一种治疗多发性骨髓瘤的Vγ9Vδ2T细胞制剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞免疫学技术领域，具体的说是一种治疗多发性骨髓瘤的νγ9νδ2Τ 细胞制剂及其有效制备方法。
【背景技术】
[0002] 今年来，随着免疫学技术的发展，研究发现非特异性免疫细胞可以有效杀伤癌细 胞，并能够杀伤癌干细胞，防止癌细胞的复发和转移。γ ST细胞兼具先天免疫和获得性免疫 的特性，其对肿瘤细胞的特异性识别和杀伤作用，成为近些年来肿瘤免疫治疗研究的热点。 目前，以γ ST细胞为基础的过继性免疫治疗在临床上取得了很大的进展，γ δτ细胞用于肿 瘤免疫治疗主要有2中策略：1、体内诱导γ δτ细胞的激活和增殖;2、体外激活和修饰γ δτ细 胞，并直接回输的过继性免疫治疗。一系列的研究表明，过继性免疫治疗以及体内扩增V γ 9νδ2Τ细胞都是安全的治疗方法，在肿瘤中治疗能够引起客观的临床反应。
[0003] 越来越多的研究显示，γδΤ细胞主要通过多种途径发挥对肿瘤的细胞毒作用，但 也能够分泌IL-4、IL-10、TGF-fi以及抑制T细胞增殖，从而下调抗肿瘤反应。γ δΤ细胞存在 一定程度的可塑性，不同的细胞因子和γ STCR刺激，V γ9νδ2Τ细胞能够分化成不同功能的 细胞，从而发挥不同的作用。
[0004] PD-I在活化和凋亡T细胞中高表达，并能够抑制T细胞的增殖及活性，损害抗肿瘤 免疫反应。目前普遍认为，肿瘤细胞表面的ro-Li与τ细胞上的ro-i相互作用，导致肿瘤特异 性τ细胞凋亡，是ro-Li介导肿瘤免疫逃逸的主要机制。
[0005] γδΤ细胞因其在体内数量很低，其功能的多样性(包括正向和负向的抗肿瘤作用） 以及因 ro-ι介导的肿瘤免疫逃逸而导致γδτ细胞的无能限制了其在临床上的应用推广。因 此，如何提高γ ST细胞增殖能力，进一步提高γ δτ细胞的细胞毒作用和抗肿瘤作用，是目前 急需要解决的问题。
【发明内容】
[0006] 为解决现有技术的问题和缺陷，即V γ 9νδ2Τ细胞存在的下调抗肿瘤反应和ro-Ι介 导的肿瘤免疫逃逸而导致的νγ9νδ2Τ细胞无能，本发明通过优化细胞培养方案，制备更高 细胞毒作用和肿瘤杀伤能力的V γ9νδ2Τ细胞，并联合IL-12佐剂治疗多发性骨髓瘤，进一步 提高V γ 9νδ2Τ细胞分泌INF- γ的能力和细胞毒活性，发挥更强的肿瘤杀伤能力。
[0007] 本发明的目的是提供治疗多发性骨髓瘤的一种有效的γ 9νδ2Τ细胞制剂。
[0008] 上述治疗多发性骨髓瘤的细胞制剂，由γ 9νδ2Τ细胞，少量⑶3+Τ细胞和⑶56+ΝΚ细 胞和IL-12佐剂，人血白蛋白以及分散介质组成。
[0009] 上述细胞制剂的中免疫细胞的来源是人外周血或人脐带血的任意一种。
[0010] 上述细胞制剂的终细胞浓度为IO9~l〇1Qcell/ml，其中γ9νδ2Τ细胞占比在70%以 上。
[0011] 上述细胞制剂的IL-12的浓度为5-15ng/ml。
[0012] 上述制剂中的人血白蛋白与分散介质的体积比在3%-10%之间。
[0013] 上述制剂中的分散介质是生理盐水。
[0014] 同时，本发明提供了一种制备上述治疗多发性骨髓瘤的细胞制剂的方法，包括以 下步骤： 步骤一、分离患者外周血单个核细胞:采集患者外周静脉血，500g，离心7分钟，吸取血 浆层，56°C灭活至少30分钟后离心备用；用生理盐水对倍稀释下层血细胞，加入含淋巴细胞 分离液的离心管中，680g，离心20分钟，吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，即得到外周血单 个核细胞PBMCs。
[0015] 步骤二、V γ9νδ2Τ细胞刺激及扩增培养：将单个核细胞PBMCs接种于细胞培养基 中，初始培养的PBMCs的密度为1-2 X IO6ceIVml，培养基中刺激剂Mtb-Hag的浓度为5-10ug/ml，细胞因子rhIL-2的浓度为500-1500IU/ml，rhIL-12的浓度为5-20ng/ml，PD-1 抗体 的浓度为〇. 5-10ug/ml。每2天根据细胞生长情况补充新鲜扩增培养基，RPMI1640扩增培养 基中含有 l〇ng/ml 的浊11^-12,0.5-10呢/1111的130-1抗体以及500-150011]/1111的11^-2，并控制 补液后细胞的密度在1-2 X IO6CelVml。
[0016] 步骤三、对培养到第11或12天的Vy 9νδ2Τ细胞进行细胞数量、活率、无菌、内毒素、 抗酸、免疫表型的检测：细胞计数仪计数细胞密度，台盼蓝染色计数细胞活率，梅里埃全自 动微生物检测系统检测细菌和真菌，肺炎支原体检测试剂盒检测肺炎支原体，鲎试剂检测 内毒素，抗酸染色试剂盒检测抗酸杆菌，流式细胞仪检测细胞表型(抗CD3-PerCP JATCRy δ-ΡΕ、抗νδ2 TCR-FITC)。
