冷泉港实验室出版社，2002)。
[0109] 本发明所述双特异性单链构建体中包含的可变结构域可由额外的接头序列 连接。术语"肽接头"在本发明中定义了一种氨基酸序列，其将所定义的构建体的第 一结构域和第二结构域的氨基酸序列彼此连接在一起。这类肽接头的主要技术特征 是所述接头不包含任何多聚化活性。肽接头的特征，包括不促进二级结构，是本领域 已知的且参见例如Dali'Acqua等（Biochem. (1998) 37, 9266-9273)、Cheadle等（Mol Immunol(1992) 29, 21-30)以及Raag和Whitlow(FASEB(1995) 9(1)，73-80)。所设想的氨基 酸少于5个的肽接头可包含4、3、2或1个氨基酸。在"肽接头"中，特别优选的"单个"氨基 酸是Gly。因此，该肽接头可由单个氨基酸Gly组成。此外，优选也不促进任何二级结构的肽 接头。可通过例如遗传工程改造来提供结构域彼此之间的连接。用于制备融合和操作性连 接的双特异性单链构建体和在哺乳动物细胞或细菌中表达这些构建体的方法是本领域熟 知的（例如W0 99/54440，Ausubel，CurrentProtocolsinMolecularBiology(《新编分 子生物学实验指南》），格林出版联合公司和韦利出版公司（GreenPublishingAssociates andWileyInterscience)，纽约，1989 和 1994 或Sambrook等，MolecularCloning:A LaboratoryManual(《分子克隆：实验室手册》），冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，2001)。 [0110] 上文和下文所述双特异性单链抗体构建体可以是人源化或去免疫化抗体构建体。 (多）肽且特别是抗体构建体的人源化和/或去免疫化的方法是本领域技术人员已知的。
[0111] 在本发明的药物组合物的一个实施方式中，人CD3特异性结构域的VH和I区衍 生自CD3 特异性抗体，其选自X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12. 5、 F111-409、CLB-T3. 4. 2、TR-66、WT32、SPv-T3b、llD8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/ RW2-8C8、T3/RW2-4B6、0KT3D、M-T301、SMC2、WT31 和F101. 01。这些CD3 特异性抗体是本领 域熟知的且描述于（但不限于）Tunnacliffe(1989)，Int.Immunol. 1，546-550。在具体实施 方式中，VH和V^区衍生自能够特异性识别人⑶3-ε链或人⑶3-ζ链的抗体/抗体衍生物 等。
[0112] 本发明还涵盖一种组合物，其包含编码上文所定义的双特异性单链抗体的溶瘤病 毒核酸序列和携带这些核酸序列的细胞。在具体方面中，该溶瘤病毒核酸分子是重组核酸 分子且可以是合成的。
[0113] 在另一个方面中，本发明提供了编码接合分子（例如本发明所述接合分子中任一 种）的病毒多核苷酸。在【具体实施方式】中，该病毒多核苷酸允许在含有该病毒的细胞中诱 导型表达接合分子。在本发明提供的实施方式的任一种中，该病毒优选以可由细胞分泌的 形式来编码所述接合物。该多核苷酸编码包含激活结构域和抗原识别结构域的融合分子， 且在【具体实施方式】中各结构域是 scFv。该激活结构域的可相对抗原识别结构域位于多肽的 N端，或该激活结构域的可相对抗原识别结构域位于多肽的C端。
[0114] 本领域技术人员显见，可向本发明的组合物中包含的溶瘤病毒核酸分子中添 加调控序列。例如，可以使用允许本发明的多核苷酸进行诱导表达的启动子、转录增 强子和/或序列。合适的可诱导系统是例如四环素调控的基因表达，参见例如Gossen 和Bujard(Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992),5547-5551)以及Gossen等（Trends Biotech. 12 (1994)，58-62)，或地塞米松诱导型基因表达系统，参见例如Crook(1989)EMB0 J. 8, 513-519。
[0115] 此外，出于其他目的，设想溶瘤病毒核酸分子可含有例如硫酯键和/或核苷酸类 似物。这些修饰可用于针对细胞中的核酸内切酶和/或外切酶稳定化核酸分子。这些核酸 分子可由适当的溶瘤载体转录，其包含允许细胞中核酸分子转录的嵌合基因。在这一方面， 还应理解，这类多核苷酸可用于"基因靶向"或"基因治疗"方法。在另一个实施方式中，这 些核酸分子是带标记的。检测核酸的方法是本领域熟知的，例如Southern和Northern印 迹、PCR或引物延伸。该实施方式可用于筛选方法以验证是否成功导入上文所述核酸分子， 例如在基因治疗方法期间。
