007Jul1 ; 13 (13) : 3989-98)。简言之，肿瘤被切成3x3x3mm3片段并在小鼠的胁上皮 下接种（Balb/c裸鼠，6-8 周龄，雌性，BeijingHFKBioscienceCo.Ltd·,Beijing,China)。 每周两次对肿瘤的生长进行监测。建立的来自这些患者样品的肿瘤模型被称为〇代或P〇， 当肿瘤大小达到500-700mm3时（1/2长X宽2)对其进行系列的重新植入，称为Pl、2、3… (<1〇)代，并实施研究（药理学、组织病理学、免疫组织化学、细胞学和分子学的分析）。患 者样品的获取和使用通过北京肿瘤医院伦理委员会许可和患者的知情同意。所有的过程都 在无菌条件下实施。所有参与本研究的实验动物都严格按照美国国立卫生研究院的实验动 物的护理和使用指南的建议进行操作。
[0074] 在PDX模型中肿瘤对西妥昔单抗应答的评估。当肿瘤体积达到100-150mm3时，小 鼠被随机分组至具有相似平均肿瘤体积的两组，每组5只。第一组在分组后立刻用媒介对 照进行治疗（PBS，每周IP注射，持续两周），而第二组用西妥昔单抗（每周IP注射，持续两 周，lmg/小鼠，由BMS馈赠）。每周两次对肿瘤生长进行监测，并对％ΔΤ/AC值进行计算 用于评价肿瘤对西妥昔单抗的应答（AT=治疗组中肿瘤体积的变化且AC=对照组中肿 瘤体积的变化）。
[0075] 模型肿瘤的突变分析。实施了致癌基因热点分析以在肿瘤中鉴定突变。简言之，从 组织中使用DNeasy迷你试剂盒（QIAGEN，Valencia，CA)按照产品说明书提取基因组DNA。将 所有DNA样品在50μL的反应中进行PCR扩增。所有详细的引物信息都描述于增补信息中。 在50μL反应混合物中实施了 40个循环的聚合酶链式反应，该混合物包含：100ng基因组 DNA，5μ L10XPCR缓冲液，0· 2μ Μ每种引物，0· 2mM4XdNTPs和 1μ LTaqE。将扩增的PCR 产物进行凝胶纯化并通过Sanger自动测序仪（ABI)测序。用BioEdit软件分析数据。对于 EGFR基因热点分析，所述引物为：EGFR-外显子 19-F:5-GTGCATCGCTGGTAACATCCA-3(SEQID N0:1) ;EGFR-外显子 19-R:5-GGAGATGAGCAGGGTCTAGAGCA-3(SEQIDN0:2) ;EGFR-外显子 20-F:5-CGCATTCATGCGTCTTCACC-3(SEQIDN0:3) ;EGFR-外显子 20-R:5-CTATCCCAGGAGCGC AGACC-3(SEQIDN0:4) ;EGFR-外显子 21-F:5-TGGCATGAACATGACCCTGAA-3(SEQIDN0:5); EGFR-外显子 21-R: 5-CAGCCTGGTCCCTGGTGTC-3(SEQIDNO: 6)。对于KRAS热点分析，所述 引物为：KRAS-外显子2-F:5-TTATGTGTGACATGTTCTAAT-3(SEQIDN0:7) ;KRAS-外显子2-R: 5-AGAATGGTCCTGCACCAGTAA-3(SEQIDN0:8) ;KRAS-外显子3-F:5-TCAAGTCCTTTGCCCATTTT- 3(SEQIDN0:9) ;KRAS-外显子3-R:5-TGCATGGCATTAGCAAAGAC-3(SEQIDN0:10) ;KRAS-外 显子 4-F: 5-TTGTGGACAGGTTTTGAAAGA-3(SEQIDNO: 11) ;KRAS-外显子 4-R: 5-AGAAGCAATG CCCTCTCAAG-3(SEQIDN0:12)。PI3K-外显子1，F:5'-CTCCACGACCATCATCAGG-3'（SEQID N0:13)R:5'-GATTACGAAGGTATTGGTTTAGACAG-3'（SEQIDN0:14)。PI3K-外显子 9，F:5'-GA TTGGTTCTTTCCTGTCTCTG-3'（SEQIDN0:15)，R:5'-CCACAAATATCAATTTACAACCATTG-3'（SEQ IDN0:16)，PI3K-外显子 20:F:5' -TGGGGTAAAGGGAATCAAAAG-3'（SEQIDN0:17)，R:5'-CC TATGCAATCGGTCTTTGC-3'（SEQIDN0:18)。c-MET-外显子 14，F:5'-TGGGCACTGGGTCAAAGTC TC-3'（SEQIDN0:19)，R:5'AACAATGTCACAACCCACTGAGGTA-3'（SEQIDN0:20)。c-MET-外 显子 16，F: 5 ' -ATTAAATGTTACGCAGTGCTAAC-3'（SEQIDNO: 21)，R: 5 '-GGTTGCAAACCACAAAAG TAT-3'（SEQIDN0:22)。c-MET-外显子 17，F:5'-GTATTCACTGTTCCATAATGAAGT-3'（SEQID N0:23)，R:5'GATGGCTGGCTTACAGCTAGTT-3'（SEQIDN0:24)·c-MET-外显子18，F:5'-AAC AGTAGATGCTTAGTTTATGCT-3'（SEQIDN0:25)R:5'-AACAGATTCCTCCTTGTCACTT-3'（SEQID NO:26).c-MET-外显子 19，F:5'-TTCTATTTCAGCCACGGGTAAT-3'（SEQIDNO:27)，R:5'-AT GAAAGTAAAAGAGGAGAAACTC-3'（SEQIDNO:28).c-MET-外显子21，F:5'-CACCCTAAAGCCGAAAT GCG-3'（SEQIDNO:29)，R:5'-CAAGGAGCAAAGAATATCGATGGC-3'（SEQIDN0:30).AKT-外显 子3，F:5'-ACATCTGTCCTGGCACAC-3'（SEQIDNO:31)，R:5'-GCCAGTGCTTGTTGCTTG-3'（SEQ IDNO:32).BRAF-外显子 15，F:5'-CTCTTCATAATGCTTGCTC-3'（SEQIDNO:33)， R:5'-GTGAATACTGGGAACTATG-3'（SEQID勵：34)』服-外显子2，卩：5'-厶(：1'7^0^八(^ TGCCTTCT-3'（SEQIDNO:35)，R:5' -TCACAACAAACCATCCCT-3'（SEQIDNO:36).ERK-外显 子 8，F:5 '-TGCCTTACCCATAAC-3'（SEQIDNO:37)，R:5 '-GGACCTTGAGGAACATAAT-3'（SEQID NO:38)。
[0076] 肿瘤载片的pERK-IHC和pEGFR-IHC染色。在本研究中使用了标准免疫组织 化学步骤。简言之，按照标准组织学流程，将肿瘤组织在10%中性缓冲的福尔马林中固 定并包埋于石蜡中。脱石蜡和再水合后，在95°C于pH6.0的0.01M柠檬酸钠溶液中将 3μπι厚的组织切片预处理30分钟，随后用兔抗人pERK(CellSignaling,Boston,USA)或 pEGFR(Epitomics,Burlingame,USA)抗体染色。使用UltraVisionLPlargeVolume DetectionSystemHRPPolymer(即用型）试剂盒（LabVision,Fremont,CA)检测阳 性染色。将DAB用作发色底物，且将切片用吉尔苏木精（Gill'sHematoxylin)(Fisher Scientific,FairLawn,USA)进行反向染色。随后由三个研究者独立地以盲的方式对测试 的样本根据下列标准计分。强度计分：〇,无染色；1+，最小染色；2+，中等染色；3+，强染色。 强度最大的区域在低倍镜（X100)下通过扫描肿瘤切片鉴定，且随后使用带DP71数码照相 机（Olympus,Melville,NY)的OlympusBX51显微镜系统在高倍放大（X400)下对图像进 行拍照。
[0077] CFISH分析。按照产品说明使用AbbottPathVysionEGFRDNA探针试剂盒实施 FISH(双色）步骤（Abbott,DownersGrove,IL)。光谱橙色荧光团标记的EGFR(303kb)特 异性针对染色体7pl2上的EGFR基因座，且光谱绿色荧光团标记的染色体计数探针（5. 4kb) 靶向位于染色体7的着丝粒区域的α-卫星DNA序列（CEP7;7pll. 1-qll. 1)。简言之，将 FFPE切片脱石蜡，随后用胃蛋白酶消化并杂交。将处理的载片变性并用探针杂交，随后用 15μLDAPI/抗褪色溶液反向染色并用装备有单带通滤波器的OLYMPUSBX51荧光显微镜 (OLYMPUSBX51,Japan)在ΙΟΟΟχ扫描来检测DAPI、罗丹明（7pl2)和FITC(染色体 7)。