[0017] 步骤四、第13或14天收集νγ9νδ2Τ细胞，并加入IL-12佐剂，即可得到νγ9νδ2Τ细 胞制剂:500g，离心7分钟收集细胞，用生理盐水洗涤细胞2次，用100mL生理盐水重悬细胞， 加入人血白蛋白，加入IL-12佐剂，充分混匀，即得到V γ 9νδ2Τ细胞制剂。所述的细胞数量在 IO9-IO1t3Cell，加入的人血白蛋白占生理盐水的体积比为3%-10%，加入的IL-12的浓度为5-15ng/ml〇
[0018] 与现有产品和技术相比，本发明具有以下优点： (1)本发明制备方法简单，能够快速得到数量足够，毒性高的，可适用于临床的V γ9νδ 2Τ细胞。
[0019] (2)本发明采用IL-12和PD-I抗体的处理，提高了INF-γ分泌能力，增强了细胞毒 活性和对肿瘤细胞的杀伤能力。
[0020] (3 )本发明在收集细胞前两天检测细胞密度、细胞活率、无菌、内毒素含量、抗酸染 色以及细胞表型来确定最终回输的细胞的安全和质量。
[0021 ] (4)本发明所制备的细胞制剂为细胞悬液形式，并辅助IL-12佐剂，能够提高V γ9ν S2T细胞在体内的抗肿瘤作用，静脉滴注的细胞悬液能够很快到达全身，有利于对肿瘤细胞 的杀伤和清除。
【附图说明】
[0022]附图1:从外周血分离得到的单个核细胞图片； 附图2:培养到第13天的νγ9νδ2Τ细胞图片； 附图3:培养到第11天的Vy 9νδ2Τ细胞表型检测图片； 附图4: V γ 9νδ2Τ细胞制剂细胞因子分泌图片； 附图5:νγ9νδ2Τ细胞制剂肿瘤杀伤能力分析。
[0023] 以下通过一些实例，对上述治疗多发性骨髓瘤的细胞制剂及其制备方法做进一步 的详细说明。
[0024] 实例 1 实例1是通过患者外周血分离单个核细胞PBMCs: 在无菌条件下用50ml注射器采集患者外周静脉血，用肝素钠抗凝。将抗凝的外周血转 移到50ml离心管中，500g/分钟，离心7分钟，吸取上层血浆层，56°C灭活30分钟后900g/分 钟，10分钟，上清血浆备用；用生理盐水对倍稀释下层血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血 液按照1: 2的比例加入离心管中，680g/分钟，离心20分钟，吸取白膜层，用生理盐水洗涤2 次，转速分别为500g/分钟，410g/分钟，均离心7分钟，得到外周血单个核细胞(PBMCs)。
[0025] 实例2 实例2是体外刺激并扩增培养V γ 9νδ2Τ细胞： 将分离的 PBMCs 置于含有 l-10ug/ml 的 Mtb-Hag、100-1500IU/ml 的 rhIL-2 和 1%-10% 自体 血浆的RPMI1640、GT-T551 或A頂-V中，并加入5-20ng/ml 的rhIL-12，0 · 5-10ug/ml 的ro-1 抗体，调整细胞密度为1-2 X IO6CelVml。优选的刺激剂和细胞因子的浓度分别为:5ug/ml 的Mtb-Hag、500 IU/ml的rhIL-2和5%自体血浆，优选的rhIL-12的浓度为10ng/ml，优选的 PD-I抗体的浓度为lng/ml，细胞的初始密度为1.5 X IO6CelVml，转入细胞培养板、细胞培 养瓶或细胞培养袋，于37°C、5%C02和饱和湿度的培养箱内培养，72小时后补加含有等量浓 度IL-2、PD-1抗体和rhIL-12的培养基，以后根据细胞生长状态，每2-3天补加含有等量浓度 ILUD-I抗体和rhIL-12的培养基，并维持补液后细胞的密度为1-2 X IO6CelVml。
[0026] 实例3 实例3是对培养的细胞进行质量检测 对培养到第11或12天的νγ 9νδ2Τ细胞进行细胞数量、活率、无菌、内毒素、抗酸、免疫表 型的检测:细胞计数仪计数细胞密度，台盼蓝染色计数细胞活率，梅里埃全自动微生物检测 系统检测细菌和真菌，肺炎支原体检测试剂盒检测肺炎支原体，鲎试剂检测内毒素，抗酸染 色试剂盒检测抗酸杆菌，流式细胞仪检测细胞表型（抗⑶3-PerCP、抗ΤΟ?γδ-ΡΕ4Ανδ2 TCR-FITC)。经检测，在第11或12天，细胞的数量达到3.1X109cell(n=10)，台盼蓝染色计数 细胞活率为98.4(n=10)，全自动细菌分析仪检测细菌、真菌、支原体均为阴性(n=10)，内毒 素含量< 0.5EU/ml(n=10)，抗酸杆菌检测为阴性(n=10)，细胞表型检测CD3+T细胞比例为 96 · 9%，V γ 9νδ2Τ细胞比例为79 · 4%(n=10)。
[0027] 实例4 实例4是收集获得V γ 9νδ2Τ细胞制剂 第13或14天收集νγ9νδ2Τ细胞，并加入IL-12佐剂，即可得到νγ9νδ2Τ细胞制剂:500g， 离心7分钟收集细胞，用生理盐水洗涤细胞2次，用100mL生理盐水重悬细胞，加入5ml人血白 蛋白，加入5-15ng/ml的IL-12佐剂，