[0116] 这些溶瘤病毒核酸分子可以是包含任意前述核酸分子（单独或组合）的重组产生 的嵌合核酸分子。在具体方面中，这些核酸分子是载体的一部分。
[0117] 本发明因此还涉及包含溶瘤病毒载体的组合物，所述载体包含本发明所述的核酸 分子。
[0118] 在【具体实施方式】中，存在包含特定核酸序列的溶瘤病毒载体，所述核酸序列是调 节性序列，其可操作地连接编码本发明所定义的双特异性单链抗体构建体的核酸序列。这 类调节性序列（控制序列）是本领域技术人员已知的且可包括启动子、拼接盒（splice cassette)、翻译起始密码子、用于将插入片段导入载体的翻译和插入位点。在具体实施方 式中，该核酸分子操作性连接所述表达控制序列，从而在真核或原核细胞中表达。
[0119] 设想溶瘤病毒载体是一种包含特定核酸序列的溶瘤病毒载体，所述核酸序列编码 本发明所定义的双特异性单链抗体构建体。在具体方面中，该溶瘤病毒载体是痘苗病毒载 体。该痘苗病毒可以是惠氏或西部保留地（WR)毒株。该痘苗病毒可在其基因组中具有缺失 或在一个或多个基因中具有突变。可删除痘苗病毒的胸苷激酶基因。该痘苗病毒可在编码 痘苗病毒生长因子的基因中具有突变。在具体方面中，该溶瘤病毒载体是慢病毒载体。慢 病毒载体是市售可得的，包括来自例如克隆泰克公司（Clontech)(加利福尼亚州山景城） 或复能基因公司（GeneCopoeia)(马里兰州罗克维尔）。
[0120] 术语"调节性序列"指实现所连接编码序列的表达所必需的DNA序列。这类控制 序列的本质根据宿主生物体而不同。在原核生物中，控制序列通常包括启动子、核糖体结合 位点和终止子。在真核生物中，通常控制序列包括启动子、终止子且在一些情况下包括增强 子、反式激活因子或转录因子。术语"控制序列"旨在包括至少以下所有组分：其存在是表 达所必需的，且还可包括其他有利的组分。
[0121] 术语"可操作地连接"表示并置位置，其中如此描述的多个组分的关系允许其以所 需方式发挥功能。"可操作地连接"至编码序列的控制序列的连接方式是使控制序列相容的 条件下能实现编码序列表达的方式连接。在控制序列是启动子的情况下，优选使用双链核 酸对本领域技术人员而言是显而易见的。
[0122] 因此，在某些实施方式中，所述载体是一种溶瘤病毒表达载体。"表达载体"是一种 构建体，其可用于转化所选宿主并提供所选宿主中编码基因的表达。表达载体可例如是克 隆载体，二元载体或整合载体。表达包括核酸分子的转录，优选转录为可翻译的mRNA。确保 真核细胞中表达的调控元件是本领域技术人员熟知的。在真核细胞的情况下，其通常包括 确保转录起始的启动子且任选地包括确保转录终止和转录本稳定化的聚A信号。允许真核 宿主细胞中表达的调控元件的示例是酵母中的A0X1或GAL1启动子或哺乳动物和其他动物 细胞中的CMV、SV40、RSV启动子（劳氏肉瘤病毒）、CMV增强子、SV40增强子或球蛋白内含 子。
[0123] 除负责转录起始的元件外，这类调控元件还可包含转录终止信号，如SV40聚A位 点或tk聚A位点，其在多核苷酸的下游。此外，根据所用的表达系统，能够引导多肽至细 胞隔室或将其分泌至介质中的前导序列可添加至所述核酸序列的编码序列中并且是本领 域熟知的。这些前导序列与翻译、起始和终止序列以适当方式组装，且优选能够引导所翻 译蛋白质或其部分分泌至周质空间或胞外介质的前导序列。任选地，异源序列可编码包含 N端鉴定肽的融合蛋白，所述N端鉴定肽具有所需特性，例如使所表达的重组蛋白稳定化 或简化其纯化；参见同上。本文中，合适的表达载体是本领域已知的，例如〇kayama-Berg cDNA表达载体pcDVl(法玛西亚公司（Pharmacia))、pEF-Neo、pCDM8、pRc/CMV、pcDNAl、 pcDNA3 (英杰公司（Invitrogen))、pEF-DHFR和pEF-ADA(Raum等，CancerImmunol Immunother(2001)50(3), 141-150)或pSP0RTl(GIBC0BRL公司）。
[0124] 在一些实施方式中，这些表达控制序列是载体中的真核启动子系统，能够转化或 转染真核宿主细胞，但也可使用用于原核宿主的控制序列。一旦载体整合到合适宿主中，宿 主就维持在适于核苷酸序列的高水平表达的条件下，并根据需要可随后收集和纯化本发明 的多肽。
[0125] 其他调控元件可包括转录以及翻译增强子。有利地，上述本发明的载体包含可 选择和/或可评分的标志物。用于选择转化的细胞的可选择标志物基因是本领域技术人 员熟知的且包括例如作为选择dhfr的基础的抗代谢物抗性，其赋予对氨甲蝶呤的抗性 (Reiss,PlantPhysiol. (Life-Sci.Adv. ) 13(1994) ,143-149) ;npt，其赋予对氨基糖戒类 新霉素、卡那霉素和巴龙霉素的抗性（Herrera-Estrella，EMB0J. 2(1983),987-995)以 及hygro,其赋予对潮霉素的抗性（Marsh,Gene32 (1984) ,481-485)。已描述了其他可选 择基因，即trpB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，其允许细胞利用组氨醇代替组氨 酸（Hartman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85 (1988)，8047);甘露糖-6-磷酸异构酶，其允许 细胞利用甘露糖（WO94/20627)和ODC(鸟氨酸脱羧酶），其赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂， 2-(二氣甲基）-DL-鸟氨酸，DFM0 的抗性（McConlogue，1987,刊于CurrentCommunications inMolecularBiology(《分子生物学的当前通信》），冷泉港实验室编）或来自土曲霉 (Aspergillusterreus)的脱氨酶，其赋予对杀稻痕菌素-S的抗性（^31111^^，13;[08(3；[· Biotechnol.Biochem. 59(1995), 2336-2338)0
[0126] 有用的可评分标志物也是本领域技术人员已知的，可以商购。有利地，所述标记 物是编码以下物质的基因：萤光素酶（Giacomin，Pl.Sci. 116(1996),59-72 ;Scikantha，J. Bact. 178 (1996) ,121)、绿色荧光蛋白（Gerdes，FEBSLett. 389 (1996) ,44-47)或β-葡糖 醛酸糖苷酶（Jefferson,ΕΜΒ0J. 6 (1987)，3901-3907)。对于简单和快速地筛选含有所述载 体的细胞、组织和生物体而言，该实施方式是特别有用的。
[0127] 如上文所述，所述溶瘤病毒载体核酸分子可单独用于癌症治疗。含有编码上述任 意双特异性单链抗体构建体的DNA序列的载体可递送至对象，继而产生感兴趣的多肽。
[0128] 根据上文，本发明涉及衍生遗传工程改造中常规使用的溶瘤病毒载体的方法，其 包含编码本发明所定义的双特异性单链抗体构建体的多肽序列的核酸分子。优选地，该溶 瘤载体是表达载体和/或基因转移或靶向载体。可使用本领域技术人员熟知的方法来构建 重组载体；参见例如Sambrook等（在上述引文中）、Ausubel(1989,在上述引文中）或其他 标准教科书中描述的技术。含有本发明的核酸分子的溶瘤病毒载体可通过熟知的方法转移 至宿主细胞中，所述方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，磷酸钙处理或电穿孔可用于细 胞宿主；参见Sambrook，同上。
[0129] 还设想，本发明的药物组合物包含经上文所定义的溶瘤病毒载体转化或转染的宿 主。该宿主可通过将至少一种上述载体或至少一种上述核酸分子导入宿主中来生成。在宿 主中存在至少一种载体或至少一种核酸分子可介导编码上述双特异性单链抗体构建体的 基因的表达。
[0130] 导入宿主的所述核酸分子或载体可整合到宿主的基因组中或者其可以保持在染 色体外。
[0131] 宿主可以是任何真核细胞或原核细胞。特别设想所述宿主可以是哺乳动物细胞。 特别优选的宿主细胞包括cv-l、BS-C-1、HUTK-143B、BHK-21、CEF、CH0细胞、C0S细胞、黑素 瘤细胞系如SP2/0或NS/0细胞。
[0132] 本发明的药物组合物还可包含一种蛋白性化合物，其能够提供用于细胞增殖或细 胞刺激的免疫效应细胞的激活信号。该蛋白性化合物不应理解为上述双特异性单链抗体构 建体的额外结构域，而是本发明的药物组合物的至少一种附加组分。
[0133] 基于本发明，向免疫效应细胞提供激活信号的"蛋白性化合物"可以是例如针对T 细胞的其他激活信号（例如其他共刺激分子：B7家族的分子、0x40L、4. 1BBL)或其他细胞因 子：白介素（如IL-2)或NKG-2D接合化合物。优选的蛋白性化合物形式包括其他双特异性 抗体或其片段或衍生物，例如双特异性scFv。蛋白性化合物可包括但不限于特异性针对T 细胞受体或超抗原的scFv片段。超抗原以MHC不依赖的方式直接结合某些T细胞受体可 变区亚家族，从而介导原发性T细胞激活信号。该蛋白性化合物还可提供非T细胞的免疫 效应细胞的激活信号。非T细胞的免疫效应细胞的示例包括但不限于NK细胞。
[0134] 本发明的一个实施方式涉及一种生产本发明的组合物的方法，该方法包括在允许 构建体表达的条件下培养上文所述宿主并从培养物中回收生成的双特异性单链抗体构建 体。
[0135] 本发明的一个实施方式涉及应用上文所定义的双特异性单链抗体构建体、上文所 定义的核酸序列、上文所定义的载体、上文所定义和/或由上文所定义的方法产生的宿主， 其所述应用是用于制备本发明的药物组合物、治疗或缓解癌性疾病（如肿瘤性疾病）。具体 而言，本发明的药物组合物特别可用于预防、缓解和/或治疗癌症，包括例如具有实体瘤的