[0078] 表达信息分析和基因拷贝数的确定。从带有肿瘤的小鼠收集新鲜的HuPrime⑧ 肿瘤组织，快速冷冻并在用于遗传和基因组分析前保存于-80°C。对于基因信息分析， 从冷冻组织中按照产品说明书用Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA)分离总RNA，并用 RNeasy迷你柱（Qiagen)进行纯化。在Bioanalyzer(Agilent)上评估RNA质量。仅将 具有高质量（RIN>8)的RNA样品按照标准步骤（GenChip?3'IVTExpressKitUser Manual，Affymetrix，P/N702646Rev.8)用于在AffymetrixHG-U219 阵列板上的表达信 息分析实验。所有样品的原始CEL数据集通过RMA算法标准化。探针集强度以Log(2)转 化值表示。对于使用AffymetrixSNP6. 0芯片的SNP/CNV实验，分离基因组DNA并按照 产品说明使用基因组DNA组织和血液分离试剂盒（Qiagen)纯化。按标准Affymetrix步 骤（Affymetrix?Genome-WideHumanSNPNsp/Sty6.OUserGuide,Affymetrix，P/N 702504,Rev4)实施DNA加工和芯片杂交。对原始CEL数据进行质量检查并过滤去除低 判读率（lowcall-rate)样品，并通过PICNIC(PredictingIntegralCopyNumbersIn Cancer,seeGreenman等，PICNIC:analgorithmtopredictabsolutealleliccopy numbervariationwithmicroarraycancerdata,Biostatistics, 11 (1):164-175, 2010) 和 / 或PennCNV方法（Wang等，PennCNV:anintegratedhiddenMarkovmodeldesigned forhigh-resolutioncopynumbervariationdetectioninwhole-genomeSNP genotypingdataGenomeResearch17:1665-1674,2007)进行基因拷贝数分析，每个参考 文献以其整体通过提述并入。对于某些样品，通过qPCR确定相对基因拷贝数。简言之，相 同的基因组DNA被用于通过基于SYBRGreen的定量PCR进行的扩增，其使用EGFR特异性 引物（EGFR-F:5-CATGGTGAGGGCTGAGGTGA-3(SEQIDN0:39) ;EGFR-R:5-CCCCACCAGACCATGA GAGG-3(SEQIDN0:40))。使用哺乳动物LINE-1反转录转座子基因作为参照。在chromo4 系统上使用OpticonMonitor3软件对q-PCR数据进行分析来生成原始数据。原始数据随 后用ΔCT相对量化方法加工。ΛCT=(靶基因的CT值）-(参照基因的CT值）。ΔCT值 随后被转化成强度值（P〇WER(ΛCT，-2))。将所有数据标准化至具有已知MET拷贝数的样 品来获得相对MET拷贝数。
[0079] 结果
[0080]ESC-SCCHuPrime?模型的大亚组对西妥昔单抗应答。通过实施临床试验样研 究对食管癌（ESC)HuPrime?模型的大组进行测试用于评估西妥昔单抗针对ESC的潜在 活性。首先，通过将从ESC患者中手术取出的肿瘤组织由皮下接种移植入免疫受损的小鼠 (Balb/c裸鼠）来建立这些模型。原始的患者诊断以及模型病理确认示于表1，且更多细节 被示于表2。建立的模型中的大多数为ESC-鳞状细胞癌（ESC-SCC)。
[0081]表1.GCHuPrime?模型组的概貌
[0082]
[0083] 表2.ESC-SCC患者诊断和病理以及模型病理的确认
[0084]
[0085]
[0086] 第二，随后每周一次以lmg/小鼠对这些模型施以西妥昔单抗治疗，持续两周，以 评估他们对西妥昔单抗的敏感性。有趣的是，该治疗结果证明了大多数ESC-SCC以高应答 率（RR)对西妥昔单抗应答：4/10或40% "完全应答"(CR，定义为ΔΤ/Δ(Χ0% ) ;6/10的 部分应答（PR，0 %〈 ％ΔΤ/ΔC〈50 % );且无非应答者（NR，50 %〈0 %ΔΤ/ΔC)。通过ΔΤ/ AC值测量的肿瘤应答的量化被总结于表1。模型的代表性抗肿瘤活性也示于图1中。 [0087] 该观察结果由于多个原因令人感到惊喜。首先，几乎没有可获得的关于ESC-SCC 对西妥昔单抗的应答的临床信息；而第二，对西妥昔单抗意外地高的RR与其他在相同治疗 条件下评估了PDX模型的癌